■ 王 超 田 豐 李九月 李長青 王 利 張海鷹 薛樹媛

（內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院，內蒙古呼和浩特 010031）

沙柳（Salix psammophila）為多年生沙生灌木，因其具有抗旱、耐貧瘠、耐嚴寒、抗風沙等特性，成為我國重要的防風固沙樹種，也是我國三北防護林首選樹種。由于沙柳含有豐富的營養(yǎng)物質和鈣、磷等礦物質元素，逐漸成為我國北方地區(qū)重要的粗飼料資源。薛樹媛[1]在對不同生長期沙柳營養(yǎng)成分的研究中發(fā)現，其粗蛋白（CP）、中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌性纖維（ADF）含量分別為6.3%～10.1%、32.4%～52.7%、30.9%～33.7%，體外瘤胃培養(yǎng)法測定沙柳粗蛋白的平均降解率為63.1%。崔瑞梅[2]報道，用尼龍袋法測定沙柳的粗蛋白降解率為68.9%，干物質降解率為38.7%，粗纖維降解率57.2%。李滿雙等[3]研究發(fā)現，發(fā)酵沙柳在體外培養(yǎng)中可以顯著提高瘤胃液微生物蛋白（MCP）和總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）濃度，而且能降低瘤胃液pH、氨態(tài)氮（NH3-N）濃度、丁酸濃度以及乙酸/丙酸值，因此推斷沙柳具有較高的飼用價值，與許冬梅等[4]的研究結果一致。發(fā)酵飼料既可以有效保留飼料的營養(yǎng)成分，還可以長期貯存、不發(fā)生變質，而且發(fā)酵還可以提高飼料的消化利用率。王超等[5]研究表明，發(fā)酵全混合飼料在體外瘤胃培養(yǎng)中，可以促進瘤胃發(fā)酵，提高干物質、中性洗滌纖維降解率以及瘤胃纖維降解菌數量。因此，沙柳在飼喂過程中也采取發(fā)酵后再飼喂。而關于發(fā)酵沙柳對于肉牛生長性能、瘤胃發(fā)酵特性以及瘤胃微生物群影響的研究還未見報導。本研究用發(fā)酵沙柳飼喂西門塔爾母牛，探討其對瘤胃發(fā)酵特點和瘤胃微生物多樣性的影響。

1 材料和方法

1.1 發(fā)酵沙柳的制作

2020 年10 月中旬收割沙柳，并利用揉絲粉碎機（9ZR-2.6，滄州昌鴻磨漿機械有限公司）將沙柳揉絲粉碎為2～3 cm 的絲段，添加適量的玉米粉、麩皮、糖蜜、青貯發(fā)酵劑，調節(jié)水分含量在55%左右，充分混合攪拌后，制作成裹包青貯，置于陽光房中發(fā)酵30 d待用。

1.2 全混合日糧的配制

根據肉牛生長需要量，結合燕麥秸稈、發(fā)酵沙柳、玉米秸稈黃貯營養(yǎng)含量，配制燕麥秸稈和發(fā)酵沙柳全混合日糧，日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 試驗牛的選擇

選擇18 頭體重為270～280 kg、生長狀況良好的12 月齡西門塔爾后備母牛，對所有牛進行統(tǒng)一編號、驅蟲免疫，其他管理措施按照牛場管理進行。將18頭牛隨機分為2組，每組9頭牛。

1.4 試驗設計與飼養(yǎng)管理

試驗在內蒙古錫林郭勒盟正藍旗桑格達來鎮(zhèn)查干淖爾家庭牧場進行，試驗時間為2020 年11 月—2021 年1 月，其中預試期10 d，試驗期55 d，對照組飼喂燕麥秸稈、玉米秸稈黃貯以及精飼料配制成全混合飼料，試驗組飼喂燕麥秸稈、發(fā)酵沙柳以及精飼料配制成全混合飼料。試驗期間每日07：00和18：00按照10～12 kg/頭的量投料，保證每天采食后料有剩余，試驗牛自由采食和飲水。

1.5 樣品采集與處理

用經口投胃管式瘤胃液采集裝置采集瘤胃液。將采集的瘤胃液分裝為3份，一份取8 mL放入預先加入2 mL 25%偏磷酸的15 mL 離心管中，測定瘤胃液中揮發(fā)性脂肪酸（VFA）含量；另取2份置于5 mL螺口離心管中，分別測定瘤胃液NH3-N、MCP 含量和瘤胃微生物多樣性。運輸過程中瘤胃液用液氮保存，帶回實驗室后-80 ℃冰箱保存。

1.6 測定指標

1.6.1 瘤胃發(fā)酵指標

NH3-N 含量按照馮宗慈等[6]的比色法測定，VFA含量參照王超等[5]的方法測定，MCP 含量應用考馬斯亮藍比色法測定[7]。

1.6.2 瘤胃微生物群態(tài)分布

1.6.2.1 瘤胃液細菌DNA的提取

將-80 ℃保存的瘤胃液樣品置于無菌操作臺，并放入冰水混合物中解凍后，利用E.Z.N.A.?Stool DNA Kit（Omega Bio-Tek公司，美國）提取瘤胃液中總DNA。用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質量，同時采用紫外分光光度計對DNA 進行定量，確認DNA純度。

1.6.2.2 PCR擴增

在V3～V4 區(qū) 域 利 用 引 物341F（5′-CCTAC‐GGGNGGCWGCAG-3′）和805R（5′-GACTACHVGGG‐TATCTAATCC-3′）進行PCR 擴增，反應條件為98 ℃預變性30 s，98 ℃變性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。PCR 產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，由AMPure XT beads（Beckman Coulter Genomics，Danvers，MA，USA）純化、Qubit（In‐vitrogen，USA）定量。

1.6.2.3 PCR產物序列測定及分析

PCR 產物在Illumina NovaSeq（LC-Bio 公 司，美國）平臺上進行測序（杭州聯(lián)川生物技術股份有限公司）。利用QIIME2 計算出超指數（Chao）、物種數目（observed species）、覆蓋度（goods coverage）、香濃指數（Shannon）、辛普森指數（Simpson）5 個指標。采用BLAST 進行序列比對，每個代表性序列用SILVA 數據庫對特征序列進行注釋。

1.7 數據分析

數據分析均利用Microsoft Excel 2019 軟件對試驗數據進行分析整理并制作圖表，同時采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學軟件對數據進行單樣本的t檢驗，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵沙柳對牛瘤胃液發(fā)酵指標的影響

由表2 可知，CK 組瘤胃液pH、NH3-N 含量低于SP 組，但均無顯著差異（P>0.05）。CK 組和SP 組的MCP 含量分別為3.34 mg/dL 和3.10 mg/dL，CK組顯著高于SP 組（P<0.05）。CK 組瘤胃液中VFA、乙酸、丙酸、丁酸含量以及乙酸/丙酸值都高于SP組，但均無顯著性差異（P>0.05）。

表2 飼喂不同日糧對牛瘤胃液發(fā)酵參數的影響

2.2 發(fā)酵沙柳對牛瘤胃微生物多樣性的影響

2.2.1 Alpha多樣性指數

由表3 可知，兩組超指數分別為1 410 和2 035，SP 組顯著高于CK 組（P<0.05）；兩組之間的香濃指數分別為9.48 和9.71；辛普森指數分別為0.85 和0.81；覆蓋度分別為0.995 和0.989。香濃指數、辛普森指數和覆蓋度兩組間均無顯著差異（P>0.05）。

表3 飼喂不同日糧對牛瘤胃細菌alpha多樣性指數的影響

2.2.2 瘤胃細菌操作分類單元（OTU）分布維恩（Venn）圖以及瘤胃細菌組成

由飼喂不同日糧的肉牛瘤胃液細菌OTU 數量Venn 圖（圖1）可知，CK 組的OTU 數量為1 410 個，SP組的OTU數量為2 015個，SP組OTU數量高于CK組，CK和SP共同OTU數量為333個。

圖1 瘤胃細菌OTU分布Venn圖

瘤胃微生物細菌在門水平共檢測到20 個細菌門，見圖2 和表4。厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）屬于優(yōu)勢菌門，Firmicutes 的相對豐度分別為47.75%和76.78%，CK 組極顯著低于SP 組（P<0.01），Bacteroidetes 的 相 對 豐 度 分 別 為32.68% 和19.05%，CK 組有高于SP 組的趨勢，但無顯著差異（P>0.05）。而變形菌門（Proteobacteria）、Kiritimatiellaeo‐ta、纖維桿菌門（Fibrobacteres）和Patescibacteria 是CK組中相對豐度高于1%的菌門，有高于SP 組的趨勢，但與SP組均無顯著差異（P>0.05）。

表4 飼喂不同日糧對母牛瘤胃微生物多樣性的影響（%）

瘤胃微生物細菌在屬水平共檢測到218 個（見圖3），相對豐度排名前20 的屬見表4。CK 組和SP 組的Christensenellaceae_R-7_group 的相對豐度分別為4.99%和24.95%，SP 組顯著高于CK 組（P<0.05）。CK組和SP 組的Prevotella_1 相對豐度分別為11.81%和0.71%，SP 組顯著低于CK 組（P<0.05）。SP 組理研菌屬和瘤胃菌屬相對豐度分別為9.80%和8.93%，有高于CK 組的趨勢，但無顯著差異（P>0.05）。CK 組Fi?brobacter、Ruminococcaceae_UCG-001、Succinivibriona?ceae_UCG-002、Bacteroidales_RF16_group_unclassified相對豐度高于SP組，無顯著差異（P>0.05）。

圖3 瘤胃菌群屬水平結構組成柱形圖

3 討論

3.1 發(fā)酵沙柳對瘤胃液發(fā)酵指標的影響

瘤胃液pH 是反芻動物瘤胃發(fā)酵水平的評價指標，pH 對瘤胃發(fā)酵至關重要。Qin等[8]研究發(fā)現，瘤胃液pH 在 6.60～6.80 可以保持適宜的纖維消化環(huán)境，如果日糧全是粗飼料，并且粗飼料中NDF 含量高，pH 變動范圍為 5.0～7.8。本試驗中，CK 組和SP 組瘤胃液pH 分別為6.82 和6.89，兩組之間無顯著差異，而且都處于pH 的正常變動范圍內，說明飼喂發(fā)酵沙柳與普通飼料一樣，對肉牛瘤胃液pH 沒有顯著影響。瘤胃微生物將飼料中的蛋白質和非蛋白氮降解為NH3-N，其中一部分又被瘤胃微生物利用，合成菌體蛋白[9]。瘤胃中NH3-N 濃度是瘤胃中微生物對日糧中氮源的消化利用情況的反映，也是蛋白質降解與菌體蛋白合成之間平衡關系的反映[10-11]。瘤胃微生物生長的最適合NH3-N 濃度為6.3～27.5 mg/dL[12]。菌體蛋白是瘤胃微生物利用NH3-N能力的反映，VFA由飼料中碳水化合物降解產生，為反芻動物提供總能量的70%～80%[13]。本試驗中，CK 組和SP 組NH3-N 濃度分別為11.92 mg/dL 和13.54 mg/dL，都屬于正常范圍內。SP 組MCP 含量顯著低于CK 組，SP 組與CK 組的TV‐FA、乙酸、丙酸含量均無顯著性差異，表明發(fā)酵沙柳的飼喂對于肉牛瘤胃內VFA 的生成無明顯的影響。本試驗中，pH、NH3-N 濃度、MCP 含量以及TVFA 含量均與李滿雙等[3]體外培養(yǎng)結果不同，可能是由于體外培養(yǎng)在穩(wěn)定的環(huán)境中進行，而動物飼喂時環(huán)境條件較惡劣，環(huán)境溫度最低時達-40 ℃低溫，冷應激導致體內外結果的差異。

3.2 發(fā)酵沙柳對瘤胃微生物的影響

3.2.1 發(fā)酵沙柳對alpha多樣性指數的影響

Chao 指數是估計群落中含OTU 數目的指數，常用來估計物種總數，Shanno和Shimpson可反映瘤胃菌群的多樣性，Shanno 值越大群落多樣性越高；Shimp‐son 值越大群落多樣性越低。本試驗中，SP 組Chao 指數顯著高于CK 組，Shanno 有高于CK 組的趨勢，Shimpson 值有低于CK 組的趨勢。都表明發(fā)酵沙柳飼料的飼喂可以提高肉牛瘤胃微生物種的數量，增加瘤胃微生物多樣性的豐度。覆蓋度是對測序結果是否能真實反映樣本中微生物情況的說明，其數值越大說明樣本序列被測出的概率越大，未被測出的概率越小，一般覆蓋度高于97%時說明測序樣品取樣充分。本試驗中，CK 組和SP 組的覆蓋度分別為0.995%和0.989%，可以認為該測序結果能覆蓋瘤胃中大部分細菌群落，能很好地反映瘤胃微生物種類和結構。

3.2.2 發(fā)酵沙柳對瘤胃細菌OTU 分布Venn 圖和瘤胃微生物多樣性的影響

Venn 圖可以比較直觀地反映樣本的OTU 數、組成的相似性以及相互間的重疊情況。SP 組瘤胃細菌OTU 數量高于CK組，而且兩組之間差異比較大，說明發(fā)酵沙柳可以提高肉牛瘤胃細菌多樣性。

瘤胃微生物對反芻動物營養(yǎng)代謝和健康發(fā)揮著重要作用，其種類和數目受飼糧結構的影響[14]。有研究表明，擬桿菌門與厚壁菌門是反芻動物瘤胃中的優(yōu)勢菌門[15-16]，成熟反芻動物瘤胃中主要細菌相對豐富度：厚壁菌門56%、擬桿菌門31%、變形菌門4%[17-18]。厚壁菌門主要參與纖維物質的分解，與乙酸和乳脂的生成及脂肪的沉積密切相關；擬桿菌門是降解碳水化合物的主要細菌，與瘤胃中丙酸的生成具有正相關關系。兩者在瘤胃發(fā)酵過程中起著至關重要的作用[19]。本試驗中，厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacte‐roidetes）屬于CK 組和SP 組的優(yōu)勢菌門，且SP 組厚壁菌門（Firmicutes）豐度極顯著高于CK 組。本試驗結果與前人的結果一致，說明飼喂發(fā)酵沙柳不影響瘤胃優(yōu)勢菌門，而且可以顯著提高厚壁菌門相對豐度。有研究表明，厚壁菌門（Firmicutes）與肥胖有關，消化系統(tǒng)內厚壁菌門增多會使機體吸收更多的能量，堆積大量的脂肪[20]；擬桿菌門能分解日糧中的糖類和蛋白質類大分子物質，協(xié)助宿主利用機體不能消化的多糖，提高對營養(yǎng)物質的消化吸收效率，增加育肥效果[21]。除以上兩門以外，CK 組相對豐度高于1%的菌門有變形菌門（Proteobacteria）、Kiritimatiellaeota、纖維桿菌門（Fibrobacteres）和Patescibacteria；SP 組中除厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門外，其他菌門相對豐度均低于1%。

在屬水平上，克里斯滕斯內拉菌（Christensenella?ceae_R-7_group）屬于厚壁菌門，可以利用各種糖類，產生揮發(fā)性脂肪酸，與機體代謝健康密切相關[22]。本試驗中，Christensenellaceae_R-7_group 是SP 組優(yōu)勢菌屬，且顯著性高于CK組，說明飼喂發(fā)酵沙柳可以促進Christensenellaceae_R-7_group的增殖。普雷沃氏菌屬（Prevotella_1）屬于擬桿菌門，主要參與飼糧中的半纖維的降解，并且能夠產生大量的復合酶，有促進非纖維性多糖和蛋白質的降解作用[23]?；艨『甑萚24]和陳蕓等[25]研究發(fā)現，隨著飼糧精粗比的提高，山羊瘤胃普雷沃菌屬豐度呈上升的趨勢。本試驗中，普雷沃氏菌屬是CK 組的優(yōu)勢菌屬，其豐度顯著高于SP 組，與霍俊宏等[24]和陳蕓等[25]的研究結果不同，可能是由于他們的試驗中對照組采用的燕麥秸稈和玉米青貯與發(fā)酵沙柳相比，半纖維素高于SP 組，利于普雷沃氏菌屬的增殖。

4 結論

發(fā)酵沙柳飼喂生長期母牛，降低了瘤胃液菌體蛋白含量，提高肉牛瘤胃微生物種的數量，增加瘤胃微生物多樣性的豐度，顯著提高厚壁菌門豐度。