林曉玲 周 娟 葉麗妍 陳佩文 葉綺娜 劉 華 陳曉剛

(1 廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院,廣州,510405; 2 廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院兒科,廣州,510405; 3 廣州婦女兒童醫(yī)療中心,廣州,510623)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是兒童時期最常見的慢性呼吸道疾病,近年來兒童哮喘患病率在全球范圍內持續(xù)上升,其具體原因尚未完全清楚。Strachan提出的“衛(wèi)生假說”,從生命早期微生物暴露的角度,解釋現(xiàn)代社會中哮喘等過敏性疾病發(fā)病率持續(xù)增加的現(xiàn)象,得到了很多證據(jù)的支持。目前認為,除基因、社交、經(jīng)濟和文化背景外,生命早期的足夠的微生物暴露“訓練”了固有和適應性免疫系統(tǒng),進而實現(xiàn)機體炎癥、抗炎和免疫耐受之間的平衡。其中,腸道內棲息著數(shù)量和種類最為龐大的微生物群體,對生命早期機體免疫耐受的建立至為重要[1]。益生菌(如雙歧桿菌、乳桿菌、酪酸梭菌等)及腸道菌群的代謝產(chǎn)物尤其是短鏈脂肪酸(Short-chain Fatty Acids,SCFAs),均被發(fā)現(xiàn)能減輕哮喘模型小鼠的過敏性炎癥和氣道高反應性[2-3]。在既往研究中,我們成功建立了幼年期BALB/c小鼠的哮喘模型,并發(fā)現(xiàn)異功散的早期干預能顯著減輕哮喘模型幼鼠的氣道炎癥反應[4]。本實驗在此基礎上,試圖探索異功散是否通過影響腸道菌群代謝產(chǎn)物SCFAs,進而作用于G蛋白偶聯(lián)受體43(G-protein-coupled Receptor 43,GPR43)從而抑制過敏性氣道炎癥。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 7 d鼠齡無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級BALB/c雌性小鼠共32只,體質量(5.26±1.15)g。由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供,許可證號:SYXK(粵)2018-0034,飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗動物中心SPF級環(huán)境中。倫理審批號:TCMF1-2020007,TCMF1-2018019。

1.1.2 藥品 氫氧化鋁粉(上海麥克林生化科技有限公司,批號:20180411);雞卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)(Sigma公司,批號:BC88709X);異功散組成:人參(批號:180901)、白術(批號:180801)、茯苓(批號:181104)、廣陳皮(批號:180701)、炙甘草(批號:181001),均購自廣州中醫(yī)藥中大學第一附屬醫(yī)院,將以上藥材按1∶1∶1∶1∶1比例配制,制成含生藥質量濃度為2 g/mL的溶液;酪酸梭菌CGMCC313-1(山東科興生物制品有限公司惠贈,批號:LS2021030)。

1.1.3 試劑與儀器 乙酸(Sigma-Aldrich,美國,批號:64-19-7),丙酸(Sigma-Aldrich,美國,批號:79-09-4),丁酸(Sigma-Aldrich,美國,批號:107-92-6),2-乙基丁酸標準品(Sigma-Aldrich,美國,批號:88-09-5);丙酮(色譜純,天津紅巖公司,批號:20180701);細胞裂解液(Radio Immunoprecipitation Assay,RIPA)(強,上海碧云天生物技術有限公司,編號:P0013B),蛋白酶抑制劑[苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl Fluoride,PMSF)](上海碧云天生物技術有限公司,編號:ST506),二辛可酸(Bicinchoninic Acid,BCA)蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司,編號:P0009);衍生化試劑(含有1% t-BMCS in MTBSTFA,Cerilliant公司,美國,批號:FN0111)。電泳儀(Mini-PROTEAN Tetra電泳裝置,BIO-RAD公司,美國,型號:1658001)、酶標儀(Model 550,BIO-RAD公司,美國,型號:1681130),高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技公司,型號:Legned Micro 17R),氣相質譜聯(lián)用儀器(安捷倫公司,型號:7890B-5977A)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 采用隨機數(shù)字表法將實驗動物分為空白組、模型組、中藥組(異功散)和益生菌組(酪酸梭菌),每組8只,分籠飼養(yǎng)。參照既往研究方法制備哮喘幼鼠模型[4]。模型組、中藥組和益生菌組幼鼠分別于第1、13天腹腔注射0.2 mL OVA致敏液(質量分數(shù)為10%OVA溶液0.1 mL與等體積佐劑液態(tài)鋁混合),并于第19天以3% OVA溶液霧化吸入激發(fā),1次/d,20 min/次,連續(xù)激發(fā)6 d,幼鼠出現(xiàn)煩躁不安、腹部凹陷、搔耳撓鼻、弓背為陽性反應?？瞻捉M以腹腔注射以及霧化吸入等量生理鹽水激發(fā)。

1.2.2 給藥方法 從造模起始日至霧化激化前1 d(實驗第1天至第18天),空白組和模型組幼鼠則給予磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate Buffered Saline,PBS),中藥組幼鼠給予異功散煎液,益生菌組給予濃度為5×108CFU/mL的酪酸梭菌溶液。每只幼鼠的給藥量均為0.2 mL體積溶液。共18 d,1次/d。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 GC-MS/MS法檢測血清SCFAs 摘幼鼠眼球取血,離心分離血清(3 000 r/min,離心半徑4.5 cm,15 min),按照相關文獻血清樣本前處理方法進行相應提取,干燥,衍生[5]。檢測條件如下。1)內參:2-乙基丁酸。2)氦氣為載氣,柱流量1.0 mL/min。3)升溫程序:50 ℃(0～3 min)～60 ℃(3～3.5 min)～250 ℃(3.5～8.5 min)～110 ℃(8.5～11 min)～250 ℃(11～12 min)。4)氣相色譜條件:進樣口溫度250 ℃,進樣量1 μL,分流比10∶1。5)質譜條件:電子轟擊源(Electron Impact Source,EI),輔助加熱器溫度250 ℃,離子源溫度230 ℃,Scan掃描范圍m/z 50～200。對物峰面積與內標峰面積進行定量,使用Agilent GC MSD Chemstation軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3.2 肺組織GPR43表達的檢測 分離幼鼠肺組織,取適量加入蛋白酶抑制劑PMSF的RIPA強裂解液充分裂解,1 400 r/min,4 ℃,離心15 min(離心半徑4.5 cm)。取1.2 mL蛋白標準配制液置于蛋白標準管中充分混勻得到蛋白標準溶液(BCA),濃度為25 mg/mL。向孔板中加入適量體積的BCA液,置于恒溫搖床上(37 ℃)溫育30 min,在酶標儀上測定A562波長的吸光度,使用EXCEL計算標準曲線并根據(jù)組織樣本的體積計算相應的蛋白濃度。參照參考文獻[6],通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳得出各組GPR43相對濃度。

2 結果

2.1 SCFAs

乙酸、丙酸、丁酸、2-乙基丁酸的保留時間分別約為4.80 min、6.22 min、7.57 min、9.16 min。所有目標峰均與雜質分離,分離度良好,方法適用。總離子流圖譜結果見圖1。

圖1 SCFAs總離子流圖譜

2.1.1 異功散對幼鼠血清SCFAs中乙酸含量的影響 與空白組比較,模型組血清乙酸含量、乙酸相對比值均有所升高,但差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05);與模型組比較,中藥組、益生菌組血清乙酸含量皆高于模型組,但差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05),而血清乙酸相對比值的增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1,圖2～3。

表1 異功散對幼鼠血清乙酸含量的影響(n=8)

圖2 血清SCFAs中乙酸含量

圖3 血清SCFAs中乙酸相對比值

2.1.2 異功散對幼鼠血清SCFAs中丙酸含量的影響 與空白組比較,模型組血清丙酸含量、丙酸相對比值均降低,但差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05);與模型組比較,中藥組、益生菌組血清丙酸含量均低于模型組,丙酸相對比值均低于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2,圖4～5。

表2 異功散對幼鼠血清丙酸含量的影響(n=8)

圖4 血清SCFAs中丙酸含量

2.1.3 異功散對幼鼠血清SCFAs中丁酸含量的影響 與空白組比較,模型組血清丁酸濃度、丁酸相對比值均降低,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與模型組比較,中藥組、益生菌組血清丁酸濃度、丁酸相對比值均低于模型組,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3,圖6～7。

表3 異功散對幼鼠血清丁酸含量的影響(n=8)

圖6 血清SCFAs中丁酸含量

圖7 血清SCFAs中丁酸相對比值

2.1.4 異功散對幼鼠血清總SCFAs含量的影響 模型組血清總SCFAs含量高于空白組,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);中藥組、益生菌組血清總SCFAs含量皆高于模型組,但差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表4,圖8。

表4 異功散對幼鼠血清總SCFAs含量的影響

圖8 總SCFAs含量

2.2 異功散對幼鼠肺組織GPR43的影響 模型組肺組織GPR43表達量高于空白組,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。中藥組肺組織GPR43表達量高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);益生菌組肺組織GPR43表達量則低于模型組,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5,圖9～10。

表5 異功散對小鼠肺組織GPR43相對表達量的影響(M/P25～P75,n=8)

圖9 GPR43相對表達量

圖10 蛋白電泳條帶圖

2.3 血清乙酸濃度與肺組織GPR43的相關性分析 幼鼠血清乙酸濃度及肺組織GPR43表達之間,不存在顯著的相關關系(r=0.227,P>0.05)。見圖11。

圖11 血清乙酸濃度與肺組織GPR43的相關性分析散點圖

3 討論

元代醫(yī)家朱震亨首創(chuàng)“哮喘”病名,并闡明其病理因素“專主于痰”。培土生金被認為是防治小兒哮喘的重要方法,這與“痰”的生成原因、小兒“脾常不足”的特點相符。異功散為北宋名醫(yī)錢乙所制名方,方中人參、白術、茯苓、炙甘草、陳皮5藥相合,共奏健脾益氣和胃之功?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),方中主要藥物的活性成分,如橘皮素、橙皮苷、人參皂苷Rh2等,能減輕哮喘模型動物肺組織炎癥,或降低其氣道高反應性,抑制Th2、Th17細胞增殖及相關炎癥介質分泌等[7-8]。

現(xiàn)代醫(yī)學認為,哮喘是一種以氣道高反應性為特征的慢性炎癥反應,其發(fā)病為基因和環(huán)境相互作用所致,具體機制可能與Th1/Th2細胞失衡、Th17/Treg細胞(調節(jié)性T細胞)失衡等相關[9-10]。近年來越來越多的證據(jù)表明,腸道菌群與哮喘特別是嬰幼兒過敏性哮喘密切相關,腸道菌群失調可能是導致哮喘發(fā)生的重要機制之一[11-12]。SCFAs是由腸道細菌發(fā)酵機體無法消化的纖維和氨基酸所產(chǎn)生,主要成分為乙酸、丙酸和丁酸,占所有SCFAs含量95%以上,其含量比例通常為3∶1∶1[13]。SCFAs既是腸道黏膜細胞的主要能量來源,也是重要的免疫信號因子,可抑制炎癥介質的產(chǎn)生[14],研究發(fā)現(xiàn),其代謝紊亂與過敏性疾病密切相關[15-16]。THORBURN等[2]的研究證明,高纖維食物可促使小鼠腸道菌群產(chǎn)生更多的SCFAs,并減少其后代過敏性氣道疾病的發(fā)生,其主要作用成分可能是乙酸,丙酸則主要被結腸上皮細胞吸收利用[3]。本研究結果中,中藥組及益生菌組的血清總SCFAs含量,與模型組比較雖無明顯差異,但血清乙酸濃度有上升趨勢,丙酸濃度則顯著減低,乙酸相對于總SCFAs比值的升高差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),仍提示異功散及可能影響腸道菌群代謝產(chǎn)生SCFAs特別是其成分乙酸。

SCFAs主要為通過抑制組蛋白去乙酰化酶和激活GPR如GPR41、GPR43和GPR109a等來調節(jié)代謝和免疫[17]。一項臨床研究表明,哮喘患者在服用產(chǎn)SCFAs的可溶性纖維粉后,其氣道炎癥減輕,痰中GPR43基因表達較對照組顯著上調[18]。動物實驗亦發(fā)現(xiàn),敲除GPR43后小鼠表現(xiàn)出劇烈的過敏性氣道炎癥反應[19-20],而乙酸可激活GPR43并減輕支氣管哮喘小鼠的過敏性氣道炎癥反應[19]。本實驗結果顯示,用異功散防治的哮喘幼鼠肺組織中GPR43相對表達量顯著高于模型組(P<0.05),而酪酸梭菌則無此作用。相關分析的結果表明,幼鼠血清乙酸濃度與肺組織GPR43表達水平之間并無顯著相關性,提示異功散上調幼鼠肺組織GPR43表達的作用,并非受其對SCFAs的影響。值得注意的是,GPR43在組織中的分布具有很強的特異性,例如,Treg細胞能有效抑制機體的過敏性炎癥反應,但迄今只在腸道的Treg細胞上發(fā)現(xiàn)有GPR43表達,其他部位包括肺則未能發(fā)現(xiàn),這也說明異功散所影響的幼鼠肺組織GPR43,應該來源于其他炎癥細胞,如中性粒細胞、巨噬細胞、Th1細胞等,但其確切機制,仍需要進行一步研究。

綜上所述,本研究結果表明,異功散的早期干預可能影響了哮喘幼鼠腸道菌群的SCFAs代謝,并上調了肺組織GPR43表達,但二者的作用無顯著相關性。

利益沖突聲明:無。