闞龍飛，孟憲踴，閆飛虎，李元果，王鐵成，徐 鈺，初 冬，王衛(wèi)東，李岳城，趙永坤，高玉偉，馮 娜，夏咸柱

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長春，130118；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院長春獸醫(yī)研究所，吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春，130122；3.國家林業(yè)和草原局生物災(zāi)害防控中心，沈陽，110034；4.寧夏回族自治區(qū)森林病蟲防治檢疫總站，銀川，750001）

小反芻獸疫（peste des petits ruminants，PPR）是由副黏病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒屬（Morbillivirus）的小反芻獸疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）引起的一種急性、高度傳染性和致死性疾?。?］；天然宿主為山羊和綿羊，此外還可能感染多種野生動(dòng)物；臨床癥狀包括發(fā)熱、眼鼻有膿性黏液分泌物、壞死性和糜爛性口腔炎、胃腸炎、腹瀉和支氣管肺炎［2］。PPRV 為單股負(fù)鏈RNA 病毒，只有1 個(gè)血清型；基因組包含6 個(gè)基因，依次為3′-N-P-M-F-H-L-5′，對應(yīng)編碼6 種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為核衣殼蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素蛋白（H）和大蛋白（L），此外P基因還編碼2 種非結(jié)構(gòu)蛋白C、V［3］。根據(jù)N或F基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析，PPRV 可分為4 個(gè)譜系（Ⅰ～Ⅳ），其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ系主要流行于非洲，Ⅳ系主要流行于亞洲，我國流行的也是譜系Ⅳ［3-4］。

2007 年7 月，我國西藏阿里地區(qū)首次報(bào)道了PPR 疫情，同年在西藏革吉、日土、札達(dá)和改則4 縣也出現(xiàn)了該疫情，并于2008 年6 月和2010 年5 月在西藏尼瑪縣和日土縣兩度暴發(fā)［5］。2013 年11 月，新疆伊犁出現(xiàn)PPR疫情，同年在新疆阿克蘇、哈密和巴音郭楞相繼出現(xiàn)PPR 疫情，并在2014 年上半年迅速蔓延至中國大部分地區(qū)，包括甘肅、內(nèi)蒙古和寧夏等22 個(gè)省、直轄市和自治區(qū)［6］。隨著小反芻獸疫強(qiáng)制免疫計(jì)劃在全國的大范圍實(shí)施，近年來我國家羊的PPR呈現(xiàn)零星散發(fā)狀態(tài)。

PPRV除了在家畜中流行以外，在野生動(dòng)物中也多次被發(fā)現(xiàn)，如2007—2008 年，西藏日土縣和革吉縣兩地相繼報(bào)道了野生巖羊（Pseudois nayaur）感染PPRV 病例［7］；2013—2016 年，新疆鄯善、博樂、烏魯木齊、巴里坤和庫車的野生北山羊（Capra ibex sibirica）、盤羊（Ovis ammon）和鵝喉羚（Gazella subgutturosa）種群中也曾出現(xiàn)過感染PPRV 病例［8］；2017—2018年，青海海北州剛察縣、新疆阿克蘇地區(qū)和甘肅省西部分別發(fā)現(xiàn)少量野生巖羊、野生北山羊和普氏原羚（Procapra przewalskii）死于PPRV 感染［9-11］；2021年1—2 月，青海省都蘭縣和西藏拉薩市兩地分別發(fā)現(xiàn)34 只和58 只野生巖羊死于PPRV 感染［12］。這些野生動(dòng)物中PPRV 的持續(xù)存在，不但威脅著包括瀕危物種在內(nèi)的多種野生動(dòng)物生命安全，還會阻礙PPR 全球根除計(jì)劃的完成。因此，除了要嚴(yán)格執(zhí)行國家制定的小反芻獸疫強(qiáng)制免疫計(jì)劃外，還應(yīng)該繼續(xù)監(jiān)測野生動(dòng)物中PPRV 的感染情況，以便及時(shí)采取有效的防控措施。

本研究對wild-bharal/China-NXYH/2021 株進(jìn)行了全基因組測定和系統(tǒng)進(jìn)化分析，旨在明確其所屬的基因譜系以及與國內(nèi)外PPRV 流行株的親緣關(guān)系。研究結(jié)果可以為野生動(dòng)物PPR流行病學(xué)特點(diǎn)和PPRV分子生物學(xué)特征提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品

2021 年1 月，寧夏巖畫發(fā)現(xiàn)1 只疑似被PPRV 感染的野生巖羊，該巖羊的脾、肺組織樣品被置于干冰泡沫箱內(nèi)運(yùn)送至中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院長春獸醫(yī)研究所。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank 公布的PPRV 基因組序列，設(shè)計(jì)13 對全基因組擴(kuò)增引物（表1），由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

表1 13對PPRV全基因組擴(kuò)增引物Tab.1 13 pairs of whole genome amplification primers for PPRV

1.2.2 病毒RNA提取和RT-PCR

將組織樣品研磨后，4 ℃、9 000g，離心5 min，吸取適量上清按病毒RNA 提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）說明書提取總RNA。配制50 μL反轉(zhuǎn)錄體系：28 μL RNA，10 μL AMV Buffer（5×），4 μL AMV 反轉(zhuǎn)錄酶，5 μL dNTP（10 mmol/mL），1 μL Random primer（N9），1 μL Oligo（dT）primer，1 μL RRI（反轉(zhuǎn)錄所用試劑均購自TaKaRa 公司）。反應(yīng)條件：30 ℃反應(yīng)10 min，使Random primer（N9）達(dá)到足夠長度；42 ℃反轉(zhuǎn)錄1 h；95 ℃反應(yīng)5 min，滅活A(yù)MV 反轉(zhuǎn)錄酶。使用13對PPRV 全基因組擴(kuò)增引物分別對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR，50 μL PCR 體系包含4 μL cDNA，25 μL 高保真酶2×Phanta Max Master Mix（Dye Plus）（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），上、下游引物各2 μL，17 μL RNase Free ddH2O。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；35個(gè)循環(huán)（95 ℃變性15 s；退火溫度見表1，退火15 s；72 ℃延伸時(shí)間=1 min/kb×（表1 中對應(yīng)片段長度/1 000）kb=0.5～3.0 min）；72 ℃終延伸5 min。

1.2.3 全基因組序列測定和拼接

PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，按照Eastep凝膠及PCR 回收試劑盒（上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司）說明書進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物送至吉林省庫美生物科技有限公司測序，參考GenBank 公布的PPRV 基因組序列，使用DNASTAR Lasergene v7.1.0的SeqMan Pro軟件拼接測序結(jié)果，最后獲得該P(yáng)PRV株全基因組序列，并將其命名為wild-bharal/China-NXYH/2021株。

1.2.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析和序列一致性分析

從GenBank 分別下載不同基因型、宿主、國家（地區(qū)）和時(shí)間的PPRV 參考株N基因和全基因組序列，隨后將序列導(dǎo)入MEGA 7.0 軟件中，各毒株按“宿主/國家（地區(qū)）/時(shí)間”格式命名（表2），使用ClustalW 方法進(jìn)行多序列比對；通過maximum likelihood法建立系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap method設(shè)為1 000次重復(fù)，Model/Method設(shè)為Kimura 2-parameter model。

表2 PPRV參考株信息Tab.2 Information on PPRV reference strains

打開DNASTAR Lasergene v7.1.0 的MegAlign軟件，使用ClustalW 方法比對wild-bharal/China-NXYH/2021 株和PPRV 參考株的核苷酸序列或氨基酸序列，比對結(jié)束后點(diǎn)擊View 菜單欄下的Sequence Distances。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

提取的總RNA 經(jīng)過RT-PCR、1%瓊脂糖凝膠電泳（圖1）和膠回收后，獲得了13 個(gè)大小符合預(yù)期的基因片段。

圖1 wild-bharal/China-NXYH/2021株P(guān)CR產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of PCR products of wild-bharal/China-NXYH/2021 strain

2.2 wild-bharal/China-NXYH/2021株全基因組序列分析

序列拼接結(jié)果顯示，該毒株的基因組全長為 15 954 nt，與GenBank 公布的2013 年以來中國和2016—2017 年蒙古大部分PPRV 株全基因組長度一致，與全基因組長度為15 948 nt的2007—2008年西藏流行株和其他國外流行株的長度不同，多出6 nt。

通過全基因組序列比對，發(fā)現(xiàn)wild-bharal/China-NXYH/2021、goat/China-XJYL/2013、sheep/China-NX/2014、Ibex/China-XJBZ/2015、goat/Mongolia/2016、Saiga-tatarica/Mongolia/2017、Goitered-gazelle/Mongolia/2017 和Procapra-przewalskii/China-GS/2018 毒 株在5 217～5 222 位插入了6 個(gè)核苷酸（TCCCTC 或TCTCCC，圖2中紅色方框內(nèi)）。

圖2 全基因組序列比對結(jié)果Fig.2 Results of whole genome sequence alignment

2.3 wild-bharal/China-NXYH/2021株與參考株一致性比較

wild-bharal/China-NXYH/2021株與參考株的全基因組一致性為86.5%～99.4%，其中與goat/Burundi/2017株一致性最低（86.5%），與goat/China-XJYL/2013株一致性最高（99.4%）；與國內(nèi)其他野生動(dòng)物PPRV株wild-bharal/China-Tibet/2008、Ibex/China-XJBZ/2015和Procapra-przewalskii/China-GS/2018 的一致性分別為96.8%、98.8%和99.0%（圖3）。

圖3 全基因組一致性分析結(jié)果Fig.3 Whole genome identity analysis results

比較wild-bharal/China-NXYH/2021 株與國內(nèi)野生動(dòng)物PPRV 株、疫苗株（Nigeria 75/1 株和Sungri/96株）的基因及蛋白一致性可知，N、P、M、F、H和L基因一致性分別為93.2%～99.0%、92.6%～99.5%、93.4%～99.1%、92.6%～99.3%、91.2%～99.2% 和93.6%～99.3%；在氨基酸水平上，M蛋白保守性最高（97.3%～100.0%），P 蛋白保守性最低（90.2%～98.8%）；wild-bharal/China-NXYH/2021 株與2 個(gè)疫苗株Nigeria 75/1 和Sungri/96 的H 蛋白一致性分別為92.6%、97.0%，與F 蛋白一致性分別為96.2%、98.5%（表3）。

表3 wild-bharal/China-NXYH/2021株與國內(nèi)野生動(dòng)物PPRV株、疫苗株的基因及蛋白一致性Tab.3 Gene and protein identity between wild-bharal/China-NXYH/2021 strain and domestic wild animal PPRV strains and vaccine strains

2.4 wild-bharal/China-NXYH/2021 株H 和F 蛋白中氨基酸的多態(tài)性

與國內(nèi)野生動(dòng)物PPRV 株以及其他PPRV 參考株相比，wild-bharal/China-NXYH/2021株H、F蛋白中存在獨(dú)特的氨基酸突變，分別為H 蛋白的R285Q、S421R和F蛋白的R/K/T3W、Q305R（表4）。

表4 wild-bharal/China-NXYH/2021株H和F蛋白中氨基酸的多態(tài)性Tab.4 Polymorphism of amino acids in H and F proteins of wild-bharal/China-NXYH/2021 strain

2.5 N基因和全基因組的系統(tǒng)進(jìn)化分析

分別以wild-bharal/China-NXYH/2021株和PPRV參考株的N基因和全基因組序列為基礎(chǔ)，建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，wild-bharal/China-NXYH/2021 株屬于基因Ⅳ系，與2013 年以來中國流行株和2016—2017 年蒙古流行株親緣關(guān)系較近，共同組成一個(gè)小的進(jìn)化分支（圖4，圖5）。

圖4 基于N基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果Fig.4 Results of phylogenetic analysis based on N gene

圖5 基于全基因組的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果Fig.5 Whole genome phylogenetic analysis results

3 討論

小反芻獸疫病毒分子遺傳特征顯示，wildbharal/China-NXYH/2021株F基因的5′UTR內(nèi)5 217～5 222 位存在6 個(gè)核苷酸（TCCCTC）插入，這使基因組全長變?yōu)?5 954 nt。這種因F基因5′UTR 內(nèi)插入6 個(gè)核苷酸而改變基因組全長的特征，普遍存在于2013 年 以來中國和蒙古的PPRV 基因組中［13］。PPRVF基因5′UTR 可以通過提高翻譯效率和mRNA 穩(wěn)定性來增強(qiáng)F基因的翻譯［14］，但此處插入 6個(gè)核苷酸對原有功能的影響目前尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。

wild-bharal/China-NXYH/2021 株與2 個(gè)疫苗株Nigeria 75/1、Sungri/96 的H 蛋白一致性分別為92.6%、97.0%，與F蛋白一致性分別為96.2%、98.5%。H 和F 蛋白是PPRV 主要的抗原蛋白，H 蛋白包含較多中和抗體表位和少數(shù)T 細(xì)胞表位，主要誘導(dǎo)中和抗體的表達(dá)，F(xiàn) 蛋白包含許多T 細(xì)胞表位，主要誘導(dǎo)特異性抗體表達(dá)［15］。有研究指出，商品化PPR 疫苗（Nigeria 75/1 株或Sungri/96 株）對4 種譜系的PPRV都可以提供完全的臨床保護(hù)［16］。我國使用的是Nigeria 75/1 株弱毒活疫苗，經(jīng)過多年堅(jiān)持對家羊小反芻獸疫進(jìn)行強(qiáng)制免疫，已經(jīng)基本控制了家羊的PPR疫情，并完成了多個(gè)免疫無疫區(qū)建設(shè)。而對于野生動(dòng)物小反芻獸疫的預(yù)防，目前尚無合適的商品化疫苗。因此，野生動(dòng)物中小反芻獸疫流行情況的及時(shí)監(jiān)測預(yù)警對PPR的防控仍然至關(guān)重要。

PPRV 的H 和F 蛋白還是決定細(xì)胞和宿主嗜性的關(guān)鍵性蛋白，H 蛋白分別與宿主免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞上的麻疹病毒受體SLAM 和nectin-4 結(jié)合，而F蛋白介導(dǎo)隨后的膜融合，以便病毒進(jìn)入細(xì)胞［13］。由H 和F 蛋白的氨基酸多態(tài)性分析可知，wild-bharal/China-NXYH/2021 株的H 和F 蛋白中存在獨(dú)特的氨基酸突變，分別為H 蛋白的R285Q、S421R 和F 蛋白的R/K/T3W、Q305R。該毒株H和F蛋白中這些氨基酸的突變可能是為了更好地適應(yīng)野生動(dòng)物宿主。更多野生動(dòng)物PPRV 株基因組數(shù)據(jù)的測定和進(jìn)一步分析，有利于評估以上突變是否具有宿主物種特異性。

近年來，PPRV 感染野生動(dòng)物事件曾被多次報(bào)道，其中2016—2017年蒙古東部PPRV感染事件后果最為嚴(yán)重，導(dǎo)致賽加羚羊（Saiga tatarica mongolica）、北山羊和鵝喉羚等野生動(dòng)物死亡總數(shù)超過5 000只，使得賽加羚羊數(shù)量減少了80%［13，17］；2007—2021 年，在我國西藏、新疆、青海和甘肅等地野生巖羊、北山羊、盤羊、鵝喉羚和普氏原羚等種群中也曾出現(xiàn)過PPRV 感染致死的報(bào)道［7-12］。這些野生動(dòng)物感染病例警示了PPRV 廣泛存在于多種野生動(dòng)物中。盡管目前國內(nèi)報(bào)道的野生動(dòng)物感染PPRV 的致死數(shù)量較少，但由于野生動(dòng)物活動(dòng)范圍較大，發(fā)病后不易被發(fā)現(xiàn)，對其他野生動(dòng)物和家養(yǎng)小反芻動(dòng)物的生命安全可能構(gòu)成潛在威脅。因此，加強(qiáng)野生動(dòng)物小反芻獸疫流行情況的監(jiān)測，全面掌握國內(nèi)野生動(dòng)物小反芻獸疫流行動(dòng)態(tài)和病毒變異情況，對小反芻獸疫的防控具有重要意義，可為PPRV 的多宿主感染和溯源研究提供參考依據(jù)。