■ 尤 巧 李焱輝 王 彤 趙陸宇 彭文婷 王欣雨 林 凌 黃煒乾，2*

（1.安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽蕪湖 241000；2.清遠(yuǎn)一生自然生物研究院有限公司，廣東清遠(yuǎn) 511500）

自從20 世紀(jì)40 年代青霉素被應(yīng)用于醫(yī)療以來，各種抗生素被發(fā)現(xiàn)且廣泛使用[1]，其負(fù)面影響日漸突出；同時長期使用抗生素會造成畜禽機(jī)體的免疫力下降，引起畜禽腸道菌群失衡，在畜產(chǎn)品和環(huán)境中造成殘留等多種不良影響[2]，也導(dǎo)致細(xì)菌抗藥性越來越普遍和嚴(yán)重。為了應(yīng)對上述問題，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布了飼料“禁抗”令（第194號公告），明確了嚴(yán)禁使用11種含促生類藥物飼料添加劑（土霉素鈣預(yù)混劑、桿菌肽鋅預(yù)混劑、阿維拉霉素預(yù)混劑、恩拉霉素預(yù)混劑、喹烯酮預(yù)混劑、黃霉素預(yù)混劑、維吉尼亞霉素預(yù)混劑、那西肽預(yù)混劑、吉他霉素預(yù)混劑、金霉素預(yù)混劑、亞甲基水楊酸桿菌肽預(yù)混劑）。我國自2020 年7 月1 日起，飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑（中藥類除外）的商品飼料，并實施“全面禁止在飼料中添加促生長類抗生素”的法規(guī)[3-4]，采取了對飼料進(jìn)行“減抗/替抗”的措施[5]。抗生素替代品是應(yīng)形勢而生的綠色、無污染、無耐藥性的生物活性物質(zhì)，能夠在促進(jìn)動物生長的同時維護(hù)動物健康[6]。近年來，抗生素替代品的開發(fā)與應(yīng)用成為了畜牧業(yè)研究與生產(chǎn)的熱點問題[7]，也是促進(jìn)對養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的有力措施[8-10]。

益生菌（probiotic）是指由許多有益微生物及其代謝產(chǎn)物構(gòu)成的可以直接飼喂動物的活菌制劑[11-12]。益生菌對病原體的作用可能是通過競爭腸黏膜上的受體、競爭營養(yǎng)、產(chǎn)生抗菌物質(zhì)和刺激免疫來介導(dǎo)的[13-14]。與使用傳統(tǒng)抗生素相比，補(bǔ)充益生菌不僅能提高動物生長性能，還能維持腸道微生物的平衡，預(yù)防病原性疫病的發(fā)生，提高牲畜的生產(chǎn)效益。因此，益生菌作為一種新型的微生物飼料添加劑，是非致病性微生物，是潛在的重要的非抗生素替代品[15]。

芽孢桿菌屬（Bacillus）的細(xì)菌廣泛分布在不同的自然環(huán)境（如空氣、水、人類和動物腸道、蔬菜等）中[16]，被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)酶、抗生素、殺蟲劑、表面活性劑和精細(xì)生化制品，包括增味劑和食品添加劑等行業(yè)[17]。貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）是芽孢桿菌屬的一個新種[18]，在生長繁殖過程中能產(chǎn)生芽孢，為需氧或兼性厭氧革蘭氏陽性菌[19]。貝萊斯芽孢桿菌適應(yīng)能力強(qiáng)，分布廣泛，對于外界不良因素抵抗力強(qiáng)，生長快速且穩(wěn)定，不會對人體和環(huán)境造成危害。研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)（包括脂肽類、肽類等），對常見病原菌具有良好的抑制作用[20]，是重要的動植物病害生防微生物。對貝萊斯芽孢桿菌的深入研究，有助于未來解決抗生素濫用以及耐藥菌嚴(yán)重威脅人類健康安全等問題[21]。此外，該菌在生物防治、研發(fā)藥物和食品發(fā)酵等方面也有著重要應(yīng)用[22]。

近些年來，隨著對貝萊斯芽孢桿菌研究的不斷深入，人們開始探索其背后尚未人知的作用機(jī)制及其在生產(chǎn)領(lǐng)域中的運用。貝萊斯芽孢桿菌可作為生防菌得益于其所能產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)，對抗菌物質(zhì)的相關(guān)研究在生物防治中有著重要的意義。試驗通過分離鑒定獲得具有抑菌活性的貝萊斯芽孢桿菌，并通過對其相關(guān)抗菌特性的研究，探索其抗菌物質(zhì)的特性和抑制機(jī)制，以及在畜禽生產(chǎn)過程中的應(yīng)用和推廣潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗動物、菌株及日糧

試驗動物為商品羅曼灰蛋雞。

試驗所使用的貝萊斯芽孢桿菌BzAH-1 為分離所得，指示菌大腸桿菌MG1655和大腸桿菌DH5-GFP為本實驗室保存；酵母粉、蛋白胨購自O(shè)XOID 公司，所用化學(xué)純試劑均購自國藥集團(tuán)。

基礎(chǔ)飼糧組成：玉米62.5%，豆粕（46%）12%，膨化大豆11%，棉粕（46%）3%，碳酸鈣9.5%，磷酸氫鈣1%，食鹽0.25%，蛋氨酸0.15%。微量元素維生素預(yù)混料（預(yù)混料向每千克日糧提供：植酸酶50 mg，F(xiàn)e 50 mg，Cu 5.5 mg，Zn 65 mg，Mn 55 mg，I 1.5 mg，Se 0.3 mg，Co 0.2 mg；VA 9 800 IU，VD33 500 IU，VE 25 IU，VK32.2 mg，VB11.7 mg，VB25.5 mg，VB63.3 mg，VB1222 μg，泛酸6.8 mg，煙酸28 mg，生物素60 μg，葉酸0.6 mg）0.5%，氯化膽堿0.1%。

1.2 試驗試劑

LB 液體培養(yǎng)基(1 L)：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，pH調(diào)節(jié)至7.4。

LB 固體培養(yǎng)基(1 L)：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉15 g，pH調(diào)節(jié)至7.4。

檢測固體平板：將1 mL 1 OD600值為1（×108CFU/mL）的大腸桿菌MG1655菌液加入100 mL LB 固體培養(yǎng)基中，混勻后制備檢測平板。

檢測液體培養(yǎng)基：將1 mL OD600值為1（×108CFU/mL）的大腸桿菌MG1655菌液加入100 mL LB 液體培養(yǎng)基中，混勻后得到檢測液體培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5%、豆粕粉10%、硫酸銨1.0%、維生素B10.005%，pH調(diào)節(jié)至6.5。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的分離與鑒定

取海洋底泥樣品混勻在無菌水中，稀釋涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)，至長出單菌落。挑取單菌落分別點樣于檢測平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)1～3 d，選擇有抑菌圈的菌種進(jìn)行后續(xù)研究參考文獻(xiàn)方法[23]。

以提取的菌株基因組為模板，分別用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F（5′-AGA GTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。產(chǎn)物由通用生物(滁州)有限公司進(jìn)行DNA 序列測定，將測得的序列使用 NCBI 的BLAST 分析比較[24-25]。根據(jù)菌種比對結(jié)果，選擇親緣關(guān)系近的不同菌種序列，使用MEGA軟件制作進(jìn)化樹。

1.3.2 抗菌代謝物制備

將貝萊斯芽孢桿菌BzAH-1 單菌落接種于含有3 mL LB 液體培養(yǎng)基的西林瓶中，37 ℃，180 r/min，培養(yǎng)16 h。按1%(V/V)將菌液接種到200 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)20 h。培養(yǎng)液于9 000 r/min，4 ℃，15 min 離心后，上清液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，50 ℃真空干燥后得抗菌代謝物。

1.3.3 抗菌代謝物抑菌特性測定

1.3.3.1 抗菌代謝物的最低抑菌濃度

在西林瓶中分別加入0～90 mL 10%的抗菌代謝物和檢測液體培養(yǎng)基（總體積3 mL），以無菌水為陰性對照。37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)8 h，測定培養(yǎng)基中的菌體吸光度值OD600計算抑菌率。

1.3.3.2 抗菌代謝物的抑菌時間

取80 mL 10%的抗菌代謝物與檢測液體培養(yǎng)基混合于西林瓶中，設(shè)無菌水為空白對照。37 ℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)8 h，每隔1 h取樣稀釋涂布LB固體平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，觀察記錄平板的菌落數(shù)。

1.3.3.3 溫度對抗菌代謝物抗菌活性的影響

配制10%的抗菌代謝物溶液，分別置于50～100 ℃中水浴24 h，每隔2 h 取樣加入檢測液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min 恒溫?fù)u床培養(yǎng)8 h 后，計算不同溫度處理后的抗菌代謝物的抑菌率。

1.3.3.4 pH對抗菌代謝物抗菌活性的影響

參考《分子克隆實驗指南》[26]分別配制pH 2～11緩沖液（磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液pH 2～8 和碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液pH 9～11），將抗菌代謝物放入不同pH 緩沖液中靜置3 h 后，取80 mL 溶液進(jìn)行抗菌檢測，計算不同pH緩沖液處理后抗菌代謝物的抑菌率。

1.3.4 抗菌代謝物的抑菌機(jī)制

取80 mL 10%的抗菌代謝物與檢測液體培養(yǎng)基混合于西林瓶中，總體系的量為3 mL。置于37 ℃、180 r/min 恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，每隔2 h 取樣。樣品經(jīng)品紅染色、制片干燥后，將載玻片置于相差顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照，通過細(xì)胞形態(tài)變化進(jìn)一步分析抑菌機(jī)制。

取80 mL 10%的抗菌代謝物與檢測液體培養(yǎng)基混合于西林瓶中，總體系的量為3 mL。置于37 ℃、180 r/min 恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，每隔2 h 取樣。取樣后顯微觀察，樣品經(jīng)制片干燥后置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照，通過細(xì)胞在熒光下數(shù)量以及形態(tài)的變化進(jìn)一步來分析抑菌機(jī)制。

1.3.5 抗菌代謝物的生產(chǎn)應(yīng)用

將貝萊斯芽孢桿菌BzAH-1 接種于LB 固體培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)48 h進(jìn)行菌株活化；將活化的單菌落接種于含有200 mL LB 液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)20 h 得到種子液；將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、500 r/min 培養(yǎng)48 h，于培養(yǎng)過程中持續(xù)通入無菌空氣，制得發(fā)酵液；發(fā)酵液經(jīng)離心后，加入碳酸鈣5.0%和脫脂米糠5%，然后直接進(jìn)行噴霧干燥，制備得貝萊斯芽孢桿菌代謝物制劑。

選擇體重1.3 kg 左右的羅曼灰產(chǎn)蛋雞8 000 只，按飼養(yǎng)試驗要求隨機(jī)分成對照組（5 個對照組，每組800只）和試驗組（5個試驗組，每組800只），分別飼喂添加抗菌代謝物為0、200 mg/kg 的日糧。試驗雞采用群飼，自由采食，自由飲水。試驗期30 d，試驗期間每日記錄耗料量，飼養(yǎng)試驗結(jié)果時統(tǒng)計母雞的產(chǎn)蛋性能，計算試驗雞的產(chǎn)蛋率、爛蛋率、畸形蛋率和死亡率。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與鑒定

將海洋底泥中分離出來的菌株進(jìn)行平板劃線培養(yǎng)，獲得長勢良好的單菌落見圖1。菌落表面濕潤，為不透明的乳白色凸丘，且菌落邊緣不規(guī)則，呈現(xiàn)出典型的細(xì)菌形態(tài)特征。

圖1 目標(biāo)貝萊斯芽孢桿菌菌落

取液體培養(yǎng)獲得抗菌代謝物溶液進(jìn)行牛津杯抑菌檢測，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，測量平板上的抑菌圈大小，結(jié)果見圖2?？咕x物在檢測平板上形成了明顯的抑菌圈，具有明顯的抑菌效果，選取該菌種進(jìn)行后續(xù)研究。

圖2 抗菌代謝物的平板抑菌試驗

提取菌株的基因組DNA，擴(kuò)增 16S rDNA 序列測序，使用NCBI 的BLAST 及MEGA 軟件建立進(jìn)化樹確定菌株的分類地位，分析比較其與近源種屬的進(jìn)化關(guān)系(圖3)。結(jié)果顯示，目標(biāo)菌株的16S rDNA 基因序列與B.velezensisWh-1 的16S rDNA 序列位于系統(tǒng)發(fā)育樹同一分支，親緣關(guān)系最近，且它們都并歸于芽孢桿菌屬（Bacillus）中?；谝陨戏肿由飳W(xué)鑒定結(jié)果，結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特性，鑒定該菌株為貝萊斯芽孢桿菌Bacilus velezensis，命名為BzAH-1。

圖3 貝萊斯芽孢桿菌BzAH-1核糖體基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.2 貝萊斯芽孢桿菌BzAH-1的抗菌代謝物特性

2.2.1 抗菌代謝物的最低抑菌濃度

取不同濃度抗菌代謝物進(jìn)行抑菌試驗，結(jié)果見表1。隨著抗菌代謝物含量的不斷增加，菌液的吸光度值呈現(xiàn)下降趨勢，抑菌率增加。當(dāng)加入抗菌代謝物80 mL 時，菌液OD600與初始值一致，抑菌率為98.1%，幾乎完全抑制指示菌的生長。后續(xù)均采用80 mL 的抗菌代謝物進(jìn)行抑菌試驗。

表1 不同濃度抗菌代謝物的抑菌效果

2.2.2 抗菌代謝物的抑菌時間

取不同培養(yǎng)時間的抑菌反應(yīng)液稀涂布于LB 平板，37 ℃培養(yǎng)12 h 后觀察指示菌的生長狀況。結(jié)果見圖4。在培養(yǎng)的0～5 h 內(nèi)，平板上幾乎無指示菌的生長即抗菌代謝物持續(xù)發(fā)揮其抗菌作用；而在培養(yǎng)6 h后，平板上開出現(xiàn)菌落，表明抑菌效果開始減弱。因此，抗菌代謝物的有效抑菌時間約為6 h。

圖4 不同處理時間對指示菌生長的抑制作用

2.2.3 溫度對抗菌代謝物抗菌活性的影響

在不同溫度下處理抗菌代謝物溶液，獲得溫度對其活性的影響，結(jié)果見圖5。50～70 ℃處理24 h 的抗菌代謝物的抑菌活性無明顯變化；處理溫度達(dá)到80 ℃時，抗菌代謝物穩(wěn)定性開始下降；100 ℃處理4 h后抗菌代謝物將失活。

圖5 溫度對抗菌代謝物抗菌活性的影響

2.2.4 pH對抗菌代謝物抗菌活性的影響

如圖6、圖7 所示，抗菌代謝物在pH 2～11 的緩沖液中處理3 h 后，抑菌活性沒有明顯變化。該結(jié)果表明抗菌代謝物結(jié)構(gòu)性質(zhì)非常穩(wěn)定，可以耐受環(huán)境酸堿度對其活性和穩(wěn)定性的影響。

圖6 抗菌代謝物對不同pH環(huán)境的耐受性

圖7 不同pH對代謝物抗菌活性的影響

2.3 抗菌代謝物的抑菌機(jī)制

將抗菌代謝物處理2、4、6、8 h 的菌液樣品染色、干燥制片后，于相差顯微鏡下進(jìn)行觀察，結(jié)果見圖8。空白對照樣品隨著培養(yǎng)時間的增加，指示菌的數(shù)量和大小也不斷的增多和增大；而加入抗菌代謝物的樣品中，指示菌的形態(tài)較小且雜亂，推測抗菌代謝物可使細(xì)菌的細(xì)胞膜破裂從而發(fā)揮抑菌作用。隨著培養(yǎng)時間的增加，抗菌代謝物抑菌效果下降后，剩余指示菌則又開始恢復(fù)生長。

圖8 相差顯微分析指示菌形態(tài)變化

將處理2、4、6、8 h獲取的樣品制作載玻片于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。結(jié)果見圖9?？瞻讓φ罩械闹甘揪臄?shù)量和大小都隨著培養(yǎng)時間增加而不斷的增多和增大；而試驗組指示菌的細(xì)胞數(shù)量隨著培養(yǎng)時間增加而不斷的減少，指示菌的大小也隨著培養(yǎng)時間增加而不斷的減小。因此，抗菌代謝物可能通過作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)引起細(xì)胞破裂從而發(fā)揮其抑菌作用。

圖9 熒光顯微分析指示菌形態(tài)變化

2.4 貝萊斯芽孢桿菌BzAH-1抗菌代謝物的應(yīng)用

選擇產(chǎn)蛋母雞8 000只隨機(jī)分配為對照組和試驗組，對照組喂食正常日糧，試驗組在正常日糧中添加200 mg/kg 的代謝物制劑，試驗期30 d，自由采食和飲水，結(jié)果見表2。代謝物制劑的添加明顯提高了蛋雞的生產(chǎn)性能，不僅將產(chǎn)蛋率提高了4.63%，同時死亡率降低28.5%，爛蛋和畸形蛋分別降低22.3% 和37.5%。

表2 貝萊斯芽孢桿菌BzAH-1抗菌代謝物對蛋雞產(chǎn)蛋性能的影響（%）

3 討論

近年來，人們對食品安全越來越關(guān)注，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用已成為當(dāng)務(wù)之急。隨著綠色健康發(fā)展的深入推進(jìn)，我國越來越重視化學(xué)農(nóng)藥和抗生素的使用，努力緩解其對環(huán)境的重大負(fù)面影響。因此，作為飼料添加劑的益生菌及抗菌代謝物的研發(fā)，有助于提高畜禽產(chǎn)品質(zhì)量、促進(jìn)綠色畜牧業(yè)的發(fā)展，顯示出廣闊的應(yīng)用前景[27]。本試驗結(jié)果顯示，貝萊斯芽孢桿菌BzAH-1 作為一種革蘭氏陽性好氧細(xì)菌，在抑制病原菌和生物防治方面具有顯著的優(yōu)點。其發(fā)酵代謝產(chǎn)物中富含的抗菌物質(zhì)對大腸桿菌的生長和繁殖具有很強(qiáng)的抑制和殺滅作用。該抗菌代謝物質(zhì)可以耐受24 h 70 ℃的高溫而不喪失活性，其耐酸性可以耐受蛋雞酸性胃液的腐蝕，從而維持制劑的生物活性，使其進(jìn)入蛋雞腸道發(fā)揮抗菌、保健的作用。此前，多數(shù)學(xué)者報道芽孢桿菌具有較好的殺滅病原微生物的作用，在日糧中添加抗菌物質(zhì)能促進(jìn)腸道健康，能保證雞健康生長[28]，同時改善蛋雞的產(chǎn)蛋性能[29]。杭柏林等[30]學(xué)者發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌在一定程度上可以代替飼用抗生素的使用，具有良好的應(yīng)用價值。而在肉仔雞生產(chǎn)中使用抗菌肽、復(fù)合酸化劑可以顯著增強(qiáng)體液免疫，改善腸道形態(tài)健康，提高肉仔雞生長性能、營養(yǎng)物質(zhì)代謝率[31-32]。貝萊斯芽孢桿菌作為益生菌具有很大的開發(fā)潛力，可以減少抗生素對動物和環(huán)境的危害，并有可能在未來取代抗生素成為一種新藥[32]。研究同樣證明，貝萊斯芽孢桿菌BzAH-1 制備的代謝物制劑對羅曼灰商品蛋雞具有良好的促生產(chǎn)作用，與前人研究的結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，貝萊斯芽孢桿菌BzAH-1 的抗菌代謝物質(zhì)的添加提高了蛋雞的生產(chǎn)性能，不僅能夠提高產(chǎn)蛋率，減少了爛蛋和畸形蛋的產(chǎn)生，同時也降低了死亡率，達(dá)到了良好的生產(chǎn)應(yīng)用效果。