趙秀萍 馬小娜 郭亞楠

(北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科,北京,100029)

卵巢早衰(Premature Ovarian Failure,POF)是指女性40歲以前出現(xiàn)雌激素降低、促性腺激素水平升高并伴有月經(jīng)紊亂、閉經(jīng)甚至不孕的疾病,發(fā)病率為1%～3%[1]。其病因尚不明確,可能與免疫遺傳、醫(yī)源性損傷及環(huán)境、心理等因素有關(guān)。絕經(jīng)綜合征(Menopausal Syndrome,MS)又稱絕經(jīng)前后諸證或更年期綜合征,是指MS婦女由于激素水平紊亂或降低引起的一系列以神經(jīng)功能紊亂,伴有情緒異常等心理疾病的綜合征,甚至出現(xiàn)機體器質(zhì)性病變,嚴重影響生命質(zhì)量,臨床多見于45～60歲女性[2]。目前針對兩疾病多以激素替代治療緩解臨床癥狀,但由于藥物使用禁忌證較多,且害怕激素藥物帶來的不良反應(yīng),患者依從性和耐受性差。循證研究顯示中醫(yī)藥可明顯改善POF及MS患者多系統(tǒng)臨床癥狀,提高生命質(zhì)量,且不良反應(yīng)少,依從性好[3]。

坤泰膠囊由黃連、白芍、阿膠、黃芩、熟地黃等中藥組方而成,具有滋陰補血、交通心腎之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實,坤泰膠囊可有效調(diào)控MS患者性激素,升高患者血清白細胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)、5-羥色胺、β-內(nèi)啡肽水平,提高機體免疫功能,療效顯著且安全性較高[4]。同時可以調(diào)節(jié)POF患者性激素代謝,降低促卵泡素,上調(diào)抗米勒管激素、IL-1β及血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)表達水平從而改善卵巢功能和臨床癥狀[5]。坤泰膠囊異病同治POF和MS臨床報道較多,但其藥理學(xué)作用機制鮮有研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為新興交叉學(xué)科,可從生物學(xué)角度揭示藥物活性成分、藥理學(xué)作用機制,解析藥物與疾病之間的分子關(guān)聯(lián),為新藥研發(fā)和臨床診療提供科研思路[6]。本研究基于中醫(yī)異病同治法則,借助現(xiàn)代網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究坤泰膠囊治療POF和MS的共同作用機制,期望為現(xiàn)代臨床研究及科研提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測坤泰膠囊異病同治POF及MS作用機制

1.1.1 篩選坤泰膠囊活性成分及靶點 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)檢索“熟地黃”“黃芩”“黃連”“白芍”“茯苓”藥物成分,以口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%、類藥性(Drug Likeness,DL)≥0.18及Caco-2滲透率≥0.4為標準篩選,在UniProt數(shù)據(jù)庫中將靶點名稱校正為Official Gene Symbol。Pubchem數(shù)據(jù)庫獲得成分Smiles結(jié)構(gòu),導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http：//www.swisstargetprediction.ch/)預(yù)測靶點。在中藥分子機制生物信息學(xué)分析工具(Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechanism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM)搜索“阿膠”，設(shè)置Score cutoff為30，P-value為0.05，得到其有效成分及作用靶點。

1.1.2 坤泰膠囊治療POF和MS共有靶點 分別在GeneCards、人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)、Drugbank數(shù)據(jù)庫以“Premature ovarian failure”“Menopausal Syndrome”為關(guān)鍵詞檢索POF和MS兩疾病作用靶點,刪除重復(fù)靶點進行標準化處理。將獲得的成分靶點與兩疾病靶點導(dǎo)入Venn 2.1.0軟件得到交集靶點即坤泰膠囊治療POF和MS的共同靶點。

1.1.3 構(gòu)建“藥物-疾病-共同靶點”網(wǎng)絡(luò) 通過Cytoscape 3.7.2構(gòu)建坤泰膠囊治療POF和MS的“藥物-疾病-共同靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。利用Network Analyzer模塊拓撲分析數(shù)據(jù)。

1.1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò) 通過STRING數(shù)據(jù)庫對坤泰膠囊治療POF和MS的交集靶點進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析,導(dǎo)入Cytoscape軟件,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并進行拓撲分析,根據(jù)自由度(Degree)、中介中心性(Betweenness)、接近中心性(Closeness)等相關(guān)參數(shù)篩選出核心靶點,根據(jù)篩選結(jié)果重新構(gòu)建PPI核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.1.5 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析 將核心靶點上傳至DAVID6.8數(shù)據(jù)庫分別進行GO和KEGG富集分析,進一步探究坤泰膠囊治療POF及MS交集靶點參與的生物過程(Biological Process,BP)、細胞組分(Cellular Component,CC)、分子功能(Molecular Function,MF)及信號通路。保留GO、KEGG富集分析結(jié)果,設(shè)置P<0.01,根據(jù)P-value及靶點數(shù)目選取前20個條目,以氣泡圖進行可視化展示。

1.2 實驗驗證

1.2.1 動物 選取12周齡健康雌性SD大鼠,體質(zhì)量為(200±20)g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[合格證編號SCXK(京)2016-0006]。所有大鼠均飼養(yǎng)在動物房內(nèi),保持室內(nèi)溫度恒定25 ℃,光照12 h日夜交替循環(huán)。所有大鼠均自由進食攝水,適應(yīng)新環(huán)境7 d后進行后續(xù)實驗。之后每日定時做陰道涂片檢查,觀察大鼠動情周期,一般為4～5 d,實驗選擇動情周期正常的大鼠進行。經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(倫理審批號:BUCM-4-2021042003-2131)。

1.2.2 藥物、試劑與儀器 坤泰膠囊(貴陽新天藥業(yè)股份有限公司,批號:210927);注射用環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司,批號:170508);補佳樂(戊酸雌二醇,拜耳醫(yī)藥保健有限公司,批號:J20171038);注射用青霉素鈉(華北制藥有限公司,批號:210502)。卵泡生成素(Follicle Stimulating Hormone,FSH)、黃體生成素(Luteinizing Hormone,LH)、雌二醇(Estradiol,E2)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)方法檢測,均購于武漢Elabscience公司;白細胞介素-6(IL-6)ELISA試劑盒(貨號:SP13755)、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)ELISA試劑盒(貨號:SP12250)均購自武漢賽培生物科技有限公司;小動物麻醉機(玉研儀器廠)、高速離心機(Sigma公司,德國,型號:1-13)。

1.2.3 造模、分組與給藥 POF:隨機數(shù)字法將大鼠分空白組、模型組、補佳樂組、坤泰膠囊組,每組8只?？瞻捉M腹腔注射0.9%生理鹽水1次仿造模,并每天蒸餾水灌胃1次。模型組采用環(huán)磷酰胺單劑量120 mg/kg腹腔內(nèi)注射建立POF模型[7],用藥1周后觀察陰道脫落細胞涂片,出現(xiàn)大鼠動情周期紊亂,漸至無動情周期為造模成功,每天蒸餾水灌胃1次。坤泰膠囊組模型組大鼠給予坤泰膠囊0.5 g/(kg·d)灌胃,1次/d。補佳樂組模型組大鼠給予戊酸雌二醇0.2 mg/(kg·d)灌胃,1次/d。

MS:隨機分為假手術(shù)組、模型組、補佳樂組、坤泰膠囊組,每組8只。參照文獻[8]制備MS大鼠模型,假手術(shù)組切除卵巢旁等體積脂肪組織,不摘卵巢,其余3組結(jié)扎血管后完整切除雙側(cè)卵巢。手術(shù)后所有大鼠均肌內(nèi)注射青霉素鈉,連續(xù)3 d,1次/d,以預(yù)防術(shù)后感染。術(shù)后第5天對動物逐只進行陰道涂片,連續(xù)3 d不出現(xiàn)動情周期表示造模成功。假手術(shù)組及模型組給予蒸餾水灌胃,1次/d,補佳樂組及坤泰膠囊組給藥同前。

1.2.4 標本采集及實驗 給藥12周后各組大鼠禁食12 h進行取材。將大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉用量,取5 mL腹主動脈血,以3 000 r/min離心(有效離心半徑10 cm)10 min,取上層血清置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。分離血清進行ELISA實驗,均按試劑盒要求步驟操作。

2 結(jié)果

2.1 篩選坤泰膠囊活性成分與潛在靶點 檢索獲得化合物51個,其中熟地黃2個,黃芩29個,黃連9個,阿膠、白芍各3個,茯苓5個。按度值排序靠前的化合物有黃芩黃酮(Rivularin)、表小檗堿(Epiberberine)、L-賴氨酸(Lysine)、谷甾醇(Sitosterol)等。將化合物進行靶點預(yù)測,獲得阿膠靶點164個,白芍73個,茯苓132個,黃連306個,熟地黃47個,黃芩417個,刪除重復(fù)靶點最終得到坤泰膠囊成分靶點714個。見表1。

表1 坤泰膠囊主要活性成分(Degree前10位)

2.2 構(gòu)建“藥物-疾病-共同靶點”網(wǎng)絡(luò) 經(jīng)篩選最終獲得POF靶點1 423個,MS靶點1 017個,將兩疾病靶點與坤泰膠囊藥物靶點取交集,得到POF與坤泰膠囊交集靶點210個,MS與坤泰膠囊交集靶點168個,而3者共同靶點128個。見圖1?！八幬?疾病-共同靶點”網(wǎng)絡(luò)中有135個節(jié)點,包含藥物節(jié)點5個,疾病節(jié)點2個,靶標節(jié)點128個及394條邊,其中與黃連相關(guān)靶點最多為57個,涉及靶點有ESR1、SHBG、ESR2、CYP19A1等。見圖2。

圖1 坤泰膠囊治療POF和MS的共同靶點韋恩圖

圖2 坤泰膠囊治療POF和MS“藥物-共同靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)

2.3 構(gòu)建核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò) 獲得51個核心靶點,PPI網(wǎng)絡(luò)由51個節(jié)點、856條邊組成,平均度值為31.6。同樣方法經(jīng)過2次篩選獲得核心靶點包含GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、SRC(原癌基因酪氨酸受體激酶)、IL-6(白細胞介素-6)、TNF(腫瘤壞死因子)、ESR1(雌激素受體1)、AKT1(蛋白激酶B1)、EGFR(表皮生長因子受體)、CASP3(胱天蛋白酶3)等。推測其可能是坤泰膠囊異病同治POF和絕經(jīng)綜合征過程中的關(guān)鍵靶點。見圖3。

圖3 坤泰膠囊治療POF和MS的核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 核心靶點GO功能及KEGG信號通路分析 該研究GO富集分析獲得322個生物過程、39個細胞組分、74個分子功能。KEGG富集涉及105條信號通路,設(shè)置P-Value<0.01,取前20個條目分別繪制高級氣泡圖。見圖4。結(jié)果顯示,坤泰膠囊異病同治POF和MS的生物學(xué)過程主要有:一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、蛋白質(zhì)自磷酸化、磷脂酰肌醇介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等;細胞組分主要涉及質(zhì)膜、細胞核、細胞膜穴樣內(nèi)陷等;分子功能主要有蛋白酪氨酸激酶活性、酶結(jié)合、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白質(zhì)結(jié)合等;KEGG富集主要信號通路有癌癥通路、胰腺癌信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia-inducible Factor-1,HIF-1)信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶和蛋白激酶B(Phosphatidylinositol 3-kinase and Protein Kinase B,PI3K-AKT)信號通路,推測以上生物學(xué)過程及信號通路可在坤泰膠囊異病同治POF及MS過程中發(fā)揮作用。

圖4 坤泰膠囊異病同治POF和MS靶點GO和KEGG分析注:圖A、B、C為核心靶點GO分析;圖D為核心靶點KEGG富集分析

2.5 各組大鼠血清FSH、LH、E2比較 POF及MS中模型組大鼠與空白組、假手術(shù)組比較,E2均明顯降低,而FSH、LH明顯升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);干預(yù)后,POF及MS大鼠補佳樂組、坤泰組較模型組中E2均升高,而FSH、LH有所降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。POF:坤泰組大鼠血清E2較補佳樂組升高更顯著,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MS坤泰組:大鼠血清E2、FSH、LH變化較補佳樂組,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠FSH、LH、E2測定

2.6 各組大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較 IL-6、TNF-α是坤泰膠囊異病同治POF和MS共有靶點。與空白組(假手術(shù)組)比較,POF及MS模型組大鼠血清IL-6、TNF-α水平明顯上升(均P<0.05);而藥物干預(yù)后,POF及MS中坤泰膠囊組大鼠血清中IL-6、TNF-α水平均較模型組均下降(P<0.05)。見圖5。

圖5 POF與MS大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較注:與空白組(假手術(shù)組)比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05

3 討論

異病同治作為中醫(yī)特色治病法則,不著眼于疾病的異同,而是重視疾病的病機及辨證,即可以針對辨證、病機相同或相似的不同疾病采取相同的治療方法或用藥。從異病同治理論,借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析坤泰膠囊治療POF和MS作用機制,是中醫(yī)藥守正創(chuàng)新的體現(xiàn),也是基于生物網(wǎng)絡(luò)技術(shù)對不同疾病共有靶點及信號通路等分子機制的探索。POF與MS病因病機及臨床表現(xiàn)有相似之處。POF是指胞宮功能未老先衰,先天腎氣虧虛或后天因素導(dǎo)致腎虛精虧、天癸不足為其根本,肝郁氣滯、脾虛失運、瘀血阻滯是其常見病機[9],諸多因素導(dǎo)致腎-天癸-沖任-胞宮軸功能失調(diào),從而出現(xiàn)經(jīng)水早絕甚至不孕。而MS病機是以腎虛為本,腎的陰陽平衡失調(diào)影響到心、肝、脾,從而出現(xiàn)一系列病理變化,POF及MS病位都在沖任、胞宮,與肝、腎密切相關(guān)。坤泰膠囊主要功效為養(yǎng)血滋陰,益髓補精、調(diào)節(jié)陰陽平衡,故可用于治療POF和MS的共同研究。

本研究獲得坤泰膠囊活性成分主要有黃芩黃酮、表小檗堿、L-賴氨酸、谷甾醇及氧化小檗堿等。其中表小檗堿、氧化小檗堿均屬于生物堿類化合物,為黃芩和黃連的共有成分,研究顯示,該類化合物可通過AKT、ERK通路、p53/Bax凋亡通路發(fā)揮抗腫瘤、抗炎、抗氧化的作用[10]。而谷甾醇則具有雌激素樣活性,可促進卵巢顆粒細胞產(chǎn)生雌激素,并與骨細胞膜雌激素受體結(jié)合加強成骨,對POF或絕經(jīng)后骨代謝失衡具有調(diào)節(jié)作用[11]。研究獲取坤泰膠囊治療POF和MS共有靶點128個。拓撲分析篩選出核心靶點GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、SRC(原癌基因酪氨酸受體激酶)、IL-6(白細胞介素-6)、TNF(腫瘤壞死因子)、ESR1(雌激素受體1)、AKT1(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)等,分別與腫瘤的發(fā)生、細胞增殖與分化、存活和侵襲細胞增殖與凋亡、免疫調(diào)節(jié)、血管生成等機制有關(guān)。其中,GAPDH是糖酵解的關(guān)鍵酶,對氧化修飾敏感,并通過細胞核中的Sirt1(沉默信息調(diào)節(jié)因子1)/p53通路參與凋亡信號,上調(diào)GAPDH表達來減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的周期細胞凋亡[12]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)AKT1、TNF、IL-6、EGFR等靶點參與卵巢生殖細胞的生長、發(fā)育與卵泡凋亡等過程,當(dāng)其異常表達時可促進細胞異常增殖,導(dǎo)致卵泡成熟障礙及卵泡凋亡[13],卵泡池過早耗竭出現(xiàn)POF或造成更年期綜合征的發(fā)生[14-15]。TNF-α基因308G/A位點多態(tài)性與TNF-α表達水平有關(guān),且不同基因型POF患者TNF-α水平之間存在很大差異,可能是導(dǎo)致POF的主要遺傳易感基因[16]。研究證實,當(dāng)機體雌激素水平下降時,Th17細胞被過度激活,而IL-6、TNF等炎癥介質(zhì)可誘導(dǎo)CD4+T細胞分化為Th17,從而誘發(fā)免疫性POF發(fā)生[17-18]。本研究采用實驗研究表明坤泰膠囊能夠改善POF及MS模型大鼠性激素水平,同時可有效降低模型大鼠血清IL-6及TNF-α水平。

KEGG富集分析結(jié)果顯示坤泰膠囊異病同治POF和MS主要涉及癌癥相關(guān)通路、胰腺癌信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-AKT信號通路、TNF信號通路等。研究顯示,PI3K-AKT信號通路可參與POF及絕經(jīng)等卵巢相關(guān)疾病的發(fā)生,其通路中的相關(guān)因子可參與調(diào)節(jié)卵母細胞生長、原始卵泡發(fā)育以及顆粒細胞的增殖、分化和遷移,如PI3K-AKT過度激活可使原始卵泡提前發(fā)育、卵泡過快凋亡,從而出現(xiàn)卵泡閉鎖、功能衰退[19-20]。HIF-1α信號通路是缺氧相關(guān)性自噬的重要通路,HIF-1α可通過調(diào)節(jié)下游血管內(nèi)皮生長因子,調(diào)節(jié)卵泡中血管發(fā)育參與卵泡發(fā)育、衰老過程,其水平高低與卵泡發(fā)育水平負相關(guān)[21]。缺氧條件可產(chǎn)生活性氧,引起氧化應(yīng)激,激活卵巢細胞自噬從而維持細胞存活與增殖,長時間可誘導(dǎo)顆粒細胞和卵母細胞自噬、凋亡和壞死導(dǎo)致卵母細胞質(zhì)量及數(shù)量下降、卵泡閉鎖[22]。該通路還參與了小鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的病理過程,抑制HIF-1α信號通路可改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的嚴重程度,推測絕經(jīng)后骨組織破骨細胞中HIF-1α上調(diào)與蛋白激酶B、胞外信號調(diào)節(jié)激酶和核因子κB信號通路中某條或幾條聯(lián)合作用有關(guān)[23]。而TNF信號通路是核心炎癥信號通路,已知顆粒細胞既是TNF-α的來源器官,也是TNF-α的靶器官,可顯著降低顆粒細胞在促卵泡素刺激下的分化以及卵泡成熟期間對黃體生成素的反應(yīng),在顆粒細胞凋亡和分化過程中發(fā)揮著重要作用[24]。雌激素可調(diào)控卵泡細胞生長、發(fā)育和分化等多種生理過程,雌激素信號通路是雌激素與細胞核中的雌激素受體結(jié)合,作用于雌激素受體反應(yīng)元件調(diào)節(jié)基因表達,從而改變細胞功能,對女性卵巢及生殖功能至關(guān)重要,同時可激活PI3K信號通路發(fā)揮相關(guān)生理作用[25]。既往從臨床觀察及實驗研究都證實了坤泰膠囊治療POF和MS效果明確,且在一定程度上驗證了本研究中所篩選出的一些靶點和通路。

綜上所述,坤泰膠囊治療POF和MS是涉及多成分、多靶點、多通路的復(fù)雜過程,其主要成分包含表小檗堿、谷甾醇、氧化小檗堿,涉及GAPDH、SRC、IL-6、TNF等核心靶點,參與調(diào)控PI3K-AKT、TNF及HIF-1α等信號通路。但坤泰膠囊異病同治作用機制是否涉及癌癥相關(guān)通路、胰腺癌及癌癥的中樞碳代謝等信號通路仍需要進一步研究和實驗驗證。

利益沖突聲明:無。