王帥 馮宇梅 白苗 杜維俊 岳愛琴

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，太谷 030801）

萜類化合物是植物中一類重要的次生代謝產(chǎn)物，不僅影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，而且在響應(yīng)逆境脅迫等過程中發(fā)揮積極作用［1］。在高等植物中，萜類化合物主要通過2條途徑合成，即甲羥戊酸（mevalonate，MVA）途徑和磷酸甲基赤蘚糖（2-C-methyl-D-erythritol-4-phophate，MEP）途徑［2-3］。由3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutary-CoA reductase，HMGR）催化的反應(yīng)是MVA途徑的主要限速步驟，負(fù)責(zé)催化3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA，HMG-CoA）生成MVA，該反應(yīng)不可逆，是萜類合成的一個(gè)重要調(diào)控位點(diǎn)［4-5］，影響眾多萜類化合物（包括甾醇、植物激素、三萜皂苷等）的生物合成，進(jìn)而影響植物與環(huán)境間的相互作用［6-7］。

HMGR基因作為MVA途徑的關(guān)鍵酶基因，已在多種植物中被克隆和表征，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）［8］、銀杏（Ginkgo biloba）［9］、甜瓜（Cucum ismelo）［10］、棉花（Gossypium）［11］、人參（Panax ginseng）［12］等。與動(dòng)物單個(gè)HMGR基因相比，植物HMGR基因一般以基因家族的形式存在，其不同的成員在空間和時(shí)間上表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，并且在響應(yīng)外源激素誘導(dǎo)以及應(yīng)對(duì)脅迫中發(fā)揮不同功能［12-14］。如擬南芥含有2個(gè)HMGR基因，但其表達(dá)模式不同，AtHMGR1的表達(dá)受光照調(diào)控，并且AtHMGR1缺失突變體表現(xiàn)出矮化、早衰等表型，而AtHMGR2缺失突變體在正常生長(zhǎng)條件下無異常表型［8,15］。銀杏GbHMGR2與GbHMGR3對(duì)冷、暗、茉莉酸甲酯（MeJA）、脫落酸（ABA）、水楊酸（SA）和乙烯利（Eth）處理均有響應(yīng)［9］。蘋果（Malus domestica）MdHMGR2對(duì)果實(shí)發(fā)育和Eth敏感，而MdHMGR5的異源表達(dá)激活了擬南芥抗氧化系統(tǒng)，增強(qiáng)了植物對(duì)氧化應(yīng)激的耐受能力［13,16］。此外，外源MeJA誘導(dǎo)青蒿（Artemisia annua）AaHMGR1的表達(dá)，而對(duì)AaHMGR2和AaHMGR3影響較?。?7］。

課題組前期從大豆（Glycine max）中成功克隆了8個(gè)HMGR基因，命名為GmHMGR1-GmHMGR8，它們?cè)诖蠖垢鱾€(gè)組織表達(dá)不同，并且GmHMGR基因的啟動(dòng)子中具有多種脅迫及激素響應(yīng)元件［18］。但是關(guān)于大豆GmHMGR基因家族成員是否響應(yīng)外源激素及非生物脅迫還不清楚。

本研究分析GmHMGR1-GmHMGR8在大豆不同逆境脅迫及外源激素誘導(dǎo)下的表達(dá)模式；在釀酒酵母中異源表達(dá)分析該基因家族的不同成員，在鹽脅迫與氧化脅迫下的抗逆能力；并研究擬南芥過量表達(dá)GmHMGR4與GmHMGR6株系在氧化脅迫與鹽脅迫下的抗逆表型，為大豆抗氧化、抗鹽機(jī)制解析和分子育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以山西農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新課題組提供的武鄉(xiāng)小黑豆為供試材料。pYES2載體購(gòu)自北京華越洋生物科技有限公司；pC3300s載體購(gòu)自武漢天問生物科技有限公司。INVScI酵母菌株購(gòu)于上?？吕咨锟萍加邢薰?；擬南芥哥倫比亞生態(tài)型（Col-0）購(gòu)自武漢天問生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)于NEB有限公司；甲基紫精（MV）購(gòu)于西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 方法

1.2.1GmHMGR基因?qū)Ψ巧锩{迫和外源激素處理的表達(dá)分析 大豆材料種植于Hoagland & Arnon營(yíng)養(yǎng)液中，置于光照培養(yǎng)箱中（光照16 h，黑暗8 h，25℃）培養(yǎng)15 d，至三葉完全展開后，選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的大豆幼苗進(jìn)行非生物脅迫及外源激素處理。將幼苗分別置于含100 mmol/L PEG6000、150 mmol/L NaCl、330 mmol/L H2O2的營(yíng)養(yǎng)液中模擬干旱、鹽及氧化脅迫；將450 μmol/L MeJA、200 μmol/L ABA溶液噴施在幼苗葉片至充分濕潤(rùn)進(jìn)行外源激素誘導(dǎo)。以上各組處理均在處理后0、3、6、12、24和48 h取大豆幼苗根、葉，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

提取大豆幼苗總RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)前期獲得的GmHMGR1-GmHMGR8序列設(shè)計(jì)特異性引物（表1），以GmActin作為內(nèi)參基因。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用全式金公司TransStart?Tip Green qPCR SuperMix試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR。采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，數(shù)據(jù)為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量引物序列Table 1 Primers sequences by real-time quantitative PCR

1.2.2 pYES2重組表達(dá)酵母的構(gòu)建與抗逆分析 根據(jù)GmHMGR1-GmHMGR8序列，分別設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)酶切后分別與pYES2表達(dá)載體連接，經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證后，轉(zhuǎn)化至野生型INVScI酵母菌株。將轉(zhuǎn)化成功的酵母菌株培養(yǎng)至OD600=1時(shí)，稀釋10、100、1 000和10 000倍，分別吸取5 μL菌液點(diǎn)樣至YPDA培養(yǎng)基（分別含H2O2濃度為7.0和8.0 mmol/L，NaCl濃度為0.9和1.0mol/L），30℃倒置培養(yǎng)3-5 d，觀察酵母生長(zhǎng)狀況。

1.2.3 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化與抗逆分析

1.2.3.1 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化 構(gòu)建重組質(zhì)粒pC3300s:GmHMGR4與pC3300s:GmHMGR6，隨后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101，通過浸花法侵染擬南芥Col-0，單株收取T0種子，利用含有草銨膦的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)獲得T3。提取幼苗葉片基因組DNA為模板，利用引物Bar F（5'-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3'）與Bar R（5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3'）進(jìn)行PCR檢測(cè)；同時(shí)提取幼苗葉片RNA，利用引物qPCR-GmHMGR4與qPCR-GmHMGR6進(jìn)行qPCR檢測(cè)。

1.2.3.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥中萜類合成相關(guān)基因的表達(dá)分析 根據(jù)NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢擬南芥萜類合成相關(guān)基因1-脫氧-D-木糖醇-5-磷酸合成酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase，DXS）基因AtDXS、1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶（1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase，DXR）基因AtDXR、角鯊烯合酶（Squalene synthase，SQS）基因AtSQS1和AtSQS2、環(huán)阿屯醇合成酶（cycloartenol synthase，CAS）基因AtCAS、異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶（isopentenyl diphosphate isomerases，IPI）基因AtIPI的序列設(shè)計(jì)特異性引物（表1），以AtActin為內(nèi)參基因，以T3轉(zhuǎn)基因擬南芥株系cDNA為qPCR模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增，數(shù)據(jù)為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。

1.2.3.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗逆分析 在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，將擬南芥幼苗移栽至土壤基質(zhì)中。生長(zhǎng)發(fā)育4周后，選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的幼苗分組進(jìn)行氧化及鹽脅迫處理。氧化脅迫處理組每隔24 h噴施5 μmol/L甲基紫精（MV）至葉片充分濕潤(rùn)，24 h后取葉片進(jìn)行NBT染色，72 h后拍照觀察表型。鹽脅迫處理組澆灌300 mmol/L NaCl進(jìn)行一周脅迫處理，拍照觀察表型，并對(duì)葉片進(jìn)行NBT染色。使用Image J 1.53軟件測(cè)量每株擬南芥蓮座葉直徑，并統(tǒng)計(jì)NBT染色面積百分比［19］。根據(jù)Zhang等［13］方法，取擬南芥葉片測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率，計(jì)算葉片損傷度，葉片損傷度計(jì)算方法為：（Lt-Lck）/（1-Lck）×100%，其中，Lt和Lck分別為處理（t）和對(duì)照（ck）葉片的相對(duì)電導(dǎo)率。使用丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）、過氧化氫酶（catalase，CAT）測(cè)定試劑盒、過氧化物酶（peroxidase，POD）測(cè)定試劑盒（南京建成有限公司）測(cè)定葉片的MDA含量以及CAT、POD的活性。各組設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 大豆GmHMGR基因的表達(dá)分析

2.1.1 大豆GmHMGR基因?qū)Ψ巧锩{迫的響應(yīng) 將大豆葉和根進(jìn)行PEG6000、NaCl和H2O2非生物脅迫處理，運(yùn)用RT-qPCR分析GmHMGR1-GmHMGR8的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在PEG6000脅迫處理下，GmHMGR1-GmHMGR8在葉中的相對(duì)表達(dá)量均呈先上升后下降的趨勢(shì)，而在根中，PEG6000脅迫6和12 h后，GmHMGR2和GmHMGR6的表達(dá)量顯著上調(diào)并達(dá)到峰值（圖1-A）。在NaCl脅迫處理下，GmHMGR1和GmHMGR4的相對(duì)表達(dá)量在葉與根均受到顯著上調(diào)，NaCl脅迫24 h后，GmHMGR4的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值（圖1-B）。在H2O2脅迫處理下，葉與根中GmHMGR基因表達(dá)量變化趨勢(shì)不同，在葉中，GmHMGR1-GmHMGR8在H2O2處理后3 h均顯著上調(diào)，H2O2脅迫48 h后，GmHMGR8的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高；在根中，GmHMGR基因整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中，GmHMGR4的相對(duì)表達(dá)量達(dá)在H2O2處理后24 h達(dá)到峰值（圖1-C）。結(jié)果表明，GmHMGR基因?qū)EG6000、NaCl和H2O2脅迫處理均有響應(yīng)。

圖1 非生物脅迫下大豆GmHMGR基因的表達(dá)模式分析Fig.1 Expression patterns of GmHMGR gene in response to abiotic stress in soybean

2.1.2 大豆GmHMGR基因?qū)ν庠醇に氐捻憫?yīng) 將大豆葉進(jìn)行噴施外源植物激素MeJA和ABA處理，運(yùn)用RT-qPCR分析GmHMGR1-GmHMGR8的表達(dá)情況。在噴施外源植物激素MeJA后，GmHMGR1-GmHMGR6在葉中的表達(dá)量顯著上調(diào)，在3 h表達(dá)水平達(dá)到最高值，而GmHMGR7和GmHMGR8的表達(dá)量在6 h后顯著降低。而在根中，除GmHMGR1和GmHMGR5外，其余GmHMGR基因的表達(dá)出現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)（圖2-A）。在ABA處理下，除GmHMGR8外，其余GmHMGR基因在葉中的表達(dá)量均顯著上調(diào)，其中GmHMGR4的表達(dá)量在6 h時(shí)達(dá)到最高水平，約為對(duì)照的8.1倍，差異顯著；在根中GmHMGR基因的表達(dá)均受到一定程度抑制，其中GmHMGR8在ABA處理3 h后顯著上調(diào)，隨后又顯著下調(diào)并低于對(duì)照（圖2-B）。結(jié)果表明，GmHMGR基因?qū)eJA和ABA激素處理有響應(yīng)。

圖2 激素處理后大豆GmHMGR基因的表達(dá)模式分析Fig.2 Expression patterns of GmHMGR gene in response to hormone treatment in soybean

2.2 GmHMGR基因在轉(zhuǎn)基因酵母中的抗逆性分析

為了檢測(cè)轉(zhuǎn)GmHMGR基因酵母的抗氧化能力，將轉(zhuǎn)基因酵母點(diǎn)樣至YPDA培養(yǎng)基（7.0和8.0 mmol/L H2O2），觀察酵母生長(zhǎng)狀況。在7.0 mmol/L H2O2濃度下，與對(duì)照相比，過量表達(dá)GmHMGR1、GmHMGR3、GmHMGR5、GmHMGR6和GmHMGR7的酵母長(zhǎng)勢(shì)好；在8.0 mmol/L H2O2濃度下，對(duì)照酵母已經(jīng)不再生長(zhǎng)，而過量表達(dá)GmHMGR1、GmHMGR3、GmHMGR5、GmHMGR6和GmHMGR7的酵母還可以繼續(xù)生長(zhǎng)（圖3-A）。將轉(zhuǎn)基因酵母點(diǎn)樣至YPDA培養(yǎng)基（0.9和1.0 mol/L NaCl），觀察酵母生長(zhǎng)狀況。在0.9 mol/L NaCl脅迫下，除過量表達(dá)GmHMGR8的酵母外，其余轉(zhuǎn)基因酵母均比對(duì)照長(zhǎng)勢(shì)好，當(dāng)NaCl濃度增至1.0 mol/L時(shí)，對(duì)照酵母已不能生長(zhǎng)，而過量表達(dá)GmHMGR1、GmHMGR3、GmHMGR4、GmHMGR5、GmHMGR6和GmHMGR7酵母則仍能生長(zhǎng)（圖3-B）。結(jié)果表明，過量表達(dá)GmHMGR1、GmHMGR3、GmHMGR5、GmHMGR6和GmHMGR7可以增加酵母的抗氧化和抗鹽能力，并且不同的GmHMGR基因，其抗氧化與抗鹽能力也有差異。

圖3 不同脅迫下過量表達(dá)酵母的生長(zhǎng)情況Fig.3 Growth of overexpressed yeast under different stress

2.3 轉(zhuǎn)GmHMGR4與GmHMGR6擬南芥的抗逆性分析

2.3.1 轉(zhuǎn)GmHMGR4與GmHMGR6植株的獲得 在非生物脅迫處理后，GmHMGR4和GmHMGR6的表達(dá)水平均有不同程度的升高，并且GmHMGR4和GmHMGR6編碼的蛋白具有HMGR的典型結(jié)構(gòu)，通過對(duì)轉(zhuǎn)GmHMGR4和GmHMGR6擬南芥純合株系進(jìn)行抗逆性鑒定。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因株系中均擴(kuò)增出約270 bp的Bar條帶，而野生型（WT）和陰性對(duì)照均無相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物（圖4-A）。RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，GmHMGR4和GmHMGR6在5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中均有不同程度的表達(dá)，且表達(dá)水平顯著高于野生型對(duì)照植株（圖4-B-C）。因此，分別選取OE4-1、OE4-2、OE4-3以及OE6-1、OE6-2、OE6-3株系進(jìn)行后續(xù)表型觀察與分析。

圖4 T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定Fig.4 Identification of T3 transgenic A.thaliana

2.3.2 轉(zhuǎn)GmHMGR4和GmHMGR6擬南芥中萜類代謝途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)分析 為了研究過量表達(dá)GmHMGR4和GmHMGR6對(duì)擬南芥植物萜類代謝途徑中相關(guān)基因表達(dá)水平的影響，測(cè)定轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中MEP途徑基因關(guān)鍵酶基因AtDXS和AtDXR，MVA途徑關(guān)鍵酶基因AtSQS1、AtSQS2、AtCAS，以及AtIPI的表達(dá)水平。結(jié)果表明，除OE6-3株系外，所有轉(zhuǎn)基因植株中AtDXS、AtDXR、AtCAS、AtSQS1、AtSQS2表達(dá)量均顯著高于野生型植株。而在OE4-1、OE4-2株系中，AtIPI的表達(dá)量顯著高于野生型，其余株系無顯著變化（圖5）。結(jié)果表明，GmHMGR4與GmHMGR6的過表達(dá)增加了擬南芥中萜類代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)水平。

圖5 萜類化合物合成相關(guān)基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)分析Fig.5 Expression analysis of terpenoid synthesis-related genes in transgenic A.thaliana

2.3.3 不同脅迫下轉(zhuǎn)GmHMGR4和GmHMGR6擬南芥的表型分析 在正常培養(yǎng)條件下，野生型與轉(zhuǎn)GmHMGR4和GmHMGR6擬南芥生長(zhǎng)狀況一致，蓮座直徑大小無顯著差異（圖6-A-B）。在氧化脅迫（5 μmol/L MV）處理后發(fā)現(xiàn)，野生型植株葉片發(fā)生萎蔫失綠，而轉(zhuǎn)基因植株葉片發(fā)生輕微卷曲，生長(zhǎng)狀態(tài)良好（圖6-A）。在鹽脅迫（300 mmol/L NaCl）處理后，野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片的發(fā)育均受到一定程度抑制，但野生型植株的葉片較轉(zhuǎn)基因株系發(fā)育緩慢（圖6-A），轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的蓮座直徑大小均顯著高于野生型（圖6-B）。此外，與對(duì)照組相比，在脅迫處理后野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥相對(duì)電導(dǎo)率與MDA含量均發(fā)生上調(diào)。在氧化脅迫處理后，過量表達(dá)GmHMGR4和GmHMGR6擬南芥株系的相對(duì)電導(dǎo)率和葉片損傷度均顯著低于野生型（圖6-C-D），且轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的MDA含量也顯著低于野生型（圖6-E）。在鹽脅迫處理后，與野生型擬南芥相比轉(zhuǎn)基因株系的相對(duì)電導(dǎo)率與葉片損傷度差異不顯著（圖6-C-D），而轉(zhuǎn)基因擬南芥中，除OE4-1外，其余株系的MDA含量均顯著低于野生型（圖6-E）。結(jié)果表明，過量表達(dá)GmHMGR4與GmHMGR6增強(qiáng)了擬南芥抗氧化與抗鹽能力。2.3.4 不同脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥ROS的積累與抗逆性分析 對(duì)氧化脅迫24 h與鹽脅迫一周后的擬南芥葉片進(jìn)行NBT染色，結(jié)果顯示，與氧化脅迫下的野生型植株相比，轉(zhuǎn)基因植株的葉片顏色較淺，染色面積百分比均低于野生型，而在鹽脅迫處理后，過量表達(dá)GmHMGR4擬南芥株系的染色面積百分比低于野生型（圖7-A-B）。進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥CAT與POD的活性進(jìn)行分析，在正常條件下轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的CAT與POD活性無顯著差異；在氧化脅迫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的CAT的活性均上升并顯著高于野生型，而POD活性沒有差異（圖7-CD）。在鹽脅迫處理后，只有過量表達(dá)GmHMGR6株系的CAT活性顯著高于野生型（圖7-C），而OE4-1、OE6-1與OE6-3的POD活性顯著低于野生型，其余過表達(dá)株系無顯著變化（圖7-D）。說明過量表達(dá)GmHMGR4與GmHMGR6提高了擬南芥ROS的清除能力。

圖6 氧化和鹽脅迫后轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型分析Fig.6 Phenotypic analysis of transgenic A.thaliana after oxidative treatment and salt stress

圖7 氧化和鹽脅迫處理后擬南芥的抗逆能力分析Fig.7 Stress-resistant ability analysis of transgenic A.thaliana after oxidative treatment and salt stress

3 討論

萜類化合物，也稱為類異戊二烯，是存在于植物中的一類天然產(chǎn)物，在大多數(shù)植物中可以調(diào)節(jié)植物與環(huán)境相互作用［20］。大豆中倍半萜、三萜皂苷、甾醇等的異戊二烯單元通常由MVA途徑產(chǎn)生。HMGR作為MVA途徑中的主要限速酶，在植物的發(fā)育及響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮積極作用。根據(jù)相關(guān)報(bào)道，HMGR基因的轉(zhuǎn)錄水平影響植物的株高、根長(zhǎng)、雄配子體發(fā)育、種子的萌發(fā)、豆莢大小及根瘤的形成等［8,21-25］，此外，煙草過量表達(dá)杜梨PbHMGR提高了轉(zhuǎn)基因煙草種子的耐鹽性［26］，蘋果MdHMGR5在擬南芥中的過表達(dá)增強(qiáng)了擬南芥的抗氧化能力［13］。許多HMGR基因的啟動(dòng)子區(qū)域包含多個(gè)順式作用元件，在應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫的調(diào)控中發(fā)揮重要功能。如在蘋果HMGR基因家族各成員的啟動(dòng)子中存在各種順式作用元件，Eth、MeJA和SA顯著誘導(dǎo)MdHMGR2和MdHMGR4的表達(dá)［27-28］，而AtHMGR受蛋白磷酸酶2A（PP2A）的調(diào)控從而在擬南芥植物應(yīng)對(duì)脅迫中發(fā)揮重要作用［29］。以上結(jié)果表明，不同物種中HMGR基因在逆境響應(yīng)過程中存在差異。山西農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大豆中具有8個(gè)HMGR基因，分別命名為GmHMGR1-GmHMGR8。本研究表明GmHMGR基因家族的各成員在PEG6000、NaCl和H2O2脅迫處理后的葉與根中表達(dá)量發(fā)生了不同程度的上調(diào)，其中，GmHMGR4在NaCl脅迫處理后的葉與根中相對(duì)表達(dá)量的均顯著上調(diào)，并且在H2O2處理后根中其相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照的65倍。此外，GmHMGR2、GmHMGR4、GmHMGR6受到MeJA的誘導(dǎo)，而ABA處理后的葉中GmHMGR1-GmHMGR7的表達(dá)顯著上調(diào)。以上結(jié)果表明，GmHMGR基因在響應(yīng)非生物脅迫及外源激素誘導(dǎo)中發(fā)揮重要功能。另外，過量表達(dá)GmHMGR1、GmHMGR3、GmHMGR5、GmHMGR6、GmHMGR7酵母在脅迫條件下生長(zhǎng)情況良好。表明GmHMGR基因家族不同成員在大豆抵抗逆境脅迫中發(fā)揮的功能不同。

前人研究表明HMGR表達(dá)水平的改變通常會(huì)導(dǎo)致類異戊二烯的含量變化，進(jìn)而影響植物的發(fā)育及其對(duì)逆境的耐受能力［30-31］。如在丹參（Salvia miltiorrhiza）毛狀根中過量表達(dá)SmHMGR2增加了毛狀根中丹參酮和角鯊烯的含量［32］，煙草中過量表達(dá)HbHMGR導(dǎo)致煙草種子中總甾醇的積累增加了2.5倍［33］。根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步在擬南芥中過量表達(dá)GmHMGR4與GmHMGR6，研究其在植物抗逆過程中的作用機(jī)制。RT-qPCR結(jié)果表明，過量表達(dá)GmHMGR4與GmHMGR6不僅提高了擬南芥AtSQS1和AtSQS2的表達(dá)水平，而且也顯著提高了甾醇代謝的關(guān)鍵酶基因AtCAS的表達(dá)量，表明GmHMGR基因的過量表達(dá)激活了類異戊二烯途徑中的下游基因轉(zhuǎn)錄，繼而共同調(diào)節(jié)擬南芥萜類的代謝通量。此外，MEP途徑AtDXR基因的表達(dá)也顯著提高，表明擬南芥MVA途徑與MEP途徑間可能存在串?dāng)_，與之前的研究結(jié)果相同［34］。相對(duì)電導(dǎo)率、葉片損傷度與MDA含量是植物反應(yīng)細(xì)胞膜損傷程度的重要指標(biāo)［35］，轉(zhuǎn)GmHMGR4與GmHMGR6擬南芥植株在氧化脅迫下的相對(duì)電導(dǎo)率、葉片損傷度與MDA含量均顯著低于野生型，表明GmHMGR4與GmHMGR6在擬南芥中過量表達(dá)可以緩解氧化脅迫過程中細(xì)胞膜的損傷，增強(qiáng)植株的抗氧化能力。而在NaCl處理后，轉(zhuǎn)基因擬南芥的相對(duì)電導(dǎo)率、葉片損傷度與野生型無顯著差異，但MDA含量低于野生型擬南芥，差異顯著。說明GmHMGR4與GmHMGR6參與轉(zhuǎn)基因擬南芥鹽脅迫響應(yīng)過程。植物在脅迫條件下會(huì)產(chǎn)生ROS，而ROS過量積累會(huì)破壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生損傷，進(jìn)而影響植物生長(zhǎng)發(fā)育［35］。毛果楊（Populus trichocarpa）中PtHMGR的過表達(dá)上調(diào)了ROS清除相關(guān)基因的表達(dá)，并且提高了ABA合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平和ABA的含量，進(jìn)而影響了毛果楊的抗逆能力［36］。芥菜MVA途徑相關(guān)基因BjHMGS的過表達(dá)增加了轉(zhuǎn)基因擬南芥甾醇的含量并提高了其脅迫耐受性［37］。并且一些研究表明揮發(fā)性類異戊二烯可以通過調(diào)節(jié)植物的氧化狀態(tài)來減輕氧化應(yīng)激的影響［38-40］。在本研究中，過量表達(dá)GmHMGR4和GmHMGR6擬南芥類異戊二烯途徑重要酶基因的表達(dá)水平高于野生型，差異顯著。在氧化脅迫后轉(zhuǎn)基因擬南芥的ROS積累量低于野生型，并且其CAT活性顯著高于野生型植株。推測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥中GmHMGR4和GmHMGR6的過表達(dá)通過影響激素代謝水平以及抗逆相關(guān)異戊二烯產(chǎn)物的代謝通量，進(jìn)而激活擬南芥抗氧化系統(tǒng)，避免了ROS過量產(chǎn)生引起的嚴(yán)重氧化損傷，具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。而在NaCl脅迫下，僅轉(zhuǎn)GmHMGR6株系的CAT活性顯著高于野生型，這可能是不同GmHMGR基因在不同脅迫下發(fā)揮的功能上的差異，說明GmHMGR6在擬南芥抵抗鹽脅迫中發(fā)揮更重要的功能。

4 結(jié)論

大豆GmHMGR基因?qū)Σ煌巧锩{迫以及激素處理均有響應(yīng)；不同的GmHMGR基因在酵母中的抗氧化與抗鹽能力有差異；過量表達(dá)GmHMGR4與GmHMGR6增強(qiáng)擬南芥的抗氧化與抗鹽能力；表明GmHMGR基因家族可能在大豆響應(yīng)氧化和鹽脅迫中發(fā)揮重要作用。