張伊冰 亓煥偉 李家峰 亓煥明 李瀛偉 包永睿,3,4 孟憲生,3,4

(1 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,大連,116600; 2 沈陽百草濟(jì)世腫瘤醫(yī)藥研究中心,沈陽,110041; 3 遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室,大連,116600; 4 遼寧省中藥多維分析專業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心,大連,116600)

世界衛(wèi)生組織最新公布的《世界癌癥報(bào)告》顯示:2018年,肝癌成為全球第6大常見癌癥和全球第4大常見癌癥致死因素,在亞洲和非洲的年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率高于美國(guó)、歐洲和大洋洲[1]。在中國(guó)癌癥流行病學(xué)的最新報(bào)告中,肝癌在全國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率排名第4位,約為26.92/10萬,年發(fā)病患者約37萬[2]。

古草生機(jī)湯為沈陽百草濟(jì)世腫瘤醫(yī)藥研究中心研制,由白花蛇舌草、黃藥子、莪術(shù)等8味中藥組成,有散結(jié)化痞、清瘀消滯、通利排毒等功效,在臨床上用于惡性腫瘤的治療和其他治療方式的聯(lián)合用藥,經(jīng)過多年數(shù)百病例觀察均有很好的治療效果。近年來該方劑治療消化系統(tǒng)惡性腫瘤獲得較好療效,在治療肝癌的同時(shí),能夠?qū)Ω闻K功能、免疫功能起到一定的保護(hù)和調(diào)節(jié)作用,且具有不良反應(yīng)小等特點(diǎn),但其藥效評(píng)價(jià)及具體抗腫瘤機(jī)制尚未有詳細(xì)報(bào)道。本研究為2016、2017年度遼寧省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)研究項(xiàng)目——中藥藥效物質(zhì)組學(xué)及作用機(jī)制整合研究中的一部分,旨在通過動(dòng)物體內(nèi)模型初步探究臨床有效抗肝癌方劑——古草生機(jī)湯的抗癌作用機(jī)制。研究基于古草生機(jī)湯在臨床應(yīng)用所取得一定成果的基礎(chǔ)上,探究該方劑對(duì)肝癌的抑制作用及分子機(jī)制,采用H22肝癌荷瘤小鼠模型,通過免疫器官、瘤體組織顯微結(jié)構(gòu)、血清指標(biāo)、基因表達(dá)等不同層面,應(yīng)用蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin,HE)染色、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法對(duì)古草生機(jī)湯體內(nèi)抑瘤和免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià),為將來此藥的臨床應(yīng)用及抗消化系統(tǒng)惡性腫瘤的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級(jí)昆明種小鼠,8周齡,雄性,體質(zhì)量為18～22 g(購于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司,許可證號(hào)SCXK(遼)2015-0001,遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理號(hào)/動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(遼)2019-0004)。在室溫(23±1)℃、相對(duì)濕度55%±5%、12 h/12 h晝夜交替日光燈照射動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng),攝食、飲水自由的環(huán)境中適應(yīng)1周后,用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞株:H22小鼠肝癌瘤株,購于江蘇齊氏生物科技有限公司。

1.1.2 藥物 古草生機(jī)湯(由沈陽百草濟(jì)世腫瘤醫(yī)藥研究中心提供),環(huán)磷酰胺(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)公司,批號(hào):19032821)。

1.1.3 試劑與儀器 組織固定液(海門市博創(chuàng)實(shí)驗(yàn)器材有限公司,批號(hào):2050354)、肝素鈉(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):1024E026)、1640培養(yǎng)基(Gibco公司,美國(guó),貨號(hào):2058872)、胎牛血清(Gibico公司,美國(guó),貨號(hào):10099-141),腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(本生健康科技有限公司,貨號(hào):BS-0121)、小鼠γ干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(本生健康科技有限公司,貨號(hào):BS-9828),小鼠白細(xì)胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(本生健康科技有限公司,貨號(hào):BS-2689)、凋亡相關(guān)因子(Factor Related Apoptosis,FAS)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(本生健康科技有限公司,貨號(hào):BS-0009)、小鼠凋亡相關(guān)因子配體(Factor Related Apoptosis Ligand,FASL)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(本生健康科技有限公司,貨號(hào):BS-0723)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate Transferase,AST)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(本生健康科技有限公司,貨號(hào):BS-1626)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alaninetransaminase,ALT)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(本生健康科技有限公司,貨號(hào):BS-5192),RNA提取試劑盒(TransZol Up,北京全式金生物技術(shù)有限公司,批號(hào):L30731)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Trans Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix,北京全式金生物技術(shù)有限公司,批號(hào):L10303)、熒光定量PCR試劑盒(Trans Start Top Green qPCR Super Mix,北京全式金生物技術(shù)有限公司,批號(hào):L20830)。實(shí)驗(yàn)涉及所有引物委托大連萬澤貿(mào)易有限公司技術(shù)人員,按照引物中適宜的(G+C)/(A+T)比例進(jìn)行設(shè)計(jì),使退火溫度在60 ℃附近,設(shè)計(jì)好的引物序列交與生物上海生工生物公司進(jìn)行合成。CO2培養(yǎng)箱(Millipore公司,美國(guó),型號(hào):W2001R),超純水處理裝置(Millipore公司,美國(guó),型號(hào):Milli-Q)、熒光倒置顯微鏡(NIKON公司,日本,型號(hào):ECLIPSE-TI),酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司,美國(guó),型號(hào):Spectra Max Plus384),微量離心機(jī)(Thermo Fisher公司,美國(guó),型號(hào):Sorvall Lengend Mico21)。

1.2 方法

1.2.1 分組與H22荷瘤小鼠動(dòng)物模型建立 小鼠肝癌H22細(xì)胞株用含有1%青鏈霉素和10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基,放置于37 ℃、5%CO2、95%相對(duì)飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)和傳代,傳代3次后,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

取上述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的H22小鼠肝癌細(xì)胞,離心棄上清,用磷酸鹽緩沖液(Phosphate-buffered Saline,PBS)吹散調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL,0.2 mL/只腹腔注射昆明種小鼠體內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增,自由攝食飲水,飼養(yǎng)8 d。在無菌臺(tái)下,取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的小鼠脫頸椎處死,75%乙醇消毒腹部,無菌注射器腹腔穿刺,抽吸腹水,得到乳白色濃稠狀腹水,留存?zhèn)溆?。將腹?1 000×g離心5 min,棄上清,加PBS吹散離心清洗2次,用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL,用于第2代腹水注射。連續(xù)傳3代,第3代腹水經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞活性,細(xì)胞存活率≥95%,備用。取8周昆明種小鼠,將腹水細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107個(gè)/mL,0.2 mL/只,注射于小鼠右前肢腋下,密切觀察小鼠變化,2 d后小鼠右前肢腋下可觸摸到鼓起結(jié)節(jié),表明造模成功。

隨機(jī)將成模小鼠分為空白組、模型組、陽性藥組(環(huán)磷酰胺27 mg/kg)、古草生機(jī)湯低劑量組(0.75 g/kg)、古草生機(jī)湯高劑量組(1.5 g/kg)。

1.2.2 給藥方法 模型組和空白組給予生理鹽水,每只0.2 mL,1次/d,每隔1 d稱量小鼠體質(zhì)量,共給藥7 d。末次給藥2 h后,禁食不禁水。次日稱量各組小鼠體質(zhì)量,將小鼠眼眶取血,加入肝素抗凝,靜置30 min后,21 000×g離心10 min,取上層血漿。脫頸椎處死小鼠,除空白組外,其余組解剖,依次剝離取出脾、胸腺、瘤體,分別稱重。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 計(jì)算各組的抑瘤率、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù):抑瘤率%=(1-給藥組平均瘤重/模型組平均瘤重)×100%;脾指數(shù)=小鼠脾重量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)×10;胸腺指數(shù)=小鼠胸腺重量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)×10。

HE染色法評(píng)價(jià)古草生機(jī)湯對(duì)H22荷瘤小鼠實(shí)體瘤生長(zhǎng)情況的影響:將模型組、陽性藥組、古草生機(jī)湯低劑量組和古草生機(jī)湯高小鼠的瘤體組織放入10%甲醛溶液中固定,經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片和貼片,用HE試劑染色封片,顯微鏡下觀察各組瘤組織結(jié)構(gòu)改變、腫瘤細(xì)胞密度、腫瘤細(xì)胞凋亡及壞死程度。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)H22荷瘤小鼠血清中IL-2、TNF-α、IFN-γ、Fas、FasL、AST、ALT的含量:按照試劑盒內(nèi)說明書上的操作制備各組的血漿樣品,對(duì)應(yīng)加入各反應(yīng)試劑,在酶標(biāo)儀450 nm下測(cè)定吸光度,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及各樣品的吸光度,計(jì)算出各組小鼠血漿中IL-2、TNF-α、IFN-γ、Fas、FasL、AST、ALT的含量。

熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)古草生機(jī)湯對(duì)Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X Protein,Bax)和B細(xì)胞淋巴瘤(B Cell Lymphoma-2,Bcl-2)mRNA表達(dá)的影響:取除空白組外其他組小鼠的瘤體組織,以Transzol法提取總RNA,按照Trans Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的操作步驟,將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA,反應(yīng)條件為:25 ℃孵育10 min,42 ℃孵育15 min,85 ℃加入5 s使反轉(zhuǎn)錄酶失活。用Trans Start Top Green qPCR Super Mix試劑盒對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增,內(nèi)參基因?yàn)棣?actin,擴(kuò)增反應(yīng)條件:94 ℃加熱30 s,94 ℃加熱5 s、55 ℃加熱15 s、72 ℃加熱10 s重復(fù)40次。引物序列為如下。Bax-F:5-AGGATGCGTCCACCAAGAA-3。Bax-R:5-CAAAGTAGAAGAGGGCAACCAC-3-3。Bcl-2-F:5-CAACACTCCCTCTTGACCTATGC-3。Bcl-2-R:5-GAAAATGTTCCCAAGTGAGTTAGA-3。VEGF-F:5-CCCGAATTCTCCTGGTGAGAGATCTGGTT-3。VEGF-R:5-GGGGGATCCGCCTCCGAAACCATGAACTT-3。β-actin-F:5-GTCCCTCACCCTCCCAAAAG-3。β-actin-R:5-GCTGCCTCAACACCTCAACCC-3。

2 結(jié)果

2.1 古草生機(jī)湯對(duì)H22小鼠平均體質(zhì)量、實(shí)體瘤抑瘤率和免疫器官的影響 模型組小鼠給藥期間的平均體質(zhì)量增長(zhǎng)率為3.81%,明顯低于空白組(18.66%);陽性藥組、古草生機(jī)湯低劑量組和高劑量組小鼠平均體質(zhì)量增長(zhǎng)率分別為17.31%、14.96%和13.35%,均高于模型組,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。見表1,圖1。

圖1 各組小鼠的體質(zhì)量、抑瘤率、臟器指數(shù)注:古-低為古草生機(jī)湯低劑量組,古-高為古草生機(jī)湯高劑量組;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01

表1 給藥期間各組小鼠平均體質(zhì)量變化

陽性藥組、古草生機(jī)湯低劑量組、高劑量組H22荷瘤小鼠實(shí)體瘤的平均重量明顯低于模型組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。陽性藥組、古草生機(jī)湯低、高劑量組的抑瘤率分別為67.45%、35.11%和47.81%,古草生機(jī)湯的抑瘤率與給藥劑量負(fù)相關(guān)。見表2,圖1。除空白組外各組小鼠瘤體圖片見圖2。陽性藥組和古草生機(jī)湯低、高劑量組小鼠瘤體的體積變化規(guī)律與計(jì)算所得抑瘤率結(jié)果相同。

圖2 各組H22荷瘤小鼠的實(shí)體瘤注：A.模型組;B.陽性藥組;C.古草生機(jī)湯低劑量組;D.古草生機(jī)湯高劑量組

圖3 各組H22荷瘤小鼠實(shí)體瘤病理切片(HE染色,×200)注：A.模型組;B.陽性藥組;C.古草生機(jī)湯低劑量組;D.古草生機(jī)湯高劑量組

表2 各組小鼠的抑瘤率

模型組小鼠的胸腺指數(shù)為18.62±3.83,低于空白組27.71±6.35;模型組的脾臟指數(shù)為47.06±7.04,高于空白組30.20±3.48。陽性藥組和古草生機(jī)湯低、高劑量組的胸腺指數(shù)為12.30±1.77、24.47±6.07、25.53±4.61;3組的脾臟指數(shù)分別為13.80±1.78、36.42±7.23和34.89±4.38。與模型組比較,古草生機(jī)湯低、高劑量組能夠明顯提高小鼠的胸腺指數(shù)并降低脾臟指數(shù),且其藥效隨藥濃度的增加而增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)。陽性藥小鼠的胸腺指數(shù)明顯低于空白組,但脾臟指數(shù)明顯降低且遠(yuǎn)低于空白組的正常小鼠。

2.2 古草生機(jī)湯對(duì)H22荷瘤小鼠實(shí)體瘤生長(zhǎng)情況的影響 從HE染色的病理切片中可以看出,模型組腫瘤細(xì)胞排列較緊密,細(xì)胞密度大,壞死細(xì)胞少見,細(xì)胞核較大胞漿較少,細(xì)胞間質(zhì)較少;陽性藥組細(xì)胞排列疏松,壞死細(xì)胞多見細(xì)胞核有中心壞死和破裂,細(xì)胞質(zhì)凝聚固縮;古草生機(jī)湯低、高劑量組和模型組比較死亡細(xì)胞數(shù)量較多,細(xì)胞大小各異:古草生機(jī)湯低劑量組的結(jié)締組織較其他3組更為明顯,古草生機(jī)湯高劑量組的細(xì)胞間質(zhì)較低劑量組更大,細(xì)胞死亡數(shù)量更多。

2.3 古草生機(jī)湯對(duì)H22荷瘤小鼠血清IFN-γ、TNF-α、IL-2、Fas、FasL、AST、ALT的影響 與空白組比較,模型組小鼠血清中的IFN-γ、TNF-α和IL-2平均含量明顯低于空白組,分別為(283.42±37.88)pg/mL、(231.00±17.35)pg/mL和(170.09±20.71)pg/mL;陽性藥組(383.01±22.17)pg/mL、(374.24±26.21)pg/mL和(335.06±28.37)pg/mL、古草生機(jī)湯低劑量組(242.33±32.47)pg/mL、(322.98±25.99)pg/mL和(296.86±19.37)pg/mL、古草生機(jī)湯高劑量組(519.28±24.54)pg/mL、(386.66±37.57)pg/mL和(372.91±48.54)pg/mL均高于模型組(均P<0.01)。模型組小鼠血清中肝功能指標(biāo)AST和ALT的含量為(25.92±0.85)ng/mL和(21.60±0.94)ng/mL,顯著高于空白組;陽性藥組為(20.11±1.80)ng/mL和(17.74±1.28)ng/mL、古草生機(jī)湯低劑量組為(21.12±1.76)ng/mL和(17.38±0.91)ng/mL、古草生機(jī)湯低劑量組為(19.12±1.30)ng/mL和(16.20±0.69)ng/mL,3個(gè)給藥組的肝功能指標(biāo)均明顯低于模型組(P<0.01)。模型組小鼠血清中Fas和FasL含量為(17.36±1.16)nmol/mL和(10.38±0.90)nmol/mL,明顯高于空白組;陽性藥組為(14.55±0.84)nmol/mL和(8.79±0.77)nmol/mL、古草生機(jī)湯低劑量組為(13.03±1.11)nmol/mL和(8.05±0.59)nmol/mL、古草生機(jī)湯高劑量組為(12.05±70.78)nmol/mL和(7.32±0.67)nmol/mL,3個(gè)給藥組均明顯低于模型組(均P<0.01)。古草生機(jī)湯低劑量組升高IFN-γ、TNF-α、IL-2和降低AST的功效明顯高于陽性藥組(P<0.01,P<0.05),古草生機(jī)湯高劑量組降低ALT的功效明顯高于陽性藥組(P<0.05),古草生機(jī)湯低、高劑量組降低Fas、FasL的功效均明顯高于陽性藥組(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組H22荷瘤小鼠血清指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果注:古-低為古草生機(jī)湯低劑量組,古-高為古草生機(jī)湯高劑量組;與模型組比較,**P<0.01;與陽性藥組比較,△P<0.05,△△P<0.01

2.4 古草生機(jī)湯對(duì)H22荷瘤小鼠實(shí)體瘤組織中Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響 陽性藥組、古草生機(jī)湯低劑量組、古草生機(jī)湯高劑量組均能夠上調(diào)瘤組織中Bax mRNA的表達(dá),下調(diào)Bcl-2 mRNA的表達(dá),與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。古草生機(jī)湯高劑量組的Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)量與陽性藥組接近,古草生機(jī)湯低劑量組略遜于陽性藥組。見圖5。

圖5 各組H22荷瘤小鼠瘤組織中Bax和Bcl-2mRNA相對(duì)表達(dá)量注:古-低為古草生機(jī)湯低劑量組,古-高為古草生機(jī)湯高劑量組;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01

3 討論

肝癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率高、致死率高的一類惡性腫瘤。目前,肝惡性腫瘤的臨床治療方法以手術(shù)、化療和放療為主,常用的化療藥物存在一定的不良反應(yīng)[3],有明顯的細(xì)胞毒性,對(duì)正常細(xì)胞的殺傷力大,容易造成肝腎功能損傷以及多重耐藥等現(xiàn)象[4],且能夠?qū)C(jī)體的免疫功能造成不同程度的影響[5]。中藥在治療惡性腫瘤方面具有不良反應(yīng)小、耐藥性低的特點(diǎn),還可以在一定程度上保護(hù)臟器功能、調(diào)節(jié)自身免疫、提高患者的生命質(zhì)量,在惡性腫瘤的臨床治療上有一定的應(yīng)用前景[6]。

本研究在評(píng)價(jià)古草生機(jī)湯在對(duì)抗癌的同時(shí),著重分析其在抗體質(zhì)量消耗、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、臟器保護(hù)等方面的功效。從模型組小鼠較低的體質(zhì)量增長(zhǎng)率可以看出,肝癌對(duì)小鼠的體質(zhì)量影響較大,能夠影響其體質(zhì)量增長(zhǎng),陽性藥組和古草生機(jī)湯低、高劑量組的小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率均明顯高于模型組,顯示出古草生機(jī)湯可在一定程度上抑制肝癌對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響。胸腺和脾臟是機(jī)體重要的免疫器官,當(dāng)惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展時(shí),機(jī)體免疫器官會(huì)受到嚴(yán)重影響并發(fā)生明顯的變化,出現(xiàn)胸腺萎縮、脾臟腫大的現(xiàn)象,而且其程度與腫瘤病情發(fā)展相關(guān)[7]。本實(shí)驗(yàn)通過計(jì)算胸腺、脾臟指數(shù)來反映各組小鼠的胸腺萎縮、脾臟腫大程度,從所得結(jié)果可知,古草生機(jī)湯能明顯提高H22荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)并降低小鼠的脾臟指數(shù),減輕腫瘤對(duì)小鼠胸腺、脾臟2個(gè)免疫器官的影響。

腫瘤的形成與發(fā)展是極為復(fù)雜的過程,目前認(rèn)為細(xì)胞外調(diào)節(jié)因子及細(xì)胞內(nèi)信息系統(tǒng)失控可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)分子紊亂,從而引起惡變和不可控制的增殖,機(jī)體依靠自身的細(xì)胞和細(xì)胞因子等活性物質(zhì)調(diào)節(jié)免疫功能,以起到對(duì)腫瘤細(xì)胞的監(jiān)視和特異性殺傷作用[8]。IFN-γ對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)具有重要的調(diào)節(jié)作用,是機(jī)體發(fā)揮免疫功能、消除體內(nèi)病原的重要因子之一,對(duì)機(jī)體的免疫和抑制腫瘤有重要的作用[9]。TNF-α是由T細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生的細(xì)胞因子,是惡性腫瘤微環(huán)境中常見且具有一定代表性的細(xì)胞因子,能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,在調(diào)節(jié)免疫功能與抗腫瘤免疫中起到重要作用[10]。臨床研究表明,TNF-α水平的異常,對(duì)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定會(huì)產(chǎn)生重大影響,可造成患者免疫功能異常,誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生及病情的發(fā)展[11]。IL-2是機(jī)體免疫功能調(diào)節(jié)的重要細(xì)胞因子,能夠促進(jìn)T細(xì)胞的增殖與活化,刺激自然殺傷細(xì)胞的增殖,在自然殺傷細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞中同時(shí)分泌INF-γ,增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[12]。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,當(dāng)肝癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)增長(zhǎng)時(shí),模型組小鼠血清中的免疫細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2均明顯下降,古草生機(jī)湯可顯著升高小鼠血清中此3種指標(biāo),且其調(diào)節(jié)作用隨給藥濃度的升高而增強(qiáng)。依此推斷:古草生機(jī)湯可通過對(duì)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)來對(duì)抗肝腫瘤的發(fā)展。

Fas是細(xì)胞表面重要的死亡受體,是細(xì)胞凋亡的信號(hào)分子。Fas與其FasL結(jié)合,活化并轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號(hào),是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的重要途徑之一[13]。研究表明,惡性腫瘤患者血清中可溶性Fas和FasL顯著升高,化療后二者明顯降低[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究相同,模型組H22荷瘤小鼠血清中的Fas和FasL顯著升高,陽性藥組和古草生機(jī)湯低、高劑量組的Fas和FasL明顯降低。由此可見,古草生機(jī)湯能夠在一定程度上調(diào)節(jié)Fas和FasL,可能是其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用之一,但具體機(jī)制還需要進(jìn)一步探究和驗(yàn)證。

當(dāng)肝臟發(fā)生病變時(shí),肝細(xì)胞過度合成ALP,通過淋巴管和肝竇進(jìn)入血液循環(huán)。既往研究證實(shí),原發(fā)性肝癌小鼠的癌細(xì)胞大量增殖過程中,小鼠血清中AST和ALT的含量迅速增加[15]。本實(shí)驗(yàn)中,模型組小鼠血清中的AST、ALT含量較空白組顯著升高;古草生機(jī)湯小鼠血清中的AST、ALT含量均明顯降低,由此可見古草生機(jī)湯在抗肝癌的同時(shí)能夠起到保護(hù)小鼠肝臟功能的作用。

Bax為促凋亡基因,Bcl-2為原癌基因之一,是細(xì)胞存活促進(jìn)因子,Bax和Bcl-2通過形成同源或異源二聚體來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[16]。當(dāng)Bax蛋白與自身形成同源二聚體時(shí),可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;當(dāng)Bax蛋白與Bcl-2蛋白結(jié)合形成異源二聚體時(shí),則會(huì)抑制Bcl-2蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制功能[17]。因此,當(dāng)二者表達(dá)水平達(dá)到平衡時(shí)則細(xì)胞正常生存;當(dāng)Bcl-2的表達(dá)量多于Bax,Bcl-2與Bax結(jié)合成異源二聚體抑制細(xì)胞凋亡[18];當(dāng)Bcl-2表達(dá)量少于Bax,Bax與Bax形成同源二聚體促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19]。研究表明,腫瘤細(xì)胞能夠通過上調(diào)Bcl-2下調(diào)Bax從而逃避凋亡[20]。本實(shí)驗(yàn)中,古草生機(jī)湯可顯著上調(diào)H22荷瘤小鼠腫瘤組織中Bax mRNA的相對(duì)表達(dá)量,下調(diào)Bcl-2的表達(dá)量,使Bax的表達(dá)量多于Bcl-2,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。

綜上所述,本研究初步證實(shí)古草生機(jī)湯具有一定的體內(nèi)抗肝腫瘤活性,其作用機(jī)制可能與其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫有關(guān),且在抑制腫瘤的同時(shí)對(duì)肝臟功能有一定的保護(hù)作用,但其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步探究。

利益沖突聲明:無。