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        發(fā)酵沙柳對西門塔爾后備母牛瘤胃發(fā)酵參數及微生物多樣性的影響

        2023-08-15 08:40:22李九月李長青張海鷹薛樹媛
        飼料工業(yè) 2023年15期

        ■ 王 超 田 豐 李九月 李長青 王 利 張海鷹 薛樹媛

        (內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院,內蒙古呼和浩特 010031)

        沙柳(Salix psammophila)為多年生沙生灌木,因其具有抗旱、耐貧瘠、耐嚴寒、抗風沙等特性,成為我國重要的防風固沙樹種,也是我國三北防護林首選樹種。由于沙柳含有豐富的營養(yǎng)物質和鈣、磷等礦物質元素,逐漸成為我國北方地區(qū)重要的粗飼料資源。薛樹媛[1]在對不同生長期沙柳營養(yǎng)成分的研究中發(fā)現,其粗蛋白(CP)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌性纖維(ADF)含量分別為6.3%~10.1%、32.4%~52.7%、30.9%~33.7%,體外瘤胃培養(yǎng)法測定沙柳粗蛋白的平均降解率為63.1%。崔瑞梅[2]報道,用尼龍袋法測定沙柳的粗蛋白降解率為68.9%,干物質降解率為38.7%,粗纖維降解率57.2%。李滿雙等[3]研究發(fā)現,發(fā)酵沙柳在體外培養(yǎng)中可以顯著提高瘤胃液微生物蛋白(MCP)和總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度,而且能降低瘤胃液pH、氨態(tài)氮(NH3-N)濃度、丁酸濃度以及乙酸/丙酸值,因此推斷沙柳具有較高的飼用價值,與許冬梅等[4]的研究結果一致。發(fā)酵飼料既可以有效保留飼料的營養(yǎng)成分,還可以長期貯存、不發(fā)生變質,而且發(fā)酵還可以提高飼料的消化利用率。王超等[5]研究表明,發(fā)酵全混合飼料在體外瘤胃培養(yǎng)中,可以促進瘤胃發(fā)酵,提高干物質、中性洗滌纖維降解率以及瘤胃纖維降解菌數量。因此,沙柳在飼喂過程中也采取發(fā)酵后再飼喂。而關于發(fā)酵沙柳對于肉牛生長性能、瘤胃發(fā)酵特性以及瘤胃微生物群影響的研究還未見報導。本研究用發(fā)酵沙柳飼喂西門塔爾母牛,探討其對瘤胃發(fā)酵特點和瘤胃微生物多樣性的影響。

        1 材料和方法

        1.1 發(fā)酵沙柳的制作

        2020 年10 月中旬收割沙柳,并利用揉絲粉碎機(9ZR-2.6,滄州昌鴻磨漿機械有限公司)將沙柳揉絲粉碎為2~3 cm 的絲段,添加適量的玉米粉、麩皮、糖蜜、青貯發(fā)酵劑,調節(jié)水分含量在55%左右,充分混合攪拌后,制作成裹包青貯,置于陽光房中發(fā)酵30 d待用。

        1.2 全混合日糧的配制

        根據肉牛生長需要量,結合燕麥秸稈、發(fā)酵沙柳、玉米秸稈黃貯營養(yǎng)含量,配制燕麥秸稈和發(fā)酵沙柳全混合日糧,日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

        1.3 試驗牛的選擇

        選擇18 頭體重為270~280 kg、生長狀況良好的12 月齡西門塔爾后備母牛,對所有牛進行統(tǒng)一編號、驅蟲免疫,其他管理措施按照牛場管理進行。將18頭牛隨機分為2組,每組9頭牛。

        1.4 試驗設計與飼養(yǎng)管理

        試驗在內蒙古錫林郭勒盟正藍旗桑格達來鎮(zhèn)查干淖爾家庭牧場進行,試驗時間為2020 年11 月—2021 年1 月,其中預試期10 d,試驗期55 d,對照組飼喂燕麥秸稈、玉米秸稈黃貯以及精飼料配制成全混合飼料,試驗組飼喂燕麥秸稈、發(fā)酵沙柳以及精飼料配制成全混合飼料。試驗期間每日07:00和18:00按照10~12 kg/頭的量投料,保證每天采食后料有剩余,試驗牛自由采食和飲水。

        1.5 樣品采集與處理

        用經口投胃管式瘤胃液采集裝置采集瘤胃液。將采集的瘤胃液分裝為3份,一份取8 mL放入預先加入2 mL 25%偏磷酸的15 mL 離心管中,測定瘤胃液中揮發(fā)性脂肪酸(VFA)含量;另取2份置于5 mL螺口離心管中,分別測定瘤胃液NH3-N、MCP 含量和瘤胃微生物多樣性。運輸過程中瘤胃液用液氮保存,帶回實驗室后-80 ℃冰箱保存。

        1.6 測定指標

        1.6.1 瘤胃發(fā)酵指標

        NH3-N 含量按照馮宗慈等[6]的比色法測定,VFA含量參照王超等[5]的方法測定,MCP 含量應用考馬斯亮藍比色法測定[7]。

        1.6.2 瘤胃微生物群態(tài)分布

        1.6.2.1 瘤胃液細菌DNA的提取

        將-80 ℃保存的瘤胃液樣品置于無菌操作臺,并放入冰水混合物中解凍后,利用E.Z.N.A.?Stool DNA Kit(Omega Bio-Tek公司,美國)提取瘤胃液中總DNA。用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質量,同時采用紫外分光光度計對DNA 進行定量,確認DNA純度。

        1.6.2.2 PCR擴增

        在V3~V4 區(qū) 域 利 用 引 物341F(5′-CCTAC‐GGGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTACHVGGG‐TATCTAATCC-3′)進行PCR 擴增,反應條件為98 ℃預變性30 s,98 ℃變性10 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,35 個循環(huán)后,72 ℃延伸10 min。PCR 產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,由AMPure XT beads(Beckman Coulter Genomics,Danvers,MA,USA)純化、Qubit(In‐vitrogen,USA)定量。

        1.6.2.3 PCR產物序列測定及分析

        PCR 產物在Illumina NovaSeq(LC-Bio 公 司,美國)平臺上進行測序(杭州聯(lián)川生物技術股份有限公司)。利用QIIME2 計算出超指數(Chao)、物種數目(observed species)、覆蓋度(goods coverage)、香濃指數(Shannon)、辛普森指數(Simpson)5 個指標。采用BLAST 進行序列比對,每個代表性序列用SILVA 數據庫對特征序列進行注釋。

        1.7 數據分析

        數據分析均利用Microsoft Excel 2019 軟件對試驗數據進行分析整理并制作圖表,同時采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學軟件對數據進行單樣本的t檢驗,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

        2 結果與分析

        2.1 發(fā)酵沙柳對牛瘤胃液發(fā)酵指標的影響

        由表2 可知,CK 組瘤胃液pH、NH3-N 含量低于SP 組,但均無顯著差異(P>0.05)。CK 組和SP 組的MCP 含量分別為3.34 mg/dL 和3.10 mg/dL,CK組顯著高于SP 組(P<0.05)。CK 組瘤胃液中VFA、乙酸、丙酸、丁酸含量以及乙酸/丙酸值都高于SP組,但均無顯著性差異(P>0.05)。

        表2 飼喂不同日糧對牛瘤胃液發(fā)酵參數的影響

        2.2 發(fā)酵沙柳對牛瘤胃微生物多樣性的影響

        2.2.1 Alpha多樣性指數

        由表3 可知,兩組超指數分別為1 410 和2 035,SP 組顯著高于CK 組(P<0.05);兩組之間的香濃指數分別為9.48 和9.71;辛普森指數分別為0.85 和0.81;覆蓋度分別為0.995 和0.989。香濃指數、辛普森指數和覆蓋度兩組間均無顯著差異(P>0.05)。

        表3 飼喂不同日糧對牛瘤胃細菌alpha多樣性指數的影響

        2.2.2 瘤胃細菌操作分類單元(OTU)分布維恩(Venn)圖以及瘤胃細菌組成

        由飼喂不同日糧的肉牛瘤胃液細菌OTU 數量Venn 圖(圖1)可知,CK 組的OTU 數量為1 410 個,SP組的OTU數量為2 015個,SP組OTU數量高于CK組,CK和SP共同OTU數量為333個。

        圖1 瘤胃細菌OTU分布Venn圖

        瘤胃微生物細菌在門水平共檢測到20 個細菌門,見圖2 和表4。厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)屬于優(yōu)勢菌門,Firmicutes 的相對豐度分別為47.75%和76.78%,CK 組極顯著低于SP 組(P<0.01),Bacteroidetes 的 相 對 豐 度 分 別 為32.68% 和19.05%,CK 組有高于SP 組的趨勢,但無顯著差異(P>0.05)。而變形菌門(Proteobacteria)、Kiritimatiellaeo‐ta、纖維桿菌門(Fibrobacteres)和Patescibacteria 是CK組中相對豐度高于1%的菌門,有高于SP 組的趨勢,但與SP組均無顯著差異(P>0.05)。

        表4 飼喂不同日糧對母牛瘤胃微生物多樣性的影響(%)

        瘤胃微生物細菌在屬水平共檢測到218 個(見圖3),相對豐度排名前20 的屬見表4。CK 組和SP 組的Christensenellaceae_R-7_group 的相對豐度分別為4.99%和24.95%,SP 組顯著高于CK 組(P<0.05)。CK組和SP 組的Prevotella_1 相對豐度分別為11.81%和0.71%,SP 組顯著低于CK 組(P<0.05)。SP 組理研菌屬和瘤胃菌屬相對豐度分別為9.80%和8.93%,有高于CK 組的趨勢,但無顯著差異(P>0.05)。CK 組Fi?brobacter、Ruminococcaceae_UCG-001、Succinivibriona?ceae_UCG-002、Bacteroidales_RF16_group_unclassified相對豐度高于SP組,無顯著差異(P>0.05)。

        圖3 瘤胃菌群屬水平結構組成柱形圖

        3 討論

        3.1 發(fā)酵沙柳對瘤胃液發(fā)酵指標的影響

        瘤胃液pH 是反芻動物瘤胃發(fā)酵水平的評價指標,pH 對瘤胃發(fā)酵至關重要。Qin等[8]研究發(fā)現,瘤胃液pH 在 6.60~6.80 可以保持適宜的纖維消化環(huán)境,如果日糧全是粗飼料,并且粗飼料中NDF 含量高,pH 變動范圍為 5.0~7.8。本試驗中,CK 組和SP 組瘤胃液pH 分別為6.82 和6.89,兩組之間無顯著差異,而且都處于pH 的正常變動范圍內,說明飼喂發(fā)酵沙柳與普通飼料一樣,對肉牛瘤胃液pH 沒有顯著影響。瘤胃微生物將飼料中的蛋白質和非蛋白氮降解為NH3-N,其中一部分又被瘤胃微生物利用,合成菌體蛋白[9]。瘤胃中NH3-N 濃度是瘤胃中微生物對日糧中氮源的消化利用情況的反映,也是蛋白質降解與菌體蛋白合成之間平衡關系的反映[10-11]。瘤胃微生物生長的最適合NH3-N 濃度為6.3~27.5 mg/dL[12]。菌體蛋白是瘤胃微生物利用NH3-N能力的反映,VFA由飼料中碳水化合物降解產生,為反芻動物提供總能量的70%~80%[13]。本試驗中,CK 組和SP 組NH3-N 濃度分別為11.92 mg/dL 和13.54 mg/dL,都屬于正常范圍內。SP 組MCP 含量顯著低于CK 組,SP 組與CK 組的TV‐FA、乙酸、丙酸含量均無顯著性差異,表明發(fā)酵沙柳的飼喂對于肉牛瘤胃內VFA 的生成無明顯的影響。本試驗中,pH、NH3-N 濃度、MCP 含量以及TVFA 含量均與李滿雙等[3]體外培養(yǎng)結果不同,可能是由于體外培養(yǎng)在穩(wěn)定的環(huán)境中進行,而動物飼喂時環(huán)境條件較惡劣,環(huán)境溫度最低時達-40 ℃低溫,冷應激導致體內外結果的差異。

        3.2 發(fā)酵沙柳對瘤胃微生物的影響

        3.2.1 發(fā)酵沙柳對alpha多樣性指數的影響

        Chao 指數是估計群落中含OTU 數目的指數,常用來估計物種總數,Shanno和Shimpson可反映瘤胃菌群的多樣性,Shanno 值越大群落多樣性越高;Shimp‐son 值越大群落多樣性越低。本試驗中,SP 組Chao 指數顯著高于CK 組,Shanno 有高于CK 組的趨勢,Shimpson 值有低于CK 組的趨勢。都表明發(fā)酵沙柳飼料的飼喂可以提高肉牛瘤胃微生物種的數量,增加瘤胃微生物多樣性的豐度。覆蓋度是對測序結果是否能真實反映樣本中微生物情況的說明,其數值越大說明樣本序列被測出的概率越大,未被測出的概率越小,一般覆蓋度高于97%時說明測序樣品取樣充分。本試驗中,CK 組和SP 組的覆蓋度分別為0.995%和0.989%,可以認為該測序結果能覆蓋瘤胃中大部分細菌群落,能很好地反映瘤胃微生物種類和結構。

        3.2.2 發(fā)酵沙柳對瘤胃細菌OTU 分布Venn 圖和瘤胃微生物多樣性的影響

        Venn 圖可以比較直觀地反映樣本的OTU 數、組成的相似性以及相互間的重疊情況。SP 組瘤胃細菌OTU 數量高于CK組,而且兩組之間差異比較大,說明發(fā)酵沙柳可以提高肉牛瘤胃細菌多樣性。

        瘤胃微生物對反芻動物營養(yǎng)代謝和健康發(fā)揮著重要作用,其種類和數目受飼糧結構的影響[14]。有研究表明,擬桿菌門與厚壁菌門是反芻動物瘤胃中的優(yōu)勢菌門[15-16],成熟反芻動物瘤胃中主要細菌相對豐富度:厚壁菌門56%、擬桿菌門31%、變形菌門4%[17-18]。厚壁菌門主要參與纖維物質的分解,與乙酸和乳脂的生成及脂肪的沉積密切相關;擬桿菌門是降解碳水化合物的主要細菌,與瘤胃中丙酸的生成具有正相關關系。兩者在瘤胃發(fā)酵過程中起著至關重要的作用[19]。本試驗中,厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacte‐roidetes)屬于CK 組和SP 組的優(yōu)勢菌門,且SP 組厚壁菌門(Firmicutes)豐度極顯著高于CK 組。本試驗結果與前人的結果一致,說明飼喂發(fā)酵沙柳不影響瘤胃優(yōu)勢菌門,而且可以顯著提高厚壁菌門相對豐度。有研究表明,厚壁菌門(Firmicutes)與肥胖有關,消化系統(tǒng)內厚壁菌門增多會使機體吸收更多的能量,堆積大量的脂肪[20];擬桿菌門能分解日糧中的糖類和蛋白質類大分子物質,協(xié)助宿主利用機體不能消化的多糖,提高對營養(yǎng)物質的消化吸收效率,增加育肥效果[21]。除以上兩門以外,CK 組相對豐度高于1%的菌門有變形菌門(Proteobacteria)、Kiritimatiellaeota、纖維桿菌門(Fibrobacteres)和Patescibacteria;SP 組中除厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門外,其他菌門相對豐度均低于1%。

        在屬水平上,克里斯滕斯內拉菌(Christensenella?ceae_R-7_group)屬于厚壁菌門,可以利用各種糖類,產生揮發(fā)性脂肪酸,與機體代謝健康密切相關[22]。本試驗中,Christensenellaceae_R-7_group 是SP 組優(yōu)勢菌屬,且顯著性高于CK組,說明飼喂發(fā)酵沙柳可以促進Christensenellaceae_R-7_group的增殖。普雷沃氏菌屬(Prevotella_1)屬于擬桿菌門,主要參與飼糧中的半纖維的降解,并且能夠產生大量的復合酶,有促進非纖維性多糖和蛋白質的降解作用[23]?;艨『甑萚24]和陳蕓等[25]研究發(fā)現,隨著飼糧精粗比的提高,山羊瘤胃普雷沃菌屬豐度呈上升的趨勢。本試驗中,普雷沃氏菌屬是CK 組的優(yōu)勢菌屬,其豐度顯著高于SP 組,與霍俊宏等[24]和陳蕓等[25]的研究結果不同,可能是由于他們的試驗中對照組采用的燕麥秸稈和玉米青貯與發(fā)酵沙柳相比,半纖維素高于SP 組,利于普雷沃氏菌屬的增殖。

        4 結論

        發(fā)酵沙柳飼喂生長期母牛,降低了瘤胃液菌體蛋白含量,提高肉牛瘤胃微生物種的數量,增加瘤胃微生物多樣性的豐度,顯著提高厚壁菌門豐度。

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