李宇 李素貞 陳茹梅 盧海強

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，保定 071000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

鐵是植物生長發(fā)育所必需的微量營養(yǎng)元素，其作為重要的輔因子在植物體的各種重要的代謝過程中發(fā)揮作用，如光合作用、呼吸作用、荷爾蒙的合成及固氮作用等［1］。植物缺鐵會帶來產(chǎn)量和品質(zhì)下降等問題，嚴(yán)重缺乏時甚至?xí)?dǎo)致作物絕產(chǎn)［2］。植物中鐵過量也會對植物生長造成危害，鐵在植物體內(nèi)過量積累會引起鐵中毒，表現(xiàn)為生理代謝失調(diào)、生長發(fā)育受阻。因此，植物中鐵的攝取與平衡必須受到嚴(yán)格的控制，來滿足其生長供應(yīng)與需求。

鐵在土壤中的含量豐富，植物可以從土壤中獲得鐵，但是植物從土壤中攝取鐵的能力是有限的，主要原因是鐵以三價鐵及磷酸鹽形式存在，在堿性土壤中尤為明顯。植物應(yīng)答缺鐵條件形成了兩種鐵的吸收機制：機制I和機制Ⅱ［3-4］。機制I和機制Ⅱ的主要區(qū)別是機制I吸收Fe2+，而機制Ⅱ是以螯合的策略吸收Fe3+。雙子葉植物及非禾本科單子葉植物利用機制I吸收鐵，禾本科植物利用機制Ⅱ吸收鐵［5］。機制I植物吸收鐵的主要過程：植物先向根際分泌酚類物質(zhì)或氫離子來酸化土壤增加鐵的溶解性［6］，隨后鐵還原酶FRO（Fe3+-chelate reductase）基因?qū)e3+還原為Fe2+，最后通過Fe2+轉(zhuǎn)運蛋白IRT1/IRT2（iron-regulated transporter）［7］將其轉(zhuǎn)運至植物體內(nèi)細(xì)胞以滿足植物生長發(fā)育需要［8］。機制Ⅱ是基于螯合策略，首先在植物根細(xì)胞中經(jīng)過一系列反應(yīng)合成麥根酸類物質(zhì)PS（phytosiderophores），麥根酸轉(zhuǎn)運蛋白TOM1（transporter of mugineic acid family phytosiderophores 1）將PS轉(zhuǎn)運至根際，與土壤中的Fe3+螯合形成Fe3+-PS復(fù)合物，黃色條紋蛋白YSL（yellow stripe）將Fe3+-PS螯合物轉(zhuǎn)運至細(xì)胞內(nèi)［9］。兩種機制均由復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)精準(zhǔn)調(diào)控，這些調(diào)控網(wǎng)絡(luò)由多種轉(zhuǎn)錄因子組成，其中堿性螺旋-環(huán)-螺旋bHLH（basic halix-loop-halix）家族的成員發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［10］。

本文以依賴兩種不同鐵吸收策略調(diào)控體內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的擬南芥和水稻為例，對二者中的相關(guān)bHLH轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控鐵穩(wěn)態(tài)作用中的最新研究進展進行總結(jié)、討論，以期能夠提高我們對植物控制鐵元素動態(tài)平衡這一復(fù)雜機制的理解。

1 bHLH轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征

bHLH家族是植物中較大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，亞族豐富［11］，擬南芥、水稻中的所有bHLH家族成員可分為32個亞族，其中擬南芥中包含的bHLH家族成員有162個，水稻中包含167個［12］。

bHLH蛋白是一個真核轉(zhuǎn)錄因子家族，調(diào)節(jié)與細(xì)胞分化和發(fā)育有關(guān)的一系列基因的表達［13］。bHLH家族以其高度保守的堿性/螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域命名，bHLH結(jié)構(gòu)域由大約60個氨基酸殘基組成，分為兩個區(qū)域，一個是堿性區(qū)，通常由13-17個氨基酸組成，位于氨基酸序列的N端，負(fù)責(zé)二聚化和參與DNA與E-box序列的結(jié)合［14］；另一個是由近40個氨基酸組成的HLH區(qū)域，位于氨基酸序列的C端，由兩個含有疏水殘基的α螺旋組成（圖1），需要二聚化來調(diào)控參與各種信號通路的靶基因的表達［15-16］。對bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特征的了解能幫助我們更好地理解bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控鐵缺乏基因的表達機理。

圖1 鐵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)主要蛋白bHLH結(jié)構(gòu)域Fig.1 Alignment of the bHLH domain of iron-regulated network main proteins

2 植物中調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的相關(guān)bHLH轉(zhuǎn)錄因子研究現(xiàn)狀

2.1 擬南芥中調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的bHLH家族

2.1.1 機制I的BTS感受器通路 擬南芥是典型的模式植物之一，利用機制I吸收鐵，并且bHLH家族成員在擬南芥中研究得比較多，尤其是參與缺鐵脅迫應(yīng)答的bHLH轉(zhuǎn)錄因子。到目前為止，在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)有屬于6個亞族的17個bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與鐵的平衡調(diào)節(jié)［17-18］，在應(yīng)對缺鐵脅迫時，同一亞族的轉(zhuǎn)錄因子往往發(fā)揮著相似的功能。

擬南芥缺鐵反應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的上游是E3連接酶基因BTS（brutus），BTS受缺鐵強烈誘導(dǎo)，是一種潛在的鐵傳感器，對鐵離子高度敏感，其能與鐵結(jié)合并且具有泛素化轉(zhuǎn)錄因子的功能［19］。在擬南芥以及其他一些雙子葉植物中，還存在著兩個與BTS部分功能冗余的E3泛素連接酶，BTSL1（Brutus-like 1）和BTSL2，C末端結(jié)構(gòu)域具有E3連接酶活性，在擬南芥體內(nèi)能促進類缺鐵所誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子AtbHLH29/FIT（fer-like Fe deficiency-induced transcription factor）的降解。BTSL1和BTSL2之間也存在相互協(xié)同調(diào)節(jié)，但不與BTS之間關(guān)聯(lián)［20］。BTS缺鐵響應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控，與參與鐵信號傳導(dǎo)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族IVc亞族的4個轉(zhuǎn)錄因子bHLH34、bHLH104、bHLH105/ILR3（iaa leucine resistant 3）和bHLH115直接相互作用，靶向IVc亞族轉(zhuǎn)錄因子在富鐵植物中降解，負(fù)向調(diào)節(jié)鐵的吸收，這對于防止過量鐵攝取至關(guān)重要［21］。

在對IVc亞族轉(zhuǎn)錄因子的功能進行研究時發(fā)現(xiàn)，在根中缺鐵時，除了ILR3，AtbHLH115、AtbHLH104和AtbHLH34也都被證明是鐵吸收的正調(diào)控因子，而ILR3和bHLH104是最關(guān)鍵的IVc轉(zhuǎn)錄因子亞族，相比較來說，bHLH115起到的作用較小，bHLH34似乎不參與地上部缺鐵反應(yīng)［22］。bhlh115表現(xiàn)出對缺鐵的敏感性，而bHLH115的過表達促進了鐵的積累，這表明bHLH115正向調(diào)控鐵缺乏反應(yīng)基因的表達［23］。bHLH104/105或bHLH34/105的同源或異源二聚體發(fā)揮著非冗余調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的作用，直接參與bHLH47/PYE（popeye）的調(diào)控［24］。bHLH34和bHLH104功能缺失的突變體中發(fā)生鐵缺乏反應(yīng)的中斷和植物體內(nèi)鐵含量減少的情況，而過表達植物則促進了鐵缺乏反應(yīng)相關(guān)基因的表達以及增加了植株鐵的積累量［23］。Li等［12］進一步分析表明，每一個IVc亞族bHLH轉(zhuǎn)錄因子成員都可以直接激活下游Ib亞族基因bHLH38/39/100/101和PYE的轉(zhuǎn)錄，它們擁有相似的功能。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明bHLH IVc亞族轉(zhuǎn)錄因子與bHLH121/URI（upstream regulator of IRT1）相互作用，并能夠促進其在細(xì)胞核的積累，共同激活I(lǐng)b亞族基因轉(zhuǎn)錄［25-26］。

研究發(fā)現(xiàn)bHLH121功能缺失突變會導(dǎo)致擬南芥嚴(yán)重的鐵缺乏癥狀，減少擬南芥體內(nèi)鐵的積累量，并擾亂與鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因的表達。過表達FIT有助于提高bhlh121的存活率。而且bHLH121具有DNA結(jié)合活性，可以與FIT和bHLH Ib基因的啟動子結(jié)合，但未發(fā)現(xiàn)它對這些基因具有直接的轉(zhuǎn)錄激活或抑制活性。bHLH121在bHLH IVc轉(zhuǎn)錄因子下游發(fā)揮作用，是bHLH IVc轉(zhuǎn)錄因子的直接靶點，其表達受缺鐵誘導(dǎo)，且依賴于bHLH IVc［17］。這些結(jié)果均表明，bHLH121與bHLH IVc轉(zhuǎn)錄因子一起正向調(diào)節(jié)FIT的表達，在維持?jǐn)M南芥中鐵的動態(tài)平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

遺傳分析表明，F(xiàn)IT是bHLH121的下游靶基因，屬于IIIa亞族，是擬南芥缺鐵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心轉(zhuǎn)錄因子［27］。FIT在根表皮受缺鐵誘導(dǎo)表達，fit表現(xiàn)出黃化表型，缺鐵時fit幼苗無法存活，約一半的缺鐵誘導(dǎo)基因在其根中表達下調(diào)，而鐵吸收關(guān)鍵基因FRO2和鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運蛋白IRT1（iron-regulated transporter 1）的表達量顯著降低［28］，這說明FIT對于擬南芥缺鐵應(yīng)答的調(diào)節(jié)是必需的。

在酵母細(xì)胞中表達FIT與Ib亞族的bHLH38/39/100/101中的任何一個可激活FRO2和IRT1啟動子驅(qū)動的GUS表達［29］，這表明FIT能與bHLH38/39/100/101中的任何一個形成異源二聚體直接調(diào)控FRO2和IRT1的表達來促進二價鐵的吸收。而進一步的分析表明，F(xiàn)RO2和IRT1在轉(zhuǎn)錄水平上不受調(diào)控，因為在缺鐵條件下FIT過表達植株中都檢測到了IRT1蛋白的積累和較高的FRO2的活性。與野生型相比過表達FIT和AtbHLH38/AtbHLH39的植株在地上部積累了更多的鐵［30］。以上這些結(jié)果表明FIT與Ib亞族的bHLH38/39/100/101互作形成異源二聚體來正調(diào)控下游的FRO2和IRT1，以促進擬南芥等機制I植物吸收鐵。在擬南芥中的突變研究表明，Ib bHLH轉(zhuǎn)錄因子亞族的成員bHLH100和bHLH101在功能上是冗余的，但它們可能通過激活不同的下游基因來調(diào)節(jié)鐵缺乏的反應(yīng)［15］，bHLH38和bHLH39也是這樣［16］，bHLH38/39與bHLH100/101之間盡管非常相似，但是它們之間仍存在著非冗余的功能。

PYE是根中柱鞘細(xì)胞中發(fā)揮重要作用的缺鐵響應(yīng)負(fù)調(diào)控因子。Long等［31］對PYE的功能分析表明，在缺鐵條件下，PYE對植物生長發(fā)育具有正向調(diào)節(jié)作用。染色質(zhì)免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)PYE能夠通過直接結(jié)合到煙酰胺合成酶NAS4（nicotianamine synthase 4）、FRO3、鋅誘導(dǎo)的促進因子ZIF1（zincinduced facilitator 1）的啟動子上，并下調(diào)其表達。PYE與bHLH104/105/115互作，下調(diào)鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因。通過CHIP-PCR實驗驗證，bHLH115直接激活bHLH38/39/100/101和PYE的轉(zhuǎn)錄，這表明bHLH34、AtbHLH104、bHLH105和bHLH115均參與了PYE調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在擬南芥鐵穩(wěn)態(tài)的維持中起著關(guān)鍵作用。

bHLH11也是調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的負(fù)調(diào)控因子，定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，隨著鐵缺乏的增加而表達量降低。共表達分析表明，IVc亞族bHLH轉(zhuǎn)錄因子促進了bHLH11的核積累。進一步分析表明，bHLH11抑制了IVc亞族bHLH轉(zhuǎn)錄因子對Ib亞族基因（bHLH38、bHLH39、bHLH100和bHLH101）的調(diào)控。bHLH11還作為FIT的負(fù)調(diào)控因子，抑制FIT在擬南芥中的表達［32］。這些結(jié)論表明bHLH11可以使植物避免鐵攝取過量而導(dǎo)致的鐵中毒問題。

2.1.2 機制I的植物激素信號通路 FIT作為擬南芥中響應(yīng)缺鐵脅迫網(wǎng)絡(luò)中最為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，參與多種響應(yīng)缺鐵信號通路的調(diào)節(jié)，是這些信號的調(diào)節(jié)中心。在調(diào)控鐵吸收過程中，大部分的FIT是以非活性的形式存在，只有小部分FIT被磷酸化，感知環(huán)境中鐵的增加［33］。在缺鐵條件下，植物體內(nèi)的Ca2+濃度增加，作為第二信使被類鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶b亞基蛋白CBL1（calcineurin-B-like Ca2+sensor protein 11）或CBL9檢測到，激活Ca2+誘導(dǎo)的絲氨酸蛋白激酶CIPK11（cbl-interacting protein kinase 11）將FIT-C端的Ser272處磷酸化，激活大量的FIT，并且這一位點的磷酸化會促進FIT和Ib異源二聚體的形成，激活下游缺鐵響應(yīng)基因。FIT還存在另一種磷酸化，就是在Tyr237和Tyr238的磷酸化，會對FIT活性產(chǎn)生負(fù)面影響，導(dǎo)致FIT向細(xì)胞核的遷移率降低，與bHLH39的相互作用減少,這也是一個調(diào)節(jié)FIT活性的方式［34］。

在擬南芥中，存在茉莉酸JA（jasmonic acid）對缺鐵脅迫的多重抑制。JA信號通路已知的主要調(diào)控因子是IIIe亞族的bHLH轉(zhuǎn)錄因子的bHLH6/MYC2（myelocytomatosis proteins）。在JA存在的情況下，MYC2導(dǎo)致IVa亞族bHLH轉(zhuǎn)錄因子（bHLH18、bHLH19、bHLH20和bHLH25）的表達上調(diào)［35］。這4個功能相似的轉(zhuǎn)錄因子主要在根中表達，并且都與FIT相互作用，調(diào)節(jié)FIT蛋白的積累。目前的相關(guān)研究還未提出FIT與IVa亞族的這4個轉(zhuǎn)錄因子形成的異源二聚體在植物鐵缺乏調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的下游靶基因是哪些，僅指出了FIT與IVa亞族的bHLH轉(zhuǎn)錄因子相互作用會導(dǎo)致FIT的26s蛋白酶體降解，而FIT與Ib亞族的bHLH轉(zhuǎn)錄因子的相互作用則會促進FIT的穩(wěn)定性，這就使得IVa亞族bHLH轉(zhuǎn)錄因子和Ib亞族的轉(zhuǎn)錄因子在與FIT的結(jié)合之間存在著一種競爭關(guān)系，前者促進FIT降解，而后者促進FIT的穩(wěn)定性。

赤霉素GA（gibberellin）是另外一類植物生長激素，已被證實在鐵缺乏反應(yīng)中發(fā)揮作用［36］。研究發(fā)現(xiàn)，在缺鐵條件下，使用GA4處理后的赤霉素缺失突變體，其IRT1、FRO2、bHLH038和bHLH39（后兩者控制IRT1和FRO2表達）的表達量顯著提高，但是FIT的表達不受GA4誘導(dǎo)。這表明GA在缺鐵條件下對鐵吸收相關(guān)基因的誘導(dǎo)是依賴FIT的。GA信號通過DELLA蛋白參與缺鐵反應(yīng)，酵母雙雜交、熒光共振能量轉(zhuǎn)移成像（FRET-FLIM）和免疫共沉淀（Co-IP）分析表明，GA信號的DELLA阻遏蛋白可以與FIT、bHLH38和bHLH39蛋白形成異二聚體。FRET-FLIM和EMSA結(jié)果顯示，DELLA-FIT異源二聚體并不阻止FIT和Ib亞族 bHLH轉(zhuǎn)錄因子形成異源二聚體，而是通過阻止FIT和Ib亞族 bHLH轉(zhuǎn)錄因子的異源二聚體與其靶基因啟動子的結(jié)合來抑制FIT的轉(zhuǎn)錄活性。對綠色熒光蛋白幼苗的芯片分析表明，在缺鐵條件下，在DELLA蛋白存在的情況下，F(xiàn)IT與其目標(biāo)基因啟動子的相互作用減少［37］。在缺鐵條件下，DELLA蛋白在根分生組織中積累，最終使FIT與Ib亞族bHLH轉(zhuǎn)錄因子異源二聚體的形成以及激活鐵攝取基因。

EIN3（ethylene insensitive 3）和EIL1（EIN3-like 1）是兩個通過乙烯信號通路激活的轉(zhuǎn)錄因子［38］。二者均可以和FIT相互作用，促進FIT的穩(wěn)定性，從而增加鐵攝取基因的表達。乙烯信號通路的EIN3或是EIL1并不影響FIT和Ib亞族bHLH轉(zhuǎn)錄因子形成二聚體對下游基因進行調(diào)控，二者均可以抑制FIT被蛋白酶體降解，通過促進FIT的穩(wěn)定性來增強鐵的獲取［39］。MED16（mediator subunit 16）是中介體復(fù)合物的一個亞單位,連接異源二聚體的RNA聚合酶II（Pol II）復(fù)合體, 提高FIT/ Ib bHLH二聚體與FRO2和IRT1啟動子結(jié)合的穩(wěn)定性,向RNA聚合酶2傳輸信號,激活FRO2和 IRT1表達［40］。MED16與另一個亞基MED25（mediator subunit 25）相互作用，MED25通過與EIN3和EIL1的相互作用，在鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控中發(fā)揮重要作用［41］。

關(guān)于機制I植物中的bHLH轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)研究得相對比較清楚，不論是缺鐵情況下還是生長在富鐵的肥沃土壤中，植物中都有相應(yīng)功能的轉(zhuǎn)錄因子來發(fā)揮作用，這些bHLH轉(zhuǎn)錄因子形成一張復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)（圖2），精準(zhǔn)地調(diào)控鐵的吸收和運輸，使植物體內(nèi)的鐵積累量始終維持在一個較為穩(wěn)定的狀態(tài)，為植物的正常生長發(fā)育保駕護航。

圖2 擬南芥中鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控Fig.2 Fe homeostasis regulation in Arabidopsis

圖3 擬南芥和水稻中調(diào)控鐵穩(wěn)態(tài)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of bHLH TFs regulating Fe homeostasis in Arabidopsis and rice（Oryza sativa）

2.2 水稻中調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子

水稻由于其生長條件可以是淹水，也可以土培，所以是鐵吸收完整的機制Ⅱ與部分機制I同時存在［42］，bHLH轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控水稻機制Ⅱ鐵的吸收及機制I與機制Ⅱ鐵的運輸。與擬南芥相比，水稻中現(xiàn)已被研究的鐵運輸調(diào)控相關(guān)bHLH家族的轉(zhuǎn)錄因子較少，但水稻中的bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子大多與擬南芥中的為同源基因，處在同樣的亞族位置（圖3），在水稻中發(fā)揮著與擬南芥中相似的功能。

OsHRZ1（hemerythrin motif-containing really interesting new gene and zinc-finger protein 1）與擬南芥中的BTS同源，類似地，OsHRZ1通過26S蛋白酶途徑靶向OsPRI1（positive regulator of iron homeostasis 1）［43］。hrz1相比野生型對照對鐵缺乏的耐受性更強，Western Blot免疫印跡結(jié)果顯示，隨著OsHRZ1-GFP含量的增加，OsPRI1蛋白豐度降低，這些結(jié)果表明了OsHRZ1在鐵充足的條件下通過泛素化OsPRI1負(fù)向調(diào)節(jié)鐵的穩(wěn)態(tài)［44］。比較分析表明，OsPRI1的氨基酸序列與IVc亞族的AtbHLH34/104/105/115相似，與AtbHLH34/104/105/115正調(diào)控AtbHLH38/39/100/101一樣，OsPRI1直接上調(diào)OsIRO2的表達進而激活鐵吸收相關(guān)基因的表達［45］。OsPRI2和OsPRI3是OsPRI1的兩個同源基因，已被鑒定與OsPRI1功能類似，這兩個轉(zhuǎn)錄因子也與OsHRZ1直接相互作用，且OsHRZ1促進了OsPRI2和OsPRI3的降解［20］。CHIP-qPCR實驗與EMSA實驗結(jié)果分析表明OsPRI2和OsPRI3也可以與OsIRO2（iron-related transcription factor 2）和OsIRO3的啟動子結(jié)合。因此，OsPRI1/2/3相似且具有相同的功能。

OsIRO3是屬于bHLH IVb亞族的轉(zhuǎn)錄因子，與AtPYE同源，受OsPRI1/2/3正調(diào)控。OsIRO3在根、葉和基節(jié)中表達，營養(yǎng)生長期葉片中表達水平較高。OsIRO3基因敲除導(dǎo)致植株對缺鐵敏感，幼葉嚴(yán)重壞死，根發(fā)育不良，這些證據(jù)表明OsIRO3在響應(yīng)水稻缺鐵上是必不可少的［46］。在缺鐵條件下，iro3在地上部積累了較高水平的鐵，這與上調(diào)OsNAS3的表達有關(guān)，從而導(dǎo)致尼克酰胺NA（nicotianamine）在根中的積累增加。雙熒光素酶實驗表明，OsIRO3可以直接與OsNAS3啟動子中的E-box結(jié)合。此外，在鐵充足的條件下，鐵相關(guān)運輸基因的表達顯著上調(diào)。因此，OsIRO3在響應(yīng)缺鐵的過程中起著關(guān)鍵作用，并且直接負(fù)向調(diào)節(jié)OsNAS3的表達［46］。同屬于IVb亞族的bHLH轉(zhuǎn)錄因子OsbHLH061，與兩個已知的鐵調(diào)節(jié)因子有很高的序列相似性：與水稻中的OsIRO3有43%的相似性和擬南芥中的AtPYE有49%的相似性。在缺鐵條件下，OsbHLH061基因敲除導(dǎo)致地上部鐵的過度積累和對鐵毒害的敏感，而酵母雙雜交實驗證明OsPRI1和OsbHLH061互作［47］，表明OsbHLH061是在鐵充足時與OsPRI1互作共同下調(diào)OsIRO3的表達，負(fù)向控制鐵向地上部的運轉(zhuǎn)和在水稻中的積累，維持鐵穩(wěn)態(tài)。

OsIRO2是屬于bHLH家族Ib亞族的轉(zhuǎn)錄因子，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)水稻中鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因，是OsPRI1的另一個靶基因。OsIRO2在根和葉中表達，在缺鐵條件下，OsIRO2在營養(yǎng)組織中的表達僅限于根和葉。OsIRO2過表達植株地上部的鐵積累量是普通水稻的2-4倍，這表明OsIRO2是調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的相關(guān)基因［48］?；蛐酒治霰砻?，OsIRO2在根中調(diào)控59個缺鐵誘導(dǎo)基因，如OsNAS1、OsNAS2，煙酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶OsNAAT1（nicotianamine aminotransferase 1），脫氧麥根酸OsDMAS1（rice synthesizes the Fe chelator 2'-deoxymugineic acid 1），OsYSL15和TOM1都受到OsIRO2的正調(diào)控［49］。而OsIRO3直接調(diào)控OsIRO2的表達。酵母雙雜交試驗表明，OsIRO3與OsPRI1和OsPRI2相互作用，已經(jīng)證實OsPRI1/2/3通過直接與OsIRO2啟動子結(jié)合并激活其啟動子來正向調(diào)節(jié)OsIRO2的表達［35］，而OsIRO3與OsPRI1和OsPRI2相互作用抑制了OsPRI1/2對OsIRO2的轉(zhuǎn)錄激活。因此，OsIRO3通過抑制OsIRO2的表達負(fù)調(diào)節(jié)鐵的動態(tài)平衡［50］。

通過RNA-seq分析鑒定出的OsbHLH156與擬南芥中的FIT同源，是bHLH家族IIIa亞族的轉(zhuǎn)錄因子，主要在根部表達且受缺鐵誘導(dǎo)。轉(zhuǎn)錄激活實驗證明OsbHLH156具有轉(zhuǎn)錄激活能力。GUS染色結(jié)果顯示OsbHLH156的表達模式與OsIRO2相似，主要在根成熟區(qū)的上皮、外皮層、皮層、內(nèi)皮層及中柱表達。OsIRO2定位在細(xì)胞質(zhì)，OsbHLH156定位在細(xì)胞核，當(dāng)OsIRO2與OsbHLH156共表達時，兩蛋白均定位于細(xì)胞核。BIFC和免疫共沉淀實驗結(jié)果顯示OsbHLH156與OsIRO2相互作用。在提供三價鐵條件下，OsbHLH156基因敲除突變體在缺鐵條件下生長時葉綠素含量比野生型植株降低了55%，降低了地上部的鐵積累量［51］，這一結(jié)果證明在缺鐵條件下OsbHLH156和OsIRO2對于激活機制Ⅱ中鐵的吸收及運輸是必不可少的，二者共同正向調(diào)控水稻中三價鐵的吸收與運輸。

雖然水稻和擬南芥采用不同的鐵吸收策略，但是關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，無論是水稻中的OsbHLH156還是擬南芥中的FIT，都通過與bHLH 家族Ib亞族轉(zhuǎn)錄因子形成異源二聚體來調(diào)節(jié)缺鐵反應(yīng)。OsbHLH156是促進OsIRO2核定位所必需的，這一現(xiàn)象最近也被證明在擬南芥中發(fā)生，其中AtbHLH39的核定位需要FIT［52］。這說明，這兩種鐵的吸收策略本質(zhì)上并沒有太大的不同（圖4）。

圖4 水稻中鐵穩(wěn)態(tài)機制Fig.4 Fe homeostasis mechanism in rice

2.3 其他植物鐵穩(wěn)態(tài)bHLH家族

番茄是機制I植物，鐵吸收及運輸模式與擬南芥相似。FER就是最先從番茄中分離得到的參與高等植物鐵穩(wěn)態(tài)的轉(zhuǎn)錄因子，和擬南芥的FIT同源，在根表皮和外層皮層細(xì)胞層中都有表達［53］。FER激活鐵轉(zhuǎn)運蛋白LeIRT1的表達，調(diào)控鐵穩(wěn)態(tài)［54］。SlbHLH068是策略I機制中另一個bHLH家族的成員，表達模式與FER的表達模式具有一定的相似性，在缺鐵條件下表達量顯著上調(diào)，但不受其他營養(yǎng)水平的影響。這表明，SlbHLH068在番茄體內(nèi)的鐵穩(wěn)態(tài)中起特異性作用。通過系統(tǒng)發(fā)育分析，SlbHLH066/067/068與擬南芥中AtbHLH38/AtbHLH39/AtbHLH100高度同源，功能也相近。酵母雙雜交和轉(zhuǎn)錄激活實驗結(jié)果顯示，SlbHLH068與FER形成異源二聚體激活了酵母細(xì)胞中由LeFRO1啟動子驅(qū)動的GUS表達［55］。這些結(jié)果表明FER/SlbHLH068異二聚體可以直接結(jié)合并激活LeFRO1的表達以促進鐵的吸收。

木本植物蘋果也是采取策略I吸收鐵，MdbHLH104被鑒定為蘋果中應(yīng)對缺鐵反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，序列與OsPRI1相似。MdbHLH104基因的過表達顯著提高了轉(zhuǎn)基因蘋果植株和愈傷組織在缺鐵條件下的H+-ATPase活性和對鐵缺乏的耐受性［56］。Wang等［47］的研究表明，MdHLH104蛋白直接與MdAHA8基因的啟動子結(jié)合正向激活其表達，以及質(zhì)膜H+ATPase活性和鐵的吸收。類似地，MdbHLH104直接調(diào)控了3個鐵敏感的bHLH基因的表達，即MdbHLH38、MdbHLH39和MdPYE。此外，酵母雙雜交實驗和pull-down實驗結(jié)果表明MdBHLH104還與MdbHLH105、MdbHLH115、MdPYE、MdbHLH11和MdbHLH121相互作用，共同調(diào)節(jié)MdAHA8基因的表達、質(zhì)膜H+-ATPase活性和蘋果愈傷組織中鐵的含量。因此，MdbHLH104是蘋果中鐵動態(tài)平衡的正調(diào)控因子，與其他蘋果bHLH家族一起通過調(diào)控MdAHA8基因的表達和質(zhì)膜H+-ATPase的活性來調(diào)節(jié)蘋果對鐵的吸收。

從木本植物小金海棠中分離到3個bHLH基因：MxbHLH01、MxIRO2和MxFIT，并對其進行了鑒定，MxbHLH01的表達僅限于根，在缺鐵條件下表達上調(diào)，MxbHLH01可能與其他蛋白質(zhì)相互作用來調(diào)節(jié)基因?qū)θ辫F的響應(yīng)［57］。在缺鐵條件下，MxIRO2在小金海棠的根和葉中均被誘導(dǎo)［58］。它可能與其他轉(zhuǎn)錄因子形成異二聚體或多聚體，以控制與鐵吸收相關(guān)的基因的表達。目前有關(guān)果樹應(yīng)對缺鐵脅迫的研究較少，還需要進一步挖掘果樹鐵吸收及運輸調(diào)控機制。

3 總結(jié)與展望

目前bHLH轉(zhuǎn)錄因子是已知的在高等生物的代謝、生理和生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用的最大的轉(zhuǎn)錄因子家族［59］。從在番茄中分離出并鑒定FER［60］開始，人們就從未停止過對bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的探索與研究，尤其是bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族應(yīng)對缺鐵脅迫的調(diào)控機制方面。隨著各種生物技術(shù)手段越來越完善、相關(guān)研究越來越多，我們對bHLH家族成員是如何調(diào)控鐵吸收及運輸?shù)臋C理也越發(fā)清晰明了。通過對bHLH在植物各組織基因表達的檢測、目的基因在細(xì)胞中的定位情況以及其他一些體外蛋白質(zhì)實驗的研究，在缺鐵條件下利用兩種機制調(diào)控鐵平衡的相關(guān)過程已經(jīng)相對清晰地展現(xiàn)在了我們的眼前，然而我們現(xiàn)在仍然不知道這個網(wǎng)絡(luò)最上游的轉(zhuǎn)錄因子的表達是如何調(diào)節(jié)的，以及同亞族相似但非冗余的bHLH轉(zhuǎn)錄因子各自具體的功能也還未被研究，這表明我們?nèi)匀粵]有把這個鐵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)完全地探索清楚。我們離完全了解bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控鐵穩(wěn)態(tài)機理還有很長一段距離，還需要在探究真相的道路上繼續(xù)前行。