金志春 鄭 潔 夏 敏 劉 杰 孫 虹 雷亞蘭 胡興文 張 純 吳艷婷 葉朝陽 徐小芳 劉 敏 吳 璇 何 聯(lián) 姚 娟 張 倩 艾 華

(湖北省婦幼保健院,武漢,430070)

不孕癥是一種屬于全球范圍的特殊生殖健康疾病,據(jù)統(tǒng)計,近年來越來越多的家庭受不孕不育問題困擾,不孕癥患者已達全球人口的20%,而我國不孕夫婦為7%～15%[1]。目前,輔助生殖技術(shù)已經(jīng)成為治療不孕癥的重要手段,提高輔助生殖妊娠率成為亟待解決的問題。中醫(yī)藥在治療不孕癥方面有一定的優(yōu)勢。研究顯示,在體外受精-胚胎移植(In Vitro Fertilization-embryo Transfer,IVF-ET)中使用針藥結(jié)合可以提高IVF-ET的臨床妊娠率[2];中藥復方在輔助生殖技術(shù)(Assisted Reproductive Technology,ART)治療過程中,可減少促性腺激素的劑量,降低卵巢過度刺激的發(fā)生率,對胚胎形成、植入率、優(yōu)質(zhì)胚胎率以及子宮內(nèi)膜容受性、妊娠率均有顯著提高[3]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2018年12月在湖北省婦幼保健院生殖中心就診的171例患者,采用隨機數(shù)字表法分為觀察組(n=85)和對照組(n=86)。觀察組年齡最大40歲,年齡最小25歲,平均年齡(29.86±3.11)歲;不孕年限最長為8年,最短為1年,平均不孕年限(2.91±1.71)年;平均體質(zhì)量指數(shù)(Body MassIndex,BMI)(21.44±3.10)kg/m2,平均竇卵泡計數(shù)(Antral Follicle Count,AFC)為(13.39±3.92)個。對照組年齡最大39歲,年齡最小25歲,平均年齡(30.20±3.26)歲;不孕年限最長10年,最短1年,平均不孕年限(3.10±2.46)年;平均BMI為(24.49±21.78)kg/m2,AFC為(13.17±4.03)個。2組患者年齡、不孕年限、BMI、AFC比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05),具有可比性。本臨床研究經(jīng)湖北省婦幼保健院倫理委員會批準(倫理審批號:鄂婦幼倫審字第20150017號)。

1.2 診斷標準 女性無避孕,性生活至少12個月未孕者,可診斷為不孕癥[4]。

1.3 納入標準 輸卵管因素不孕;女方年齡25～40歲,男方年齡25～45歲;男女雙方無全身性疾病影響孕育者;愿意參加研究,并簽署知情同意者;男方精液檢查指標正常(精液常規(guī)檢查參照世界衛(wèi)生組織第五版標準)。

1.4 排除標準 既往有卵巢手術(shù)史或盆腔放療史者;合并子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌癥和子宮肌瘤者;男女雙方一方有較嚴重的全身性疾病者,如心、肝、腎功能不良、血液疾病、內(nèi)分泌疾病(如甲狀腺、腎上腺功能異?；蛱悄虿?、全身代謝性疾病、精神疾病、惡性腫瘤、染色體異常。

1.5 脫落與剔除標準 不符合納入標準者;不按指定要求治療,或者治療過程中接受有可能影響有效療效的治療者;治療過程中有比較嚴重的并發(fā)癥或者發(fā)生其他特殊疾病等不宜繼續(xù)此治療者;依從性差,未在規(guī)定時間復查或者復診,資料不全者;自動退出研究者。

1.6 治療方法

1.6.1 控制性超促排卵、取卵、移植及移植后處理方法 從月經(jīng)第20天開始肌內(nèi)注射注射用醋酸曲普瑞林(短效GnRH-a,達菲林,Ipsen Pharma Biotech,法國,批號:u09478)0.1 mg/d,連續(xù)14 d后啟動促排卵,從啟動日開始肌內(nèi)注射促性腺激素(Gonadotropin,Gn)(重組人促卵泡激素-Gona-F,Recombinant Hunman Follitropin Alfa,商品名為果納芬,雪蘭諾公司,批號:BA072608)150～375 IU/d,直至人絨毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotropin,hCG)注射日,在此期間根據(jù)卵泡發(fā)育情況適當調(diào)整劑量。2組均定期檢測卵泡,當至少有1個卵泡直徑≥17 mm時開始抽血檢測黃體生成素(Luteinizing Hormone,LH)、雌激素(Estrogen,E2)和孕激素(Progestogen,P)以確定hCG注射時間。當至少有1個優(yōu)勢卵泡直徑≥18 mm時肌內(nèi)注射hCG(麗珠集團麗珠制藥廠,批號:160102)10 000 IU,34～36 h后在超聲引導下經(jīng)陰道常規(guī)穿刺取卵,并收集優(yōu)勢卵泡內(nèi)卵泡液備測。常規(guī)方法進行體外受精,有可移植胚胎者取卵日后第3天行胚胎移植。胚胎移植后常規(guī)每日肌內(nèi)注射黃體酮注射液(仙居制藥公司,批號:H33020828)60 mg,移植后第14天查血人絨毛膜促性腺激素β亞單位(Human Chorionic Gonadotrophin-β,β-hCG),確定已孕者移植后第28天行陰道超聲檢查孕囊。

1.6.2 中藥治療方法 取卵日前3個月開始口服補腎益氣和血法中藥治療,每日1劑,早晚各1次,連續(xù)至移植后3個月。移植前采用補腎益氣活血方,用菟絲子15 g、補骨脂10 g、枸杞子15 g、川續(xù)斷15 g、桑寄生15 g、女貞子15 g、墨旱蓮15 g、黃芪15 g、黨參15 g、白術(shù)10 g、山藥15 g、山茱萸10 g、當歸10 g、川芎10 g、香附10 g、益母草5 g、白芍10 g、丹參15 g、熟地黃15 g、甘草10 g;臨床應用時,應根據(jù)癥狀、體征和舌象,辨證加減;若兼陰虛,潮熱盜汗、舌紅少苔、脈細數(shù),知母10 g、生地黃15 g、地骨皮15 g;若兼陽虛,怕冷肢寒,可酌加淫羊藿15 g、仙茅10 g、艾葉10 g;若兼脾虛,出現(xiàn)腹瀉,口淡無味等,可加砂仁15 g、茯苓10 g。若兼肝郁氣滯,出現(xiàn)乳房脹痛,煩躁易怒,加柴胡15 g、香附10 g、郁金15 g;若兼濕熱,舌苔黃膩,加黃柏15 g、茵陳30 g、敗醬草10 g、薏苡仁20 g;若夜寐不安,心神不寧,加遠志15 g、酸棗仁15 g、夜交藤15 g;若瘀結(jié)成塊,加三棱10 g、莪術(shù)10 g、土鱉蟲10 g;若合并慢性盆腔炎,小腹腰骶疼痛,加金剛藤30 g、天丁30 g、白花蛇舌草20 g。

月經(jīng)期方用:當歸10 g、川芎10 g、桃仁10 g、紅花10 g、三棱10 g、莪術(shù)10 g、益母草15 g、川牛膝15 g。

移植后用補腎益氣養(yǎng)血方,藥用菟絲子15 g、補骨脂10 g、枸杞子15 g、川續(xù)斷15 g、桑寄生15 g、女貞子15 g、墨旱蓮15 g、黃芪15 g、黨參15 g、白術(shù)10 g、山藥15 g、山茱萸10 g、當歸10 g、川芎10 g、白芍10 g、熟地黃15 g、甘草10 g。臨床應用時,應根據(jù)癥狀、體征和舌象,辨證加減;若腎精虧虛,加女貞子15 g、墨旱蓮15 g;若兼陰虛內(nèi)熱,加知母10 g、生地黃15 g、地骨皮15 g;若腰酸較甚,加杜仲15 g;若陰道出血,加杜仲碳15 g、地榆炭15 g、仙鶴草15 g、阿膠15 g;若大便溏薄,加砂仁15 g等。

中藥煎服法:先用清水浸泡30 min,以武火煎至湯藥沸騰,再改用文火煎30～40 min取汁,共煎煮2次,將汁藥混合濃縮200 mL左右,均分成2份,早晚溫服(飯前或飯后30 min)。移植前與移植后中藥療程各1～3個月,根據(jù)具體癥狀變化,每1～2周復診調(diào)整用藥,中藥由湖北省婦幼保健院提供。

1.7 觀察指標 臨床妊娠相關(guān)指標,包括2組受精卵、可移植胚胎、移植胚胎、著床胚胎、臨床妊娠等情況。

1.8 療效判定標準

1.8.1 血清生殖內(nèi)分泌激素與相關(guān)因子 月經(jīng)周期第3天(降調(diào)開始周期)和啟動日(降調(diào)后開始使用超促排藥首日)抽血查內(nèi)分泌激素促卵泡激素(Follicle-stimulating Hormone,FSH)、LH、E2、P、睪酮(Testosterone,T)、催乳素(Prolactin,PRL)水平,在hCG注射日抽血查LH、E2、P、T水平,采卵日(取卵前)、移植日(移植前)和移植7 d抽血查E2、P、T和胰島素樣生長因子-2(Insulin-like Growth Factor-2,IGF-2)、白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor,LIF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)水平。抽取靜脈血5 mL,離心后取上清液分裝,-70 ℃凍存待測。在移植后第14天抽血查β-hCG水平(檢測是否受孕)。相關(guān)激素檢測用電化學發(fā)光法,試劑盒由德國羅氏生產(chǎn),檢測方法均按照每種試劑盒提供的說明書操作。相關(guān)因子檢測試劑盒由武漢云克隆科技股份有限公司及伊萊瑞特生物提供,檢測方法均按照每種試劑盒提供的說明書操作。

1.8.2 卵泡液生殖內(nèi)分泌激素與相關(guān)因子在穿刺取卵時先抽取優(yōu)勢卵泡卵泡液(不需要稀釋) 檢測卵泡液中E2、P、T和IGF-2、IL-1β、IL-6、LIF、TGF-β1、VEGF、TNF-α水平。入選卵泡標準:卵泡直徑大于16 mm,1個卵泡內(nèi)含有1個卵母細胞,空卵泡除外。在取卵日收取每位研究對象檢測側(cè)卵巢卵泡內(nèi)清亮、無血染的卵泡液,放置于離心器中以3 000 r/min,離心半徑13.5 cm,離心10 min,離心后取上清液,分裝,-70 ℃凍存待測。激素與因子檢測方法相同。

1.8.3 子宮動脈血流阻力情況 在注射hCG日(即卵泡成熟前)和移植日(移植前)超聲檢查子宮動脈血流阻力。儀器采用深圳S50彩色多普勒超聲診斷儀,經(jīng)陰道檢測子宮動脈血流。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用IBM SPSS Statistics 19統(tǒng)計軟件和PEMS 3.2(Ridit分析用)進行數(shù)據(jù)分析。2組同期比較,計量資料采用t檢驗,計數(shù)資料采用檢驗,計數(shù)等級資料采用Ridit分析。分析時采用雙側(cè)檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 2組患者臨床妊娠相關(guān)指標比較 2組患者均未出現(xiàn)異位妊娠,正常受精數(shù)、可移植胚胎數(shù)、移植胚胎數(shù),差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。平均著床胚胎數(shù)、著床胚胎率、臨床妊娠率,觀察組高于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表1～2。

表1 2組患者臨床妊娠相關(guān)指標個)

表2 2組患者著床胚胎率和臨床妊娠率(%)

2.2 2組患者不同時期血清生殖激素比較 在D3及Gn啟動日,2組患者血清激素FSH、LH、E2、P、T和PRL水平差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。hCG注射日,2組患者LH水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),E2、P、T水平觀察組顯著低于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。取卵日,2組患者T水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),E2、P 2種激素觀察組顯著低于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。移植日,P、T水平2組比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05),E2水平觀察組顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。移植7 d,2組患者E2、T水平差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05),觀察組顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組患者不同時期血清生殖激素比較

2.3 2組患者不同時期卵泡液生殖激素比較 T水平2組患者比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);E2水平觀察組顯著高于對照組,而P水平對照組明顯高于觀察組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表4。

表4 2組患者卵泡液生殖激素比較

2.4 2組患者不同時期血清IGF-2、IL-1β、IL-6、LIF、TGF-β1、VEGF及TNF-α水平比較 取卵日及移植日,血清IGF-2、IL-1β、IL-6、LIF、TGF-β1、VEGF水平觀察組均高于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05);TNF-α水平觀察組低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。移植7 d,IGF-2、IL-1β、IL-6、LIF、VEGF水平觀察組均高于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05);TNF-α水平觀察組低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);TGF-β1水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 2組患者血清IGF-2、IL-1β、IL-6、LIF、TGF-β1、VEGF及TNF-α水平比較

2.5 2組患者卵泡液IGF-2、IL-1β、IL-6、LIF、TGF-β1、VEGF及TNF-α水平比較 IGF-2、IL-1β、IL-6、LIF、TGF-β1、VEGF水平觀察組均高于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05);TNF-α水平觀察組低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表6。

表6 2組患者卵泡液IGF-2、IL-1β、IL-6、LIF、TGF-β1、VEGF及TNF-α水平比

2.6 2組患者不同時期子宮動脈血流情況比較 hCG注射日,觀察組雙側(cè)子宮動脈血流搏動指數(shù)(Pulse Index,PI)、阻力指數(shù)(Resistance Index,RI)均顯著低于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。移植日,觀察組雙側(cè)子宮動脈血流PI、RI值均顯著低于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表7～8。

表7 2組患者hCG日子宮動脈血流情況

表8 2組患者移植日子宮動脈血流情況

3 討論

目前補腎益氣和血法中藥改善IVF-ET妊娠結(jié)局尚有爭議,但有研究提示補腎中藥可以改善IVF-ET妊娠結(jié)局[5-8],研究結(jié)果的不同可能與藥物的濃度、劑量、煎藥方法以及辨證加減有關(guān)。

補腎益氣和血中藥對IVF-ET妊娠結(jié)局的作用機制研究很局限。1)調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌功能,補腎中藥對女性性腺軸功能具有雙相調(diào)節(jié)作用,能改善女性生殖內(nèi)分泌激素環(huán)境,促使下丘腦-垂體-卵巢軸的調(diào)節(jié)功能得到改善,提高對促性腺激素的敏感性,改善卵子質(zhì)量及子宮內(nèi)膜容受性[9-10],提高IVF-ET的種植率和妊娠率,改善IVF-ET的妊娠結(jié)局。2)改善子宮內(nèi)膜容受性,張琦和張勤華[11]使用溫腎活血方治療反復移植失敗患者,發(fā)現(xiàn)移植日子宮內(nèi)膜的腺體彎曲擴張,分泌活躍,間質(zhì)疏松,與腺體發(fā)育同步,可見整齊的核下空泡,并能明顯增加增殖期內(nèi)膜的厚度,在其向分泌期轉(zhuǎn)化過程中還能維持內(nèi)膜厚度,監(jiān)測血流顯示在內(nèi)膜及內(nèi)膜下均能見到豐富血流,且螺旋動脈PI、RI均較低,提示溫腎活血方能改善患者“種植窗”期子宮內(nèi)膜形態(tài),增加內(nèi)膜血液循環(huán),增加子宮內(nèi)膜容受性,為胚胎著床創(chuàng)造有利條件。許娟等[12]研究發(fā)現(xiàn),溫經(jīng)祛瘀中藥可提高胞飲突的表達,使子宮內(nèi)膜腺體彎曲,腺上皮柱狀、假復層、腺腔面上皮表面出現(xiàn)較多微絨毛樣突起,腺體間質(zhì)組織疏松,間質(zhì)內(nèi)小血管增生,胚胎著床率更高。3)防治卵巢過度刺激,陳小燕等[13]采用益氣血補肝腎中藥干預IVF-ET過程,觀察發(fā)現(xiàn)服中藥患者中重度卵巢過度刺激綜合征發(fā)生率不高,具有較高優(yōu)質(zhì)胚胎率,移植日VEGF表達較低,表明中藥可能通過降低患者移植日后的血清VEGF來降低中重度卵巢過度刺激綜合征的發(fā)生。

女性生殖內(nèi)分泌激素是生殖功能的基礎,其主要生理功能是控制性發(fā)育、正常月經(jīng)及性功能。參與生殖的性激素主要有FSH、LH、E2、PRL、P、T和hCG。本研究中,2組病例基礎狀態(tài)的各項內(nèi)分泌平均值與正常婦女類似,且2組間差異無統(tǒng)計學意義,經(jīng)過垂體降調(diào)節(jié)后,啟動日2組血清生殖內(nèi)分泌激素比較差異均無統(tǒng)計學意義,且均達到了垂體抑制狀態(tài)?；A狀態(tài)和啟動日生殖內(nèi)分泌激素狀態(tài),提示2組患者在補腎益氣和血法中藥治療前相似,具有可比性。

本研究中,hCG注射日,E2、P、T 3種激素2組比較均有顯著性差異,觀察組3種激素均顯著低于對照組。在IVF-ET時,hCG注射日血清E2、P、T水平均明顯高于正常婦女同期水平,LH水平2組比較差異無統(tǒng)計學意義,提示補腎益氣和血法中藥有一定的降調(diào)E2、P和T水平的作用,但對LH水平2組未產(chǎn)生顯著性差異。取卵日,E2和P 2種激素觀察組均顯著低于對照組,T水平2組比較差異無統(tǒng)計學意義,提示中藥有一定的降調(diào)E2、P水平的作用,但對T水平2組差異無統(tǒng)計學意義。移植日,E2在觀察組顯著低于對照組,2組比較差異有顯著性,P、T 2種激素2組比較差異均無統(tǒng)計學意義,提示中藥對移植日過高的血清E2有一定的降低作用,但對移植日P和T無明顯影響。移植7 d,E2在觀察組顯著高于對照組,P、T水平2組比較差異無統(tǒng)計學意義。提示中藥對移植7 d血清E2有一定的升調(diào)作用,但對移植日P和T無明顯影響。卵泡液中,E2在觀察組明顯高于對照組,而P則相反,在對照組顯著高于觀察組,T水平2組比較差異無統(tǒng)計學意義,提示補腎益氣和血法中藥對卵泡液中E2水平有一定的升調(diào)作用,對卵泡液中的P水平有一定的降調(diào)作用,但對卵泡液中的T水平影響不明顯。

人類生殖功能的調(diào)節(jié)受多種因素的影響,目前所了解的具有一定的局限性,IGF-2、IL-1β、IL-6、LIF、TGF-β1、VEGF、TNF-α與生殖密切相關(guān)。IL-1β是IL-1其中的一種,對女性生殖的調(diào)節(jié)是多途徑的,一是通過血液循環(huán)直接作用于生殖中樞,二是在卵巢、子宮及卵泡液中局部表達,通過對黃體細胞孕酮分泌及對Na+-K+-ATP酶活性的影響,參與生殖調(diào)節(jié)[14]。IL-6則參與妊娠和女性生殖內(nèi)分泌的建立、胚泡著床及其胚胎生長發(fā)育等生理活動[15]。研究發(fā)現(xiàn),LIF參與生殖的各個環(huán)節(jié),其具有抑制多向生長潛能的胚胎干細胞分化并保持其增殖的作用,可以促進卵泡發(fā)育成熟、誘發(fā)排卵,促進胚胎發(fā)育和著床,影響妊娠率。IGF-2可影響卵泡發(fā)育、優(yōu)勢卵泡的選擇、卵母細胞成熟、胚胎早期發(fā)育、內(nèi)膜分化、胚胎著床及甾體激素合成等[16-18]。TGF-β1主要在初級卵泡的卵母細胞、竇卵泡的膜細胞和顆粒細胞中表達,對于卵泡發(fā)育及妊娠過程起著重要作用[19]。在卵泡生長發(fā)育過程中,VEGF誘導的血管化在優(yōu)勢卵泡的確定和促性腺激素的傳遞中起重要作用[20]。MORIZANE等[21]研究發(fā)現(xiàn)TNF-α通過誘導卵細胞、間質(zhì)細胞及顆粒細胞凋亡,參與卵泡的閉鎖過程,因而,卵泡液中TNF-α水平升高(如子宮內(nèi)膜異位癥患者)可致不孕高發(fā)。本研究顯示,補腎益氣和血法中藥對取卵日和移植日血清IGF-2、IL-1β、IL-6、LIF、TGF-β1和VEGF 6種相關(guān)因子可能有一定的升調(diào)作用,對TNF-α有一定的降調(diào)作用,對移植7 d血清IGF-2、IL-1β、IL-6、LIF和VEGF 6種相關(guān)因子可能有一定的升調(diào)作用,對TNF-α有一定的降調(diào)作用,但對TGF-β1無明顯影響。對卵泡液中IGF-2、IL-1β、IL-6、LIF、TGF-β1和VEGF 6種相關(guān)因子可能有一定的升調(diào)作用,對TNF-α有一定的降調(diào)作用。

子宮動脈(Uterine Artery,UtA)是胚胎著床及其生長發(fā)育所需的母體血供來源,子宮內(nèi)膜和內(nèi)膜下血流則直接反映了胚胎著床部位微環(huán)境的血流灌注情況,內(nèi)膜和內(nèi)膜下血流增多有利于胚胎著床和妊娠,而內(nèi)膜和內(nèi)膜下無血流或血流缺乏往往代表一個較差的子宮環(huán)境,常伴有高齡、內(nèi)膜薄、子宮動脈阻力指數(shù)高[22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),觀察組雙側(cè)子宮動脈血流PI、RI均顯著低于對照組,提示補腎益氣和血法中藥可能降低子宮動脈血流指數(shù),改善子宮供血,有利于卵泡發(fā)育、胚胎著床和胚胎發(fā)育。

綜上所述,本研究結(jié)果顯示,補腎益氣和血法觀察組胚胎著床率、臨床妊娠率均顯著高于對照組,提示補腎益氣和血法中藥介入IVF-ET可能提高著床率,改善妊娠結(jié)局。

利益沖突聲明:無。