鐘 東，寧廣南，牟禮乾*，王永妮，梁雄燕，宋運福

（1.廣西玉林市福綿鎮(zhèn)水產畜牧獸醫(yī)站，廣西 玉林 537023；2.廣西玉林市沙田鎮(zhèn)水產畜牧獸醫(yī)站，廣西 玉林 537034；3.廣西玉林市福綿區(qū)動物疫病預防控制中心，廣西 玉林 537023；4.廣西玉林市仁厚鎮(zhèn)農業(yè)農村綜合服務中心，廣西 玉林 537012；5.廣西玉林市成均鎮(zhèn)水產畜牧獸醫(yī)站，廣西 玉林 537024）

非洲豬瘟（ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）感染引起豬的一種高致病性、高死亡率、急性傳染性疾病，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將ASF 列為法定報告動物疫病，該病也是各國重點防范的一類動物疫情。2018 年8 月遼寧省沈陽市出現(xiàn)國內首例非洲豬瘟疫情，隨后蔓延至國內各地，2019 年5 月廣西玉林市博白縣發(fā)生非洲豬瘟疫情［1］。為有效阻斷ASF 疫情蔓延，廣西壯族自治區(qū)農業(yè)農村廳相繼下發(fā)文件，要求生豬定點屠宰企業(yè)（廠、場）建設非洲豬瘟PCR 檢測實驗室，并對產地生豬及生豬產品采取“點對點”調運備案管理。屠宰企業(yè)是生豬調運的終點站，對不同產地待宰生豬進行采樣檢測有著重要意義，可有效檢驗不同產地生豬養(yǎng)殖場（戶）對非洲豬瘟病毒防控是否到位，官方獸醫(yī)產地檢疫是否嚴謹?shù)?。本研究對玉林市福綿區(qū)某屠宰企業(yè)不同產地的待宰生豬采集全血樣本進行熒光PCR檢測。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 冰箱，可調移液器及吸頭，1.5 mL離心管，防護用品，高速臺式離心機，熒光PCR儀及配套反應管等。

1.2 主要試劑 非洲豬瘟病毒熒光PCR 檢測試劑盒，包含：陰性對照、陽性對照、樣品稀釋液、熒光PCR反應液。

1.3 樣品采集 非洲豬瘟病毒樣品可從豬肉、豬血管、淋巴結、脾臟等部位采集。本次檢測主要使用生豬全血作為樣本，為提高檢測效率。同一來源地的生豬最多100頭為1份混合血樣［2］，使用無菌注射器抽取200 μL 生豬全血樣本至1.5 mL無菌離心管中，待檢。

樣本采集后應及時檢測，未能及時檢測的需保存于-20 ℃冰箱中，樣本保存期間應避免交叉污染。

1.4 檢測方法

1.4.1 試劑準備 實驗前30 min 從冰箱中取出試劑盒（試劑盒保存條件為-20 ℃），待恢復至室內溫度（15～25 ℃）使試劑完全融化［3］。按照單反應體系配制方法，將試劑分裝至PCR 反應管中，擰緊反應管蓋子，其余試劑返回冰箱-20 ℃冷凍保存。

1.4.2 樣本準備 DNA 提取：為避免DNA 酶受到污染并保護操作者，進行下述操作時必須佩戴一次性手套和口罩。

（1）待檢樣品份數(shù)要求為n份，則取n個無菌的1.5 mL離心管，并對離心管編號。

（2）離心管中加入樣品稀釋液80 μL。

（3）離心管中分別加入已處理的待檢樣品20 μL，充分混勻，室溫下放置2 min。

（4）離心機設置5 000 r/min 離心1 min，取上清20 μL 即為待檢DNA 模板。提取好的DNA 模板如不能立即檢測的，建議放冰箱中-20 ℃以下保存。

1.4.3 加樣 打開裝有PCR 反應液的反應管分別向其中加入已提取的樣本模板（標記：A1、A2、A3），陽性對照（標記：C2），陰性對照（標記：C1）各2.5 μL，在記錄本上記錄加樣順序。

將所有的反應管振蕩混勻后以2 000 r/min離心10 s，隨即轉到PCR擴增步驟。

1.4.4 PCR 擴增 啟用熒光PCR 儀預熱并檢驗儀器性能。將準備好的PCR 反應管放置于熒光PCR儀樣品槽，并記錄放置順序。設置熒光PCR 儀參數(shù)進行擴增。參數(shù)設置為：50 ℃孵育2 min；95 ℃預變性2 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40 個循環(huán)；在每一循環(huán)的60 ℃時收集FAM通道采集熒光信號。

2 結果判定

詳見表1。

表1 Ct值結果判定

3 檢測結果

按上述操作流程，從2022 年3 月1 日至3 月10日開展實驗檢測，每日對生豬采集全血樣本并作熒光PCR 檢測，檢測樣本數(shù)為3 份（樣本標記：A1、A2、A3），累計采集750 頭生豬全血樣本。結果顯示：生豬全血樣本無Ct值，判定均為陰性，詳細檢測數(shù)據(jù)見表2。

表2 PCR檢測生豬全血樣本Ct值

4 結論

PCR 檢測結果表明，在當?shù)貒栏竦姆揽匾笙?，不同產地的生豬均未檢出非洲豬瘟陽性，證明非洲豬瘟疫情防控措施取得了積極效果。生豬養(yǎng)殖在產地、運輸車輛、運輸路徑、屠宰銷售等環(huán)節(jié)形成了健全的、可追溯的長效機制，最大限度地降低了非洲豬瘟疫情對經濟社會造成的不利影響。但受限于實驗室設備及人手不足等因素，檢測的樣本較為單一，僅使用了生豬全血作為PCR檢測樣本，下一步將增加生豬樣本采集部位，以進一步論證不同產地生豬養(yǎng)豬場（戶）等在貫徹落實當?shù)胤侵挢i瘟防控策略中的實際效果。