■ 和子涵 穆廣亞 賈一然 張曉彤 馮軍廠 常緒路 張建新

（河南師范大學水產(chǎn)學院，河南新鄉(xiāng) 453007）

β-甘露聚糖酶（β-1,4-mannanase）作為一種內(nèi)切水解酶，在飼料、食品以及造紙等領域得到廣泛的應用。飼料中添加β-甘露聚糖酶，動物腸道內(nèi)能利用甘露聚糖作為底物進行水解，產(chǎn)生功能性糖類甘露寡糖，從而達到消除抗營養(yǎng)因子的功能，且在家禽飼料中添加β-甘露聚糖酶可以提高家禽體重和飼料利用率，改善家禽腸道環(huán)境，提高家禽免疫力[1-2]。在食品方面，β-甘露聚糖酶能夠水解果汁中半纖維素的甘露聚糖部分，降低其黏度并釋放其中的水分，可顯著提高不同果汁的澄清度和產(chǎn)量[3]。在造紙方面，β-甘露聚糖酶對軟木紙漿中的半乳甘露聚糖具有高度特異性，可以防止紙漿纖維進一步水解，同時也可以減少漂白過程中化學品的使用，具有成本效益和環(huán)境友好性[4-5]。

近年來，國內(nèi)外研究人員為了增加β-甘露聚糖酶的酶活性及穩(wěn)定性，研究方向逐漸從篩選產(chǎn)酶菌株、物理化學誘變育種以及酶蛋白的純化，轉(zhuǎn)移到了對異源表達高效β-甘露聚糖酶基因工程菌的構建。唐嘉婕等[6]將甘露聚糖酶在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中進行異源表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異源表達酶具有較高酶活性，且在堿性環(huán)境下表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性。田庚等[7]應用PCR 方法對地衣芽孢桿菌KD-1β-甘露聚糖酶基因ManBl進行基因克隆和定點突變，提高了酶活性及穩(wěn)定性。Summpunn 等[8]將重組β-甘露聚糖酶基因?qū)氪竽c桿菌BL21（DE3）（415.18 U/mL）和巨大芽孢桿菌UNcat（359 U/mL）中，均得到高效表達。

枯草芽孢桿菌YZ-21 是從椰果中分離到的一株具有較高β-甘露聚糖酶活性的植物內(nèi)生菌，優(yōu)化后酶活性達126.45 U/mL。為了提高β-甘露聚糖酶的產(chǎn)酶活性及穩(wěn)定性，利用基因克隆技術從枯草芽孢桿菌YZ-21 基因組DNA 中克隆得到β-甘露聚糖酶基因，并對其序列結(jié)構以及酶學性質(zhì)進行分析。本研究通過對重組β-甘露聚糖酶分子結(jié)構以及酶學性質(zhì)進行分析，以期為重組β-甘露聚糖酶的進一步優(yōu)化改造提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗菌株與載體：枯草芽孢桿菌YZ-21、大腸桿菌（JM109 和BL21）和表達載體pET-32a(+)為河南師范大學保存菌株，菌種活化與培養(yǎng)按照Zhang[9]中的方法進行。載體pMD19-T、限制性核酸內(nèi)切酶、蛋白Marker均購自TaKaRa生物科技有限公司。

試劑：膠回收試劑盒購自生物工程股份有限公司；其余試劑均為市購的國產(chǎn)分析純。

1.2 DNA的提取

枯草芽孢桿菌YZ-21 基因組DNA 提取，參考姚斌等[10]的方法。

1.3 β-甘露聚糖酶基因片段的克隆及序列分析

根據(jù)NCBI 已報道的β-甘露聚糖酶基因序列，使用序列分析軟件DNAMAN 6.0 進行保守序列分析，并通過Primer 5.0 設計引物，上游引物為5′-ATGAACT‐GGCTTGCACAC-3′，下游引物為5′-ACTCAACGATT‐GGCGTTA-3′，以基因組DNA 為模板進行PCR 擴增，并通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將擴增的基因片段連接至T 載體，并轉(zhuǎn)化到JM109 感受態(tài)細胞中，菌落PCR 鑒定陽性克隆之后送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序。將所測序列通過NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行序列比對，蛋白質(zhì)分子高級結(jié)構預測通過瑞士生物信息研究所SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）檢索并進行同源建模。

1.4 基因工程菌的構建

根據(jù)基因酶切位點預測和pET-32a(+)多克隆位點組成，選擇BamH Ⅰ和HindⅢ為酶切位點，設計引物為MAN-F2：5′-CGGGATCCATGAACTGGCTTGCA‐CAC-3′，MAN-R2：5′-CCAAGCTTACTCAACGATTG‐GCGTTA-3′（下畫線部分為酶切位點）。將表達載體pET-32a（+）與ManA片段進行雙酶切，酶切體系：重組質(zhì)粒5 μL，10× Buffer 2 μL，BamH I 2 μL，HindⅢ2 μL，ddH2O 9 μL。雙酶切后連接并轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，連接體系：ManA10 μL，pET-32a(+) 2 μL，T4 連接酶2 μL，10×Buffer 2 μL，ddH2O 4 μL。

1.5 ManA基因在大腸桿菌中的誘導表達

將陽性克隆進行擴大培養(yǎng)，當OD600吸光度值達到0.6 時，加入IPTG（24 mg/mL）誘導表達培養(yǎng)10～12 h，5 000 r/min 離心5 min 收集菌體，用pH 7.0 的磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸菌體，超聲破碎儀65 Hz 下處理細胞，直至細胞完全破碎，12 000 r/min 離心5～10 min，上清液即為粗酶液，吸出保存。

1.6 SDS-PAGE電泳分析

重組β-甘露聚糖酶SDS-PAGE 電泳分析參考張建新等[11]的方法進行。

1.7 重組β-甘露聚糖酶酶學性質(zhì)的測定

1.7.1 溫度對重組酶活性和穩(wěn)定性的影響

將制得酶液和底物加入試管，混合均勻后放入溫度分別為30、40、50、60、70、80 ℃的水浴鍋中，充分反應后將試管放入冰水中迅速冷卻，加DNS試劑沸水浴反應5 min，在540 nm波長處測定吸光度值并計算酶活性，確定最佳反應溫度。將酶液置于35、40、45、50、55、60 ℃恒溫水浴鍋中分別處理30、60、90、120 min后，與底物反應并測定活性，對照不做任何處理，確定重組酶的穩(wěn)定性。每個處理進行3個重復，每個重復進行3個平行。

1.7.2 pH對重組酶活性和穩(wěn)定性的影響

參照張建新等[12]的方法配制不同pH（pH 3.0～10.0，間隔1.0）的緩沖液，與酶液混合后加入底物，置于最適反應溫度下充分反應并測定酶活性。重組酶的穩(wěn)定性測定方法為取不同pH 的緩沖液與酶液混合，最適溫度下水浴30 min，充分反應后調(diào)整pH 為7.0，測定并計算酶相對活性。

1.7.3 金屬離子及乙二胺四乙酸（EDTA）對重組酶活性的影響

將金屬離子Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Co2+、Ba2+、Na2+、K2+及EDTA 與酶液按照1：1比例添加至1.5 mL離心管中，在最適溫度下充分反應，測定其活性，并計算相對活性。

1.7.4 底物特異性

底物分別由1%魔芋粉、刺槐豆膠和瓜豆膠配制，將粗酶液與不同底物混合后在最適溫度和pH 下充分反應，并使用DNS法測定酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-甘露聚糖酶基因片段的克隆和序列分析

使用特異性引物通過48、50、52、54、56 ℃五個退火溫度進行PCR 擴增，并進行瓊脂糖凝膠電泳，從菌株YZ-21 基因組DNA 中擴增出一條大小約1 000 bp的基因片段（見圖1），其中54 ℃條帶最亮，可以作為PCR 反應的退火溫度。測序結(jié)果顯示，基因片段長1 104 bp，編碼367 個氨基酸，理論分子質(zhì)量大小約41.57 ku，等電點pH 7.62。將測序結(jié)果通過BLAST分析，并使用Mega 7.0 構建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖2），其中Bacillus subtilisWL-8、Bacillus licheniformisHDYM-04 和Bacillus pumilusCCAM080065 與YZ-21 親 緣 關系相近，且都屬于糖苷水解酶26家族（GH26），說明本試驗ManA同屬于GH26。

圖1 不同退火溫度PCR電泳分析

圖2 不同來源β-甘露聚糖酶氨基酸序列聚類分析

2.2 蛋白質(zhì)三維結(jié)構分析

將蛋白質(zhì)序列使用SWISS-MODEL（https://swiss‐model.expasy.org/interactive）在線軟件進行檢索并同源建模，發(fā)現(xiàn)擴增得到的目的序列與枯草芽孢桿菌YdhT 蛋白A 鏈（PDB：3cbw.1.A）的氨基酸序列相似性為97.65%（見圖3）。如圖4 所示，構建好的三維結(jié)構模型包含14 個α螺旋、16 個β折疊股，其頂部可看出β-甘露聚糖酶的催化域采用一定的折疊方式形成TIM 桶狀結(jié)構（見圖4b），這與GH26 家族的β-甘露聚糖酶三維結(jié)構一致。

圖3 β-甘露聚糖酶氨基酸序列比對

圖3（續(xù)）β-甘露聚糖酶氨基酸序列比對

圖4 YZ-21 β-甘露聚糖酶三維結(jié)構模型

2.3 原核表達載體的構建

以YZ-21 基因組DNA 作為模板進行PCR 擴增，電泳結(jié)果顯示在1 000 bp處有單一條帶（見圖5）。將單一條帶進行切膠回收，并用T4 連接體系于PCR 儀中16 ℃連接12 h，用BamH Ⅰ和HindⅢ對連接產(chǎn)物和載體pET-32a(+)進行雙酶切，之后用T4 連接酶于PCR 儀中16 ℃連接12 h，構建重組表達質(zhì)粒pETManA。篩選陽性克隆并進行驗證，結(jié)果如圖6 所示，在1 000 bp 處有單一條帶，證明pET-ManA為陽性重組質(zhì)粒。

圖5 ManA 基因片段PCR電泳圖譜

圖6 重組表達質(zhì)粒pET-ManA的電泳圖譜

2.4 重組蛋白誘導表達

將篩選的陽性克隆擴大培養(yǎng)后進行超聲處理，并使用SDS-PAGE 檢測，結(jié)果如圖7 所示，泳道3 和4 相比泳道1（空載體）和泳道2（未誘導表達）有一條特異表達條帶，約在56.07 ku 的位置附近，表明基因成功表達，且酶活性可達到372.86 U/mL。

圖7 重組β-甘露聚糖酶SDS-PAGE電泳圖譜

2.5 重組β-甘露聚糖酶的酶學性質(zhì)

2.5.1 溫度對重組β-甘露聚糖酶活性的影響

在不同反應溫度下測定重組β-甘露聚糖酶酶學性質(zhì)，結(jié)果如圖8 所示，重組酶在溫度低于50 ℃時具有較高活性，其中40 ℃時活性最高達436.75 U/mL，溫度高于50 ℃后活性迅速降低。不同溫度對重組酶穩(wěn)定性的影響見表1，當溫度為35～55 ℃時較為穩(wěn)定，當溫度達60 ℃時活性顯著下降，保溫120 min 相對活性僅為8.1%，因此重組酶性在溫度低于55 ℃時具有良好的穩(wěn)定性。

表1 不同溫度對重組β-甘露聚糖酶穩(wěn)定性的影響

圖8 溫度對重組β-甘露聚糖酶活性的影響

2.5.2 pH對重組β-甘露聚糖酶活性的影響

pH 對重組酶活性的影響如圖9（a）所示，在pH為6.0～8.0 范圍內(nèi)活性較高，其中最適pH 為7.0，在pH 3.0 及pH 10.0 的酸堿條件下，活性相對較低。重組酶在不同pH 下的穩(wěn)定性情況如圖9（b）所示，當pH 7.0 時酶活性最為穩(wěn)定，在pH 4.0～9.0 時，相對酶活性仍可達到60%以上，因此，重組酶具有較好的pH穩(wěn)定性。

圖9 pH對重組β-甘露聚糖酶活性和穩(wěn)定性的影響

2.5.3 金屬離子和EDTA 對重組β-甘露聚糖酶活性的影響

添加不同的金屬離子對重組酶有不同的影響，結(jié)果如圖10所示，Ca2+、Co2+和Ba2+對重組β-甘露聚糖酶有顯著激活作用，其中Co2+可使相對酶活性提高54.6%；金屬離子Mg2+、K+、Na+對重組酶沒有明顯影響，但Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+以及EDTA 對重組酶表現(xiàn)出抑制作用，其中Zn2+的抑制能力最強，可使相對酶活性降低68.5%。

圖10 常見離子及EDTA對重組β-甘露聚糖酶活性的影響

2.5.4 底物特異性

當以瓜豆膠作為底物時重組酶活性能夠達到392.54 U/mL，而以魔芋粉和槐豆膠作為底物時酶活相對較低（見圖11），因此重組酶的最佳底物為瓜豆膠（瓜豆膠屬于半乳甘露聚糖）。

圖11 重組β-甘露聚糖酶底物特異性

3 討論

目前已有大量研究表明，β-甘露聚糖酶基因能夠在異源宿主中高效表達，并應用于工業(yè)及飼料行業(yè)[13]。細菌來源的β-甘露聚糖酶基因通常在大腸桿菌中被表達[14]，但也能在其他宿主如枯草芽孢桿菌[15]和畢赤酵母菌[16]中被表達。本研究從枯草芽孢桿菌中克隆的β-甘露聚糖酶基因并在大腸桿菌中成功表達，其基因大小為1 104 bp，表達的蛋白質(zhì)為56.07 ku。有研究報道，枯草芽孢桿菌來源的β-甘露聚糖酶基因大小為1 086 bp，分子質(zhì)量大小為38 ku[17]，另有研究在Bacillussp.N16-5 中克隆的β-甘露聚糖酶基因大小為1 479 bp，分子質(zhì)量為55 ku[18]，與本研究結(jié)果相近。

提高β-甘露聚糖酶的活性及穩(wěn)定性是體外表達目的之一。張丹陽等[19]從枯草芽孢桿菌G1 中克隆表達的β-甘露聚糖酶在溫度50～70 ℃間、pH 4.5～7.0 的范圍內(nèi)能保持較好的穩(wěn)定性。成莉鳳等[20]從枯草芽孢桿菌BE-91 菌株中克隆的β-甘露聚糖酶基因產(chǎn)胞外β-甘露聚糖酶的活性可達229.1 U/mL，穩(wěn)定溫度≤65 ℃，穩(wěn)定pH 為4.5～7.0。本研究表達的重組β-甘露聚糖酶活性能夠達到392.54 U/mL，并且溫度在55 ℃以及pH 5.0～9.0的條件下活性相對穩(wěn)定，表明重組β-甘露聚糖酶具有良好的穩(wěn)定性。

據(jù)報道，產(chǎn)β-甘露聚糖酶的枯草芽孢桿菌YH12[21]和芽孢桿菌PN11[22]等菌株在進行酶學性質(zhì)相關研究時均表現(xiàn)出對刺槐豆膠有最高親和力，而本研究所用菌株YZ-21 在底物特異性試驗中發(fā)現(xiàn)對瓜豆膠的親和力較高。此外Ba2+、Ca2+、Co2+對重組酶有明顯的激活作用，Liu 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，Co2+，Mn2+，Zn2+，Ba2+和Ca2+能夠激發(fā)β-甘露聚糖酶活性，與本研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本研究從椰果內(nèi)生枯草芽孢桿菌YZ-21 中克隆的β-甘露聚糖酶基因在大腸桿菌中能高效表達，對環(huán)境具有良好的穩(wěn)定性。對重組酶酶學性質(zhì)與底物特異性進行相關研究發(fā)現(xiàn)，重組β-甘露聚糖酶對瓜豆膠的轉(zhuǎn)化性較高，且Ca2+、Co2+對酶活有明顯的增強作用，為重組β-甘露聚糖酶在工業(yè)中應用奠定了基礎。