■ 段海濤 盧麗枝 梁蒙蒙 王文雅 黃安群 霍文穎 李 俊 張 磊

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動物科技學(xué)院，河南鄭州 450046；2.廣西壯族自治區(qū)畜牧站，廣西南寧 530022；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081；4.河南省獸藥飼料監(jiān)察所，河南鄭州 450008）

真菌毒素是由真菌產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物[1]。目前已知的真菌毒素有300 多種[2]。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）估算，全世界每年約有25%的谷物受真菌毒素污染，約2%的農(nóng)產(chǎn)品因霉變而失去營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價值，給農(nóng)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。其中玉米赤霉烯酮（ZEN）、黃曲霉毒素（AFT）在飼料中危害較大[4]。由鐮刀菌產(chǎn)生的玉米赤霉烯酮在霉變糧食中最為常見。已有研究證實，ZEN 在動物體內(nèi)產(chǎn)生的生物學(xué)反應(yīng)與雌二醇類似，影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞生長、卵母細(xì)胞成熟及卵泡顆粒細(xì)胞的增殖[5]。AFT 是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，其主體結(jié)構(gòu)為二呋喃環(huán)和香豆素[6-8]。目前鑒定出的AFT 有20 多種，主要分為B 族、G 族和M 族等，毒性最強(qiáng)的是AFB1[9-10]。AFB1 是一種廣泛存在于食品和畜禽飼料中的污染物[11-13]。黃俊恒等[14]2018 年從19 個省市收集442 份飼料及飼料原料，檢測到餅粕類樣品受黃曲霉毒素B1（AFB1）污染嚴(yán)重。王國強(qiáng)等[15]對來自不同省份的321份飼料及飼料原料樣品進(jìn)行了毒素檢測，發(fā)現(xiàn)高達(dá)91.36%的飼料及飼料原料受到兩種及以上真菌污染[16]。霉菌毒素污染正成為畜禽健康最為嚴(yán)重的挑戰(zhàn)之一[17]。被真菌毒素污染的飼料可抑制蛋白質(zhì)和酶的合成，破壞組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，損壞動物的肝腎、腸道、神經(jīng)等器官和組織[18-20]。還可能會導(dǎo)致飼料的營養(yǎng)價值和適口性降低，飼料轉(zhuǎn)化率下降，從而使動物拒絕進(jìn)食，生長較慢，免疫功能受到抑制，容易生病，甚至死亡[21]。吸附劑與霉菌毒素分子結(jié)合的效率是影響脫毒效果最重要的因素之一。通常動物攝入霉菌毒素污染的飼料后，隨著咀嚼、消化作用，毒素分子會快速分散于胃液中，胃壁及小腸對霉菌毒素分子的吸收是迅速的，而吸附劑快速地與毒素分子結(jié)合，能夠競爭性地減少毒素由消化道進(jìn)入體循環(huán)的量，從而緩解毒性作用[22]。霉菌毒素吸附劑種類主要包括無機(jī)吸附劑（如活性炭和硅酸鹽類礦物質(zhì)）及有機(jī)吸附劑（如酵母細(xì)胞壁提取物、植物纖維和細(xì)菌等）。硅酸鹽類礦物質(zhì)，如蒙脫石、沸石等具有含量豐富、分布廣泛等優(yōu)點，可以大規(guī)模應(yīng)用在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中[23]。

由于飼料中霉菌毒素污染情況復(fù)雜，不同的霉菌毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性完全不一樣，造成霉菌毒素吸附劑對飼料中毒素的吸附能力差異很大[24]。不同吸附劑產(chǎn)品的脫毒效果不同，類型、濃度等均是影響其吸附效果的因素。目前，吸附劑產(chǎn)品研究主要集中于新產(chǎn)品研發(fā)，其吸附效果評價主要采用體外吸附評價方法，缺乏體外模擬胃腸道消化環(huán)境狀態(tài)的吸附效果評價。因此，本試驗通過體外模擬胃腸道環(huán)境，對真菌毒素吸附劑的吸附效果進(jìn)行評估，探究不同吸附劑類型對膨化玉米中AFB1 及ZEN的吸附效果，為飼料及原料企業(yè)評估吸附劑效果提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

試驗所用6 種霉菌毒素吸附劑產(chǎn)品均為市場購買，分別編號為硅鋁酸鹽①（過325 目篩，表觀黏度11 mPa·s，水和硅鋁酸鹽含水量<9%，硅酸鋁鹽含量>60%），蒙脫石②（含量>98%，過600 目篩，表觀黏度40 mPa·s），酵母細(xì)胞壁③（啤酒酵母細(xì)胞壁），硅鋁酸鹽④（鈉基，過200 目篩，表觀黏度20 mPa·s），硅鋁酸鹽⑤（鈣基，過200 目篩，表觀黏度25 mPa·s），蒙脫石⑥（含量>60%，過400目篩，表觀黏度20 mPa·s）。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品及試劑

AFB1 標(biāo)準(zhǔn)品（美國斯坦福分析化學(xué)公司），ZEN標(biāo)準(zhǔn)品（美國斯坦福分析化學(xué)公司）。

乙腈（色譜純），甲醇（色譜純），乙腈水溶液（90+10），試驗用水均為超純水。

1.1.3 儀器

高效液相色譜儀（配備熒光檢測器，安捷倫1260），超聲波清洗儀（上海冠特超聲儀器有限公司），氮吹儀（TTL-DCII 型，北京金洋萬達(dá)科技有限公司），玉米赤霉烯酮免疫親和柱（北京中檢維康生物技術(shù)有限公司）。色譜柱（agela odyssil, C18 柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；柱溫：25 ℃）

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

AFB1 提取溶液：將84 mL 乙腈加入到16 mL 水中，混勻。

AFB1衍生溶液：量取20 mL三氟乙酸、70 mL水，混勻后加入10 mL冰乙酸，混勻。臨用現(xiàn)配。

AFB1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（1 000 μg/mL）：用乙腈完全溶解標(biāo)準(zhǔn)品，配制成AFB1含量為1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，-20 ℃保存，有效期為6個月。

AFB1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：將1 000 μg/mL 的AFB1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液用乙腈稀釋100 倍，得到濃度為10 μg/mL的稀釋液，再將稀釋液用乙腈稀釋100 倍，得到濃度為100 ng/mL的AFB1標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

AFB1 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：將100 ng/mL 的AFB1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用乙腈稀釋1、5、10、20、50、100 倍，得到100、50、20、10、5、2、1 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。臨用現(xiàn)配。

乙腈水溶液（90+10）：量取90 mL 乙腈，加入到10 mL水中，混勻。

ZEN 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：用乙腈將ZEN 標(biāo)準(zhǔn)品溶解，制得稀釋濃度為100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18 ℃下避光保存。

ZEN 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：將標(biāo)準(zhǔn)儲備液用流動相稀釋200、500、1 000、2 000、10 000 倍，配制成濃度為500、200、100、50、10 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃避光保存。

人工胃液：以pH 7.00 PBS 為基礎(chǔ)，再用37%的鹽酸將pH 分別調(diào)至2.00，按0.89 U/mL 的比例添加胃蛋白酶，充分溶解后用0.22 μm微孔濾膜除菌，備用。

人工腸液：取6.8 g 磷酸氫二鈉加入500 mL 水溶解[25]，用0.1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.8，另取10 g胰蛋白酶加適量水溶解，混合，用水定容至1 000 mL。

1.2.2 色譜條件選擇

熒光檢測器檢測波長：AFB1、ZEN 激發(fā)波長274 nm，發(fā)射波長440 nm。

用甲醇和水按7：3 的比例作為流動相洗脫真菌毒素，柱溫為40 ℃，AFB1 使用甲醇：水為55：45，ZEN 使用甲醇：水為70：30。進(jìn)樣量：AFB1 20 μL，ZEN 1 μL；流速：1.0 mL/min。

1.2.3 模擬胃腸道消化

分別稱量5 g飼料樣品用于AFB1吸附率試驗，取4 g 樣品用于ZEN 吸附試驗，外源加入100 μL AFB1或ZEN 標(biāo)準(zhǔn)品，吸附劑添加量均為4 mg，于50 mL 離心管中，向其中加入人工胃液18 mL 調(diào)節(jié)pH 到2 左右，置于（39±0.5）℃恒溫振蕩器中220 r/min孵育1 h，取1 mL 上清液，13 000 r/min 離心5 min，取上清液測定真菌毒素含量，并計算吸附率。

分別向人工胃液消化后剩余的樣品沉淀中加入18 mL 人工小腸液，置于（39±0.5）℃恒溫振蕩器中220 r/min 孵育1 h，取1 mL 上清液13 000 r/min 離心5 min，取上清液測定真菌毒素含量，并計算吸附率。

同時，分別向不盛有任何吸附劑的空白離心管中加入人工胃液消化液和人工小腸液消化液18 mL，設(shè)置空白組。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個試驗點重復(fù)4 次，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式表示。采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，Dun‐can’s 法多重比較檢驗組間差異顯著性，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線

以真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為橫坐標(biāo)（X）、色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制AFB1 及ZEN 的標(biāo)準(zhǔn)曲線。相關(guān)系數(shù)R2>0.99（見表1）。

表1 兩種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)

2.2 模擬胃腸道環(huán)境下吸附劑產(chǎn)品對真菌毒素的吸附效果

由表2 可知，吸附劑產(chǎn)品硅鋁酸鹽⑤對AFB1 的吸附效果顯著高于硅鋁酸鹽①、蒙脫石②及酵母細(xì)胞壁③（P<0.05），與硅鋁酸鹽④及蒙脫石⑥吸附效果差異不顯著（P>0.05）；吸附劑產(chǎn)品硅鋁酸鹽⑤對ZEN 的吸附效果顯著高于硅鋁酸鹽①、蒙脫石②及酵母細(xì)胞壁③（P<0.05），與硅鋁酸鹽④及蒙脫石⑥吸附效果差異不顯著（P>0.05）。

表2 體外吸附條件下的吸附率（%）

2.3 模擬胃腸道環(huán)境下吸附劑產(chǎn)品對真菌毒素的吸附效果

2.3.1 吸附劑產(chǎn)品對AFB1的吸附率效果

從表3可知，6種不同的吸附劑在模擬胃腸情況下對AFB1的吸附效果，各樣品間差異不顯著（P>0.05）。

表3 模擬胃腸道環(huán)境下吸附劑產(chǎn)品對AFB1的吸附率（%）

2.3.2 吸附劑產(chǎn)品對ZEN的吸附效果

由表4 可知，胃液條件下，吸附劑產(chǎn)品蒙脫石②及蒙脫石⑥對ZEN 的吸附效果顯著高于吸附劑產(chǎn)品硅鋁酸鹽①、酵母細(xì)胞壁③、硅鋁酸鹽④及硅鋁酸鹽⑤（P<0.05），吸附劑產(chǎn)品硅鋁酸鹽④及硅鋁酸鹽⑤對ZEN的吸附效果差異不顯著（P>0.05）。腸液條件下，吸附劑產(chǎn)品硅鋁酸鹽①及蒙脫石⑥對ZEN 的吸附效果顯著高于樣品蒙脫石②、酵母細(xì)胞壁③及硅鋁酸鹽④及硅鋁酸鹽⑤（P<0.05）。吸附劑產(chǎn)品③及④對ZEN 的吸附效果不顯著（P>0.05）。

表4 模擬胃腸道環(huán)境下吸附劑產(chǎn)品對ZEN的吸附率（%）

3 討論

3.1 胃液對吸附劑吸附率的影響

天然毒素是由真菌、植物或微生物代謝產(chǎn)生的，霉菌毒素是真菌的天然次生代謝物[26]，在飼料和食物鏈中普遍存在[27]。飼料中霉菌毒素污染嚴(yán)重影響動物的健康、生產(chǎn)性能及企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。為減輕霉菌毒素負(fù)面影響，向飼料中加入吸附劑，與毒素相互作用，幫助毒素通過胃腸道并降低其生物利用度。吸附效果因吸附劑類型而異。

AFB1 是一種極性霉菌毒素，含有β-羰基，β-羰基參與吸附過程[28]。ZEN 具有弱極性。早在1978 年就有研究證實，硅鋁酸鹽類礦物質(zhì)在體外條件下能夠很好地吸附AFB1[29]。在日糧中添加酵母細(xì)胞壁吸附劑可能對降低AFB1 的生理生物利用度產(chǎn)生積極影響[30]。錢潘攀等[31]研究了一種雙效型細(xì)胞壁提取物，具有吸附毒素的能力。Yiannikouris 等[32]比較在存在基于酵母細(xì)胞壁的吸附劑和存在基于黏土的黏合劑水合硅鋁酸鈣鈉的情況下放射性標(biāo)記的AFB1在大鼠中的吸收藥代動力學(xué)，結(jié)果表明酵母細(xì)胞壁具有降低AFB1體內(nèi)吸收和防止AFB1污染的破壞作用的潛力。Kong 等[33]確定吸附劑產(chǎn)品通過體外模擬豬胃腸道pH條件的方法結(jié)合或降解AFB1 的功效，得出酵母細(xì)胞壁產(chǎn)品對AFB1 的吸附百分比為92.7%。Kolawole等[34]取得類似結(jié)果。Hajar 等[35]評估酵母菌株在胃腸道模擬條件下減少AFB1 的能力，結(jié)果表明酵母對AFB1的減少有顯著影響。真菌毒素和酵母細(xì)胞壁之間的相互作用力與弱氫鍵和范德華鍵的疏水和靜電相互作用[36]。Wang 等[37]認(rèn)為蒙脫石可通過離子-偶極相互作用以及有疏水相互作用吸附AFB1。徐瑞等[38]研究表明，吸附型黏土對黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素的吸附率均較高,止瀉型黏土、黏結(jié)型黏土對黃曲霉毒素的吸附率較高，對玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素的吸附率較低。劉少文等[39]進(jìn)一步證實，蒙脫石對AFB1 有較好的吸附效率，體外試驗表明吸附率可達(dá)99%，但對玉米赤霉烯酮等吸附效果不理想。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，體外模擬胃液環(huán)境中，不同吸附劑產(chǎn)品類型對AFB1 及ZEN 的吸附效率均提升10%以上，在低pH 情況下離子吸附作用效果提升。本試驗與前人結(jié)果[40]一致。Yiannikouris 等[32]使用帶熒光檢測的液相色譜法（LC-FLD）量化酵母細(xì)胞壁吸附劑和水合硅鋁酸鈣鈉在兩個pH下對AFB1的吸附能力，結(jié)果表明酵母細(xì)胞壁吸附劑和水合硅鋁酸鈣鈉的吸附能力在低pH 下得到提升。Jutamas 等[41]和Kihal 等[42]取得類似結(jié)果。

3.2 腸液對吸附劑吸附率的影響

體外模擬腸液環(huán)境中，吸附劑產(chǎn)品對ZEN的吸附效果與在胃液中吸附效果差異較大。主要是因為酸性環(huán)境下ZEN僅以疏水力結(jié)合在吸附劑的表面，中性或堿性環(huán)境下，ZEN 陰離子增加了與邊緣羥基以靜電作用結(jié)合的吸附位點。王金全等[43]采用pH 3.0 的檸檬酸鹽緩沖溶液和pH 6.5 的磷酸鹽緩沖溶液分別模擬動物胃和腸道的pH 環(huán)境，固定溫度和反應(yīng)時長，選取12 種市售霉菌毒素吸附劑，評價其對ZEN 的體外吸附效果，結(jié)果表明，不同吸附劑在不同pH 反應(yīng)介質(zhì)中對ZEN 的吸附效果不同，其中絕大部分吸附劑在pH 6.5 條件下的吸附效率高于pH 3.0 時。楊新崗[44]通過體外模擬腸道環(huán)境，對4 種吸附劑吸附AFB1、ZEN 的吸附效果進(jìn)行評定，結(jié)果表明：腸液對AFB1的吸附作用比在胃液中大，兩者有顯著差異，腸液條件下的吸附劑產(chǎn)品對ZEN 的吸附效果優(yōu)于胃液條件。這與本試驗結(jié)果一致。

4 結(jié)論

不同種類的吸附劑對真菌毒素的吸收作用差別較大。探討吸附劑產(chǎn)品的吸附率時應(yīng)考慮消化液的影響，本試驗中，樣品中硅鋁酸鹽類吸附劑吸附效果優(yōu)于酵母細(xì)胞提取物。