余敏 張彭俐 王金波 高俊蘭

摘要 以降香黃檀、交趾黃檀和微凹黃檀木材為研究對象，提取木材DNA并擴(kuò)增trnL和trnS-trnG序列，比較黃檀屬候選DNA條形碼序列的擴(kuò)增和測序成功率，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并評價(jià)不同DNA條形碼序列的鑒定能力。結(jié)果表明：3種黃檀屬木材葉綠體編碼基因片段trnL和葉綠體基因間隔區(qū)trnS-trnG序列的PCR擴(kuò)增成功率分別為82%和59%，PCR產(chǎn)物克隆測序成功率均為100%。候選DNA條形碼序列種間的堿基變異和插入缺失數(shù)量均高于種內(nèi)?；谌~綠體編碼基因序列trnL構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹能夠成功區(qū)分3種黃檀屬木材。

關(guān)鍵詞 黃檀屬；DNA提??；DNA條形碼；木材識別

中圖分類號 TP391.44? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2023）14-0099-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.14.024

作者簡介 余敏（1985—），男，河南信陽人，講師，從事木材DNA識別研究。*通信作者，副研究員，博士，從事木材生物形成研究。

DNA條形碼技術(shù)已被證實(shí)是一種科學(xué)有效的物種識別方法，該方法具有操作簡單，不受個體發(fā)育階段和形態(tài)特征的限制，鑒定快速準(zhǔn)確等諸多優(yōu)點(diǎn)，極大地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分類學(xué)方法的不足［ 1-2］。黃檀屬木材多具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其非法采伐和非法木材貿(mào)易情況嚴(yán)重，采用傳統(tǒng)的木材識別方法難以準(zhǔn)確識別到種［ 3-4］。為此，筆者以市場上3種常見的黃檀屬木材為研究對象，通過提取木材標(biāo)本DNA并擴(kuò)增葉綠體編碼基因片段trnL序列和葉綠體基因間隔區(qū)trnS-trnG序列，比較黃檀屬候選DNA條形碼序列的擴(kuò)增和測序成功率，并對物種間穩(wěn)定的變異位點(diǎn)進(jìn)行分析，采用NJ樹法評價(jià)2條候選DNA條形碼序列的鑒定能力，以期為黃檀屬木材候

選DNA條形碼篩選和識別提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用的試驗(yàn)材料取自安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)木材標(biāo)本館，

共選取22個試驗(yàn)樣品。其中，降香黃檀（Dalbergia odorifera T.Chen）木材樣品9個，交趾黃檀（Dalbergia cochinchinensis Pierre）木材樣品6個，微凹黃檀（Dalbergia retusa Hemsl.）木材樣品7個。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 木材DNA的提取和純化。

木材DNA提取和純化參照已發(fā)表文獻(xiàn)方法進(jìn)行操作［ 5］。

1.2.2 DNA條形碼序列的擴(kuò)增。

分別以降香黃檀、交趾黃檀和微凹黃檀木材提取純化后的DNA為模板，擴(kuò)增葉綠體編碼基因片段trnL序列和葉綠體基因間隔區(qū)trnS-trnG序列。DNA條形碼PCR擴(kuò)增引物信息和擴(kuò)增反應(yīng)體系見表1。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的膠回收純化。

針對具有非特異性擴(kuò)增的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，需對PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化處理，PCR產(chǎn)物的純化操作采用TIANgel Midi Purification Kit進(jìn)行膠回收純化。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的連接和轉(zhuǎn)化。

PCR產(chǎn)物的連接和轉(zhuǎn)化操作按照全式金pEASY-T3 Cloning Kit操作說明進(jìn)行。

1.2.5 陽性重組子的鑒定。

陽性克隆檢測采用M13通用引物擴(kuò)增克隆載體插入片段區(qū)域鑒定陽性克隆。

1.2.6 DNA條形碼序列測序。

將鑒定為陽性克隆重組子的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序［ 6］，為保證測序結(jié)果準(zhǔn)確性，每個樣品選擇5個獨(dú)立的陽性克隆重組子進(jìn)行測序。測序所用儀器為ABI PRISM3730xl DNA Analyzer，所測樣品均選用雙向測序。

1.2.7 DNA條形碼序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

采用Lasergene Suite 7軟件去除引物兩端載體序列，用BioEdit（Version7.01）編輯和校正多重比對結(jié)果。采用MEGA 7軟件對黃檀屬物種間的DNA條形碼序列進(jìn)行多重比對，對種間穩(wěn)定的變異位點(diǎn)進(jìn)行分析。采用鄰接法（neighborjoining，NJ）將Genbank數(shù)據(jù)庫中已公布的3種黃檀屬trnL和trnS-trnG序列（表2）和該研究中PCR產(chǎn)物克隆測序獲得的DNA條形碼序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹各分支的置信度用自舉檢驗(yàn)法（bootstrap text）作1 000次可信度分析［ 7-8］。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA條形碼序列的擴(kuò)增和測序

由圖1可知，葉綠體編碼基因片段trnL的PCR擴(kuò)增效率為82%，葉綠體基因間隔區(qū)trnS-trnG的PCR擴(kuò)增效率為59%。對有效擴(kuò)增的DNA條形碼序列進(jìn)行PCR產(chǎn)物克隆測序，測序成功率均為100%。PCR擴(kuò)增和測序結(jié)果表明，較短的DNA條形碼序列擴(kuò)增成功率高，片段越長，擴(kuò)增效率越低，葉綠體基因片段的擴(kuò)增成功率要高于葉綠體基因間隔片段。

2.2 DNA條形碼序列的比對和分析

通過對降香黃檀、交趾黃檀和微凹黃檀木材trnL和trnS-trnG序列進(jìn)行多重比對，結(jié)果表明，3種黃檀屬木材的2條候選DNA條形碼序列的種間堿基變異和插入缺失數(shù)量均高于種內(nèi)，trnL序列的變異來源主要來自于堿基序列的顛換，主要發(fā)生在120～275 bp位點(diǎn)上。trnS-trnG序列的變異來源主要為堿基的插入/缺失，主要發(fā)生在68～74 bp和131～135 bp位點(diǎn)上，堿基變異轉(zhuǎn)換數(shù)量大于顛換數(shù)量（表3、4）。

2.3 3種黃檀屬木材系統(tǒng)發(fā)育樹聚類分析

通過對候選DNA條形碼序列trnL和trnS-trnG進(jìn)行多重比對，所有對位排列結(jié)果中的空位或缺失數(shù)據(jù)作完全刪除處理，采用鄰接法（neighborjoining，NJ）構(gòu)建無根系統(tǒng)發(fā)育樹［ 9-10］。使用trnL序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），降香黃檀、交趾黃檀和微凹黃檀均能夠正確聚類，表現(xiàn)出明顯的單系性，各分支聚類支持率分別為98%、99%和99%，采用trnL序列可以將降香黃檀、交趾黃檀和微凹黃檀木材區(qū)分開來。使用trnS-trnG序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），僅降香黃檀能夠正確聚類，而交趾黃檀和微凹黃檀聚為一支，其識別成功率為33%。

3 討論與結(jié)論

從木材組織中提取的DNA溶解物呈暗黑色，這與木材組織死亡過程中鞣花單寧改變有關(guān)。邊材向心材組織轉(zhuǎn)變過程中，木材細(xì)胞老化并導(dǎo)致鞣花單寧逐漸氧化和聚合，使木材DNA在提取緩沖液中著色并抑制PCR擴(kuò)增反應(yīng)［ 11-12］。此外，木材在長期存放過程中，受到外界環(huán)境的影響造成氧化腐朽等，也將進(jìn)一步損害降解木材組織中的DNA［ 13］。利用木材組織提取的DNA擴(kuò)增DNA條形碼序列往往豐度較低，采用直接測序的方式往往難以得到正確結(jié)果，而采用PCR產(chǎn)物克隆測序的方法可大大提高測序的成功率。在該研究中3種黃檀屬木材葉綠體編碼基因片段trnL和葉綠體基因間隔區(qū)trnS-trnG序列的PCR擴(kuò)增效率分別為82%和59%，克隆測序成功率均為100%。候選DNA條形碼種間的堿基變異和插入缺失數(shù)量均高于種內(nèi)?；谌~綠體編碼基因序列trnL構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹能夠成功地將3種黃檀屬木材區(qū)分開來。

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