鄧昌良 李泳寧 葉雅沁

摘要 ［目的］比較基于核酸適配體檢測赭曲霉毒素A（OTA）方法與酶聯(lián)免疫法。［方法］建立核酸適配體檢測OTA標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn)，并與酶聯(lián)免疫法進(jìn)行比較。［結(jié)果］核酸適配體法檢測OTA在0.05～10.00 ng/mL具有較好的線性，飼料樣品中添加OTA的回收率為92.0%～93.5%，與酶聯(lián)免疫法相比，2種方法之間具有較好的一致性。［結(jié)論］該研究建立的基于核酸適配體檢測OTA方法靈敏度高、準(zhǔn)確度好，為研究飼料中OTA的快速檢測方法奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 核酸適配體；赭曲霉毒素A；檢測；酶聯(lián)免疫法；飼料

中圖分類號 S816.17? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2023）14-0189-03

作者簡介 鄧昌良（1990—），男，福建龍巖人，助理實(shí)驗(yàn)師，從事藥物分析研究。

*通信作者，副教授，博士，從事微生態(tài)制劑研究。

赭曲霉毒素是曲霉屬和青霉屬的某些菌株產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，其中赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA） 最為常見，具有肝腎毒性、致畸、致癌、遺傳毒性和免疫毒性等毒副作用，廣泛存在于大麥、小麥、玉米、啤酒和香料等農(nóng)產(chǎn)品中［1-3］。而飼料中常見的霉菌毒素主要有黃曲霉毒素、OTA、伏馬菌素和T-2毒素等［4-6］，其中OTA是較易污染的霉菌毒素，嚴(yán)重威脅著動物和人體安全。因此，為保證飼料產(chǎn)品的安全使用，建立高效、快速、準(zhǔn)確的霉菌毒素檢測方法顯得尤為重要。

目前，檢測OTA的方法主要有液相色譜法［7］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［8］、膠體金色譜法［9］、酶聯(lián)免疫吸附法［10］和電化學(xué)傳感器法［11］等。液相色譜法是目前檢測OTA最常用的定量分析方法，靈敏度較高，但需要進(jìn)行樣品純化后進(jìn)行檢測；液質(zhì)聯(lián)用法靈敏度可達(dá)0.1 ng/mL，但其對設(shè)備要求較高；酶聯(lián)免疫吸附法則多適用于大規(guī)模樣品的檢測，但其靈敏度和特異性也有待于提高。近年來快速發(fā)展的靈敏度高和特異性強(qiáng)的核酸適配體檢測技術(shù)，成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。該研究前期已建立了基于核酸適配體的赭曲霉毒素A檢測方法［12］，在此將該方法用于飼料樣品中OTA的檢測并與酶聯(lián)免疫法進(jìn)行比較，考察該方法建立的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）為北京Solarbio公司產(chǎn)品，鏈親和素購為上海源葉生物公司產(chǎn)品，牛血清白蛋白（BSA）和OTA為美國Sigma-aldrich公司產(chǎn)品；OTA核酸適配體5′-biotin-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-Cy3-3′，結(jié)合序列5′- BHQ2-TGTCCGATGC-3′由福州尚亞公司合成。赭曲霉毒素A酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測試劑盒為美國REAGEN公司產(chǎn)品。其他試劑均為分析純。多功能酶標(biāo)儀（SpectraMax M3）為美國MD公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 核酸適配體法檢測OTA。在96孔微孔板中加入100 μL 鏈親和素 （100 μg/mL），4 ℃包被過夜?？鄹?，用PBS緩沖液清洗3次，再次扣干；用1%BSA進(jìn)行封閉2 h后，用PBS緩沖液清洗3次，扣干。加入100 μL核酸適配體（200 nmol/L），25 ℃振蕩孵育30 min，PBS緩沖液清洗3次，扣干。再加入100 μL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液或提取后的樣液，37 ℃反應(yīng)30 min，PBS緩沖液清洗3次，扣干。最后加入100 μL互補(bǔ)序列（400 nmol/L），37 ℃反應(yīng)30 min，PBS緩沖液清洗3次，扣干。采用酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為550 nm，吸收波長為570 nm［12］。OTA標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定，將OTA標(biāo)準(zhǔn)品采用甲醇進(jìn)行溶解，再用HEPES緩沖液 （pH 7.0，120 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、20 mmol/L MgCl2、20 mmol/L CaCl2）稀釋成0、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)液，標(biāo)準(zhǔn)液加至已經(jīng)加入100 μL核酸適配體按上述方法進(jìn)行加樣檢測，采用酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度與熒光強(qiáng)度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 酶聯(lián)免疫法檢測OTA。

根據(jù)赭曲霉毒素A酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測試劑盒說明書進(jìn)行檢測。加入50 μL的標(biāo)準(zhǔn)品或樣品于所設(shè)定的孔中；每孔加入50 μL一抗，振蕩混勻 1 min；37 ℃下避光溫育30 min；倒掉板孔內(nèi)液體，加入1×洗液350 μL洗板5次，最后一次洗板后將酶標(biāo)板倒置用力甩干；每孔加入100 μL二抗，振蕩混勻1 min；37 ℃下避光溫育30 min；倒掉板孔內(nèi)液體，加入1×洗液350 μL洗板5次，最后一次洗板后將酶標(biāo)板倒置用力甩干。加入100 μL 四甲基聯(lián)苯胺，混勻1 min，室溫（22.5±2.5）℃溫育15～20 min，加入50 μL終止液；酶標(biāo)儀450 nm下讀OD值。OTA標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定，用檢測試劑盒中已配好OTA標(biāo)準(zhǔn)液（0、1、3、9、27、81 ng/mL），按上述方法進(jìn)行加樣檢測，采用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度與相對吸光度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 飼料樣品處理及加標(biāo)回收率測試。從市場收飼料樣品數(shù)個，粉碎后備用。根據(jù)赭曲霉毒素A酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測試劑盒說明書，準(zhǔn)確稱取2.0 g粉碎樣品于50 mL離心管中，加10 mL 70%甲醇，振蕩5 min，室溫下4 000 r/min離心10 min；取1 mL上清，加入1 mL碳酸氫鈉溶液（0.1 mol/L），振蕩，取50 μL進(jìn)行分析。選擇未檢出OTA的飼料樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，分別向2.00 g飼料粉碎樣品中添加OTA標(biāo)準(zhǔn)品（通過液體稀釋后加入），使其樣品中含有1.0和10.0 ng/g OTA，提取后采用酶聯(lián)免疫法和核酸適配體法進(jìn)行檢測樣品中OTA含量，計算加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 OTA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將OTA標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋成不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液，分別加至已包被好的96孔微孔板中，按“1.2.1”和“1.2.2”方法反應(yīng)后，采用酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度與熒光強(qiáng)度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶聯(lián)免疫法則按說明書進(jìn)行操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和相對吸光度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出，核酸適配體法在OTA濃度0.05～10.00 ng/mL建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，其標(biāo)準(zhǔn)方程為Y = 4 543X+11 739（R2=0.986 1），最低檢測限為0.05 ng/mL；而根據(jù)酶聯(lián)免疫法檢測試劑盒說明書在1～81 ng/mL建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，其標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=-30.31X+74.86（R2=0.995 8），最低檢測限為1.00 ng/mL。

2.2 飼料樣品中OTA的檢測

從市場收集飼料樣品數(shù)個，根據(jù)OTA酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測試劑盒說明書進(jìn)行提取，選擇未檢出OTA的飼料樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，分別采用核酸適配體法和酶聯(lián)免疫法進(jìn)行測定，計算飼料樣品的OTA回收率，結(jié)果如表1所示。

從表1可以看出，在飼料樣品中添加OTA標(biāo)準(zhǔn)品，采用2種方法進(jìn)行檢測，其檢測值具有較好的一致性。在飼料樣品中OTA標(biāo)準(zhǔn)品添加量1.0 ng/g，核酸適配體法檢測的回收率為92.0%，略高于酶聯(lián)免疫法（89.0%）；在飼料樣品中添加10.0 ng/g OTA標(biāo)準(zhǔn)品，則酶聯(lián)免疫法檢測的平均回收率（95.8%）略高于核酸適配體法（93.5%）?？梢姡撗芯拷⒌暮怂徇m配體法具有較好的準(zhǔn)確度。

2.3 2種方法的比較

從表2可以看出，核酸適配體法檢測靈敏度較高，檢測限達(dá)到0.05 ng/mL，且反應(yīng)時間較短（反應(yīng)時間從加入待測樣品或標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行反應(yīng)開始計算），工作中OTA標(biāo)準(zhǔn)品的回收率為92.0%～93.5%，表明該研究建立的檢測方法具有較高的準(zhǔn)確度。而與酶聯(lián)免疫法相比，由于酶聯(lián)免疫法采用的是顯色法，其檢測限較低，僅有1.00 ng/mL，但在較高濃度樣品的檢測中具有較高的回收率。

3 結(jié)論與討論

近年來，食品、農(nóng)產(chǎn)品和飼料中的霉菌毒素污染時有報道，特別是農(nóng)產(chǎn)品和飼料產(chǎn)品，不僅影響動物生長和繁殖，并且可能隨著食物鏈進(jìn)入人體，進(jìn)而對人體健康造成一系列嚴(yán)重的安全問題，其安全性越來越受到人們重視。因此，為保障食品、農(nóng)產(chǎn)品和飼料的安全使用，建立新型的高靈敏霉菌毒素檢測方法是保障其安全的重要手段。

目前，已有大量的新型檢測技術(shù)被應(yīng)用于霉菌毒素的檢測方法，特別是近年來報道了大量能特異性結(jié)合霉菌毒素的核酸適配體［13］，也開發(fā)了基于核酸適配體檢測黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和伏馬毒素等的檢測方法［14-16］。核酸適配體是一段能與目標(biāo)物進(jìn)行特異性結(jié)合的寡核苷酸序列，由于其核酸特性，具有容易合成、反復(fù)使用和保存等的優(yōu)點(diǎn)。因此，國內(nèi)外已有報道了多種基于核酸適配體檢測OTA的技術(shù)方法［17］，如Wei 等［18］開發(fā)了一種新的基于核酸適配體檢測OTA的電化學(xué)生物傳感器，采用碳?xì)饽z和亞甲基藍(lán)（MB）作為信號放大策略，其檢測線性范圍為0.10～10.00 ng/mL，實(shí)際檢測限可達(dá)到1.0×10-4 ng/mL。Li等［19］建立了一種基于核酸適配體檢測谷物樣品中的多重真菌毒素的新型高通量光子晶體微球懸浮陣列，該檢測系統(tǒng)OTA的檢測范圍可達(dá)到0.1 pg/mL～0.1 ng/mL。曲瑤等［20］開發(fā)了基于核酸適配體檢測OTA的傳感器，其檢出限達(dá)到0.67 nmol/L。以上方法的檢測靈敏度均較高，可以對飼料和農(nóng)產(chǎn)品中的痕量霉菌毒素進(jìn)行分析檢測，但由于檢測操作和設(shè)備要求上都較高，難以在大量樣品的分析檢測中進(jìn)行應(yīng)用。

該研究建立的基于核酸適配體檢測OTA的方法，操作簡單、靈敏度高，檢測濃度為0.05～10.00 ng/mL，最低檢測限可達(dá)到0.05 ng/mL，在飼料樣品中加標(biāo)回收率高，與酶聯(lián)免疫法相比具有較好的一致性，不僅可以作為大規(guī)模樣品分析檢測的方法，同時也為建立檢測多元霉菌毒素的新型分析方法奠定基礎(chǔ)。

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