朱麗,袁佳璐,付尚辰,李林強,劉永峰

(陜西師范大學 食品工程與營養(yǎng)科學學院,陜西 西安,710062)

羊乳是世界公認最接近母乳的乳品,被譽為“乳中珍品”。來自聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織的數(shù)據(jù)顯示,2018年全球羊奶產(chǎn)量已達1 500萬t以上,成為全球第三大生產(chǎn)類型的乳品[1]。乳清是奶酪制作過程中的副產(chǎn)物,由水(93%～94%)、乳糖、可溶性乳蛋白α-乳白蛋白(α-lactalbumin, α-La)和β-乳球蛋白(β-lactoglobulin, β-Lg)、乳鐵蛋白、免疫球蛋白、酪蛋白大肽、乳脂、鈣、B族維生素、支鏈氨基酸、含硫氨基酸和8種必需氨基酸組成[2],質(zhì)量較高的乳清可應(yīng)用于嬰幼兒奶粉的添加。乳清蛋白約占乳品中總蛋白20%,鈣和磷含量約為總鈣和總磷的38%和50%[3]。乳清中含有的生物活性因子可增強腸道免疫應(yīng)答,并促進學習以及記憶能力,可能有助于嬰兒生長發(fā)育[4]。

常用乳清蛋白的分離方法有等電點沉淀法(堿溶酸沉)、鹽析法、膜過濾法、泡沫分離法和離子交換色譜法等[5]。MARUYAMA等[6]研究表明,在pH為7時泡沫分離法對乳清蛋白的分離效果最好和分離速率最高[6]。SANMARTN等[7]利用熱鈣沉淀法分離出澄清乳清,通過膜技術(shù)生產(chǎn)綿羊乳清濃縮蛋白。邵鉞馨等[3]發(fā)現(xiàn)單一處理不能較好去除羊奶中的酪蛋白,使用離心結(jié)合等電點沉淀法對羊奶中酪蛋白去除率較高。陳靜廷等[8]研究發(fā)現(xiàn)超速離心和等電點沉淀法均可以有效去除乳制品中的酪蛋白,并且一些含量較低的蛋白檢出的靈敏度增加。酸法等電點沉淀和酶解法對牛奶中酪蛋白的去除率較高,其中乳酸去除酪蛋白和保留乳清蛋白的效果比檸檬酸和鹽酸法好[9]。然而大多數(shù)分離方法都具有一定缺點,如色譜法效率低且成本太高;堿、熱等條件可能會影響蛋白結(jié)構(gòu),造成蛋白質(zhì)變性,破壞營養(yǎng)蛋白等,對乳清蛋白的分離效果都并不理想。酸沉淀法能快速將乳中的酪蛋白分離,得到酸乳清。這種方法得到乳清的成本低,耗時短,是常用的乳清分離方法,但是不同酸對酪蛋白的去除效果和對乳清成分的影響尚不明確。

本研究擬以鮮羊奶為原料,研究5種乳清提取方法(離心法、鹽酸法、乙酸法、檸檬酸法和乙醇分級沉淀法)對酪蛋白的去除率的效果,并對5種方法得到的乳清進行指標測定,評估各方法的分離提取效果,期望獲得純度較高和品質(zhì)較好的乳清蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮羊奶購買于陜西省西安市長安區(qū)奶山羊養(yǎng)殖大戶,羊奶采集后放置在冰盒中于4 ℃,帶回實驗室。鹽酸、乙酸、檸檬酸、無水乙醇、尿素,均為分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司;5,5′-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(dithio-bis-nitrobenzoic acid,DTNB)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA),美國Thermo Fisher Scientific公司;甘氨酸,美國Sigma公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris),北京Biotopped公司。

1.2 主要儀器

NanoBrook 90Plus PALS型激光粒度Zeta電位儀,美國布魯克海儀器公司;TM3030型臺式掃描電子顯微鏡,日本日立公司;Nicolet iS10型傅里葉紅外光譜分析儀,美國賽默飛世爾公司;NS800型色差儀,深圳三恩馳科技有限公司;TGL-16gR型離心機,上海安亭科學儀器廠;UV-1200紫外可見分光光度計,上海美析儀器有限公司;PHS-3C型雷磁精密pH計,上海精密科學儀器有限公司。

1.3 乳清制備

鮮羊奶在4 ℃下7 500 r/min離心20 min進行脫脂,得到的脫脂羊奶分5組,每組50 mL。離心法提取乳清:4 ℃、12 000 r/min離心30 min,收集上清液;鹽酸法、乙酸法和檸檬酸法提取乳清:分別用1 mol/L鹽酸、10%(體積分數(shù))乙酸和1 mol/L檸檬酸調(diào)pH值至4.3后,4 ℃、5 000 r/min離心10 min,獲得的上清液為乳清;乙醇分級沉淀提取乳清參考邵鉞馨等[3]的方法。

1.4 酪蛋白去除率測定

1.4.1 乳清中總蛋白濃度測定

乳清中蛋白濃度依據(jù)二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度檢測試劑盒進行測定。

1.4.2 SDS-PAGE分析

參考CHEN等[10]的方法,并稍作改進。配制12%分離膠灌入膠板中,待分離膠凝固后,配6%濃縮膠于膠板中,并快速插好梳子等待凝固。將乳清與蛋白上樣緩沖液混合后95 ℃加熱5 min使蛋白質(zhì)完全變性,每個樣品上樣10 μL,進行凝膠電泳。電泳結(jié)束后,使用考馬斯亮藍R250染色2 h,用脫色液脫色直至條帶清晰可見,使用凝膠成像儀對蛋白條帶進行拍照,得到的條帶使用Image J進行灰度分析。

1.5 酪蛋白去除率測定

1.5.1 色澤測定

取5 mL分離的乳清于培養(yǎng)皿中進行感官顏色觀察,后使用色差儀進行色澤測定。首先,色差儀進行黑白板矯正,待矯正結(jié)束后進行乳清色澤測定。

1.5.2 乳清微觀結(jié)構(gòu)觀察

參考TANG等[11]的方法,并稍作改進。將不同分離方法得到的乳清進行冷凍干燥,取乳清粉放置在導電膠上,噴金后進行掃描電子顯微鏡觀察。

1.5.3 粒徑和Zeta電位測定

參考MARKOSKA等[12]的方法,并稍作改進。取適量乳清稀釋100倍,使用激光粒度Zeta電位儀進行粒度和電位測定。測定粒度的參數(shù):測定溫度25 ℃,平衡時間60 s,測定時間90 s;測定Zeta電位的參數(shù):測定溫度25 ℃,平衡時間90 s,循環(huán)次數(shù)20次。

1.5.4 傅里葉紅外光譜測定

參考TANG等[11]的方法。取少量烘干的乳清粉與KBr以1∶200的質(zhì)量比例研磨并均勻混合后壓片,使用傅里葉紅外光譜儀進行測定。參數(shù)設(shè)置:波束范圍4 000～400 cm-1,分辨率4 cm-1,掃描次數(shù)30次。

1.5.5 游離巰基含量測定

參考沈海斌等[13]的方法。取0.5 mL稀釋后樣品,加入5 mL尿素緩沖溶液(尿素240 g,Tris 5.2 g,甘氨酸3.45 g,EDTA 0.6 g,蒸餾水定容至500 mL,pH 8.0),再加入20 μL的埃爾曼試劑(DTNB 200 mg,溶解于Tris 520 mg,甘氨酸 345 mg,EDTA 60 mg,pH 8.0,定容至50 mL溶液),避光反應(yīng)15 min,使用紫外分光光度計在412 nm處測定吸光度。根據(jù)公式(1)計算游離巰基含量[14]:

(1)

式中:SH,游離巰基含量,μmol/g;D,稀釋系數(shù);C,乳清的蛋白質(zhì)量濃度,mg/mL;A412,樣品在412 nm處的OD值。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個指標測定3次,最終試驗結(jié)果表示為平均值±標準差,使用SPSS 19進行單因素方差分析,Origin 2018進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳清中總蛋白濃度分析

如圖1所示,離心法提取乳清的蛋白質(zhì)量濃度顯著高于其他各組的蛋白質(zhì)量濃度(P<0.05),其中離心法提取乳清的蛋白質(zhì)量濃度高于乙醇分級沉淀法1.86倍(P<0.05)。鹽酸法、乙酸法和檸檬酸法提取乳清的蛋白質(zhì)量濃度無顯著差異(P>0.05),蛋白質(zhì)量濃度分別為(8.102±1.091)、(7.467±0.132)、(7.831±1.076) mg/mL。

圖1 不同分離方法得到乳清的蛋白含量

2.2 乳清中蛋白組分酪蛋白去除率分析

2.2.1 乳清中蛋白組分分析

如圖2所示,離心法和乙醇分級沉淀提取乳清中酪蛋白的去除效果較差,但是3種酸處理后得到乳清樣品的酪蛋白條帶較窄而且比較淺,說明這3種方法去除酪蛋白的效果比較好。鹽酸法和乙醇分級沉淀法提取乳清中,α-La條帶的亮度較淺,離心法、乙酸法和檸檬酸法提取的乳清中α-La的亮度與鮮羊奶相比無明顯變化。乙醇分級沉淀法提取乳清中β-Lg條帶亮度明顯比其他4種方法暗。因此,乙酸法和檸檬酸法能更好保留乳清中的蛋白質(zhì)。

圖2 不同分離方法得到的乳清的SDS-PAGE圖

2.2.2 酪蛋白去除率分析

如表1所示,離心方法提取乳清的酪蛋白去除率只有(15.70±1.50)%,乙醇分級沉淀法酪蛋白去除率為(44.20±2.00)%,但是經(jīng)過鹽酸、乙酸和檸檬酸處理后,酪蛋白去除率達到了72%以上。因此,鹽酸法、乙酸法和檸檬酸法提取乳清殘留量顯著低于離心法和乙醇分級沉淀法(P<0.05)。

表1 不同分離方式得到的乳清的酪蛋白去除率結(jié)果

2.2.3 酪蛋白灰度值分析

如圖3所示,離心法與檸檬酸法得到的乳清相比,乳鐵蛋白的灰度值無顯著差異,但是顯著高于鹽酸法、乙酸法和檸檬酸法乳清。乙酸法和檸檬酸法獲得乳清中β-Lg的灰度無顯著差異(P>0.05),但顯著高于離心法、鹽酸法和乙醇分級沉淀法獲得的乳清。離心處理對乳清中α-La的影響較小,分別比鹽酸、乙酸、檸檬酸和乙醇分級沉淀法得到的乳清高50.81%、11.30%、14.70%和2.09倍(P<0.05)。離心和檸檬酸法提取乳清中免疫球蛋白的灰度值無顯著差異(P<0.05),但是顯著高于鹽酸、乙酸和乙醇分級沉淀法得到的乳清(P<0.05)。

圖3 不同分離方法得到的乳清組分的灰度值

2.3 乳清的理化特性分析

2.3.1 色澤分析

如表2所示,乙醇分級沉淀提取乳清的L*值顯著高于其他4組乳清(P<0.05),而且鹽酸法與乙酸法提取乳清的L*值無顯著差異(P>0.05)。鹽酸法與檸檬酸法提取乳清的a*值無顯著差異(P>0.05),顯著高于離心法和乙醇分級沉淀法得到的乳清(P<0.05)。而檸檬酸法提取乳清的a*值與乙酸法提取的乳清無顯著差異(P>0.05)。乙酸法獲得乳清的b*值顯著高于其他4組乳清(P<0.05),鹽酸法和檸檬酸法提取乳清的b*值無顯著差異(P>0.05)。

表2 不同分離方式乳清的色澤分析

如圖4所示,離心法和乙醇分級沉淀法得到的乳清呈現(xiàn)渾濁的白色,但鹽酸、乙酸和檸檬酸法提取的乳清澄清,主要表現(xiàn)為黃色。

a-離心法;b-鹽酸法;c-乙酸法;d-檸檬酸法;e-乙醇分級沉淀法

2.3.2 微觀結(jié)構(gòu)分析

如圖5所示,離心法獲得的乳清呈片狀,結(jié)構(gòu)表面粗糙度較高。鹽酸法和乙酸法提取的乳清呈現(xiàn)片狀,表面都較為光滑、粗糙度低。檸檬酸和乙醇分級沉淀得到的乳清由破碎的玻璃或薄片狀結(jié)構(gòu)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)椴灰?guī)則的塊狀,其中經(jīng)乙醇分級沉淀得到的乳清出現(xiàn)了更多的裂紋、片狀結(jié)構(gòu)邊緣更加粗糙。

a-離心法;b-鹽酸法;c-乙酸法;d-檸檬酸法;e-乙醇分級沉淀法

2.3.3 粒徑和Zeta電位分析

如圖6-a所示,乙酸法提取乳清的粒徑分別比離心法、鹽酸法、檸檬酸法和乙醇分級沉淀法提取的乳清大5.77倍、13.09%、15.32%和1.75倍(P<0.05),鹽酸法和檸檬酸法提取乳清的粒徑無顯著差異(P>0.05)。如圖6-b所示,鹽酸法、乙酸法和檸檬酸法提取乳清的Zeta電位無顯著差異(P>0.05),且3種方法提取乳清的Zeta電位的絕對值顯著大于離心法和乙醇分級沉淀法提取的乳清(P<0.05)。

a-乳清粒徑;b-乳清的Zeta電位

2.3.4 傅里葉紅外光譜分析

圖7 不同分離方法提取乳清的FTIR結(jié)果

對所得到的譜圖進行高斯擬合,得到乳清蛋白二級結(jié)構(gòu)的比例如表3所示。離心法提取乳清中蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要以β-折疊為主,顯著高于其他4種方法提取乳清(P<0.05)。鹽酸法提取乳清的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)和α-螺旋結(jié)構(gòu)顯著大于其他4種方法提取乳清(P<0.05)。乙酸法和檸檬酸法提取乳清的β-折疊、無規(guī)則卷曲和α-螺旋結(jié)構(gòu)無顯著差異(P>0.05),但是檸檬酸法提取乳清的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)高于乙酸法提取乳清49.74%(P<0.05)。乙醇分級沉淀法提取乳清中以β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)為主,高于離心法、鹽酸法、乙酸法和檸檬酸法提取乳清的β-轉(zhuǎn)角1.60倍、32.96%、2.61倍和1.41倍;無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)則顯著低于其他4種方法提取的乳清(P<0.05);其α-螺旋結(jié)構(gòu)顯著高于離心法、乙酸法和檸檬酸法(P<0.05)。

表3 不同方法提取的乳清中二級結(jié)構(gòu)的含量 單位:%

2.3.5 乳清中游離巰基含量分析

如圖8所示,乙酸法提取乳清中游離巰基含量顯著低于其他4組乳清,為(1.394±0.228) μmol/g(P<0.05)。離心和鹽酸法提取乳清中游離巰基含量無顯著差異(P>0.05),因此乙酸對乳清中的β-Lg二聚體間的二硫鍵影響最大,但乙醇分級沉淀法使β-Lg間的二硫鍵減少,導致游離巰基含量增大。

圖8 不同分離方法提取乳清的游離巰基含量

3 討論與結(jié)論

本研究采用離心、酸(鹽酸、乙酸、檸檬酸)等電點沉淀和乙醇分級沉淀提取乳清,發(fā)現(xiàn)離心法得到的乳清濃度高于其他各組,可能是由于離心無法有效去除脫脂羊奶中的酪蛋白膠束,使乳清的蛋白濃度增大[3]。為了進一步明確這幾種方法去除酪蛋白的效果,采用SDS-PAGE對得到乳清中的蛋白質(zhì)進行分離,結(jié)果表明離心和乙醇分級沉淀提取的乳清中酪蛋白殘留較多,3種酸沉淀法提取的乳清中酪蛋白殘留較少,這與上述蛋白濃度測定結(jié)果相似。通過對SDS-PAGE條帶的灰度分析表明,酸等電點沉淀(鹽酸、乙酸和檸檬酸)對酪蛋白的去除率可以達到72%以上。邵鉞馨等[3]研究證明離心結(jié)合等電點沉淀乳制品中的酪蛋白,沉淀率可達到63%以上,本研究酪蛋白去除率比較高可能是因為調(diào)節(jié)pH結(jié)束后在搖床上振蕩了30 min,使酸與酪蛋白能有充分的時間變性進行沉淀。在提取乳清時需要考慮乳清蛋白能否充分保留,乙酸和檸檬酸法提取的乳清中α-La和β-Lg的條帶亮度和鮮羊奶沒有明顯差異,但鹽酸法提取的乳清的α-La條帶的亮度變暗、寬度變窄,這與刁夢雪等[9]的研究相似。因此,乙酸和檸檬酸酸法能更好除去酪蛋白,并且能更多保留乳清中的乳清蛋白含量。邵鉞馨等[3]研究證明離心結(jié)合等電點沉淀乳制品中的乳清蛋白,保留率可以達到74.95%,本研究結(jié)果乙酸沉淀法能更有效去除酪蛋白,保留乳清蛋白。

離心和乙醇分級沉淀法得到的乳清顏色為白色且不透明,這主要是由于乳清中殘留的酪蛋白以蛋白膠束的形式存在于乳清中,影響乳清的透明度。鹽酸法、乙酸法和檸檬酸法分離得到的乳清清澈透亮,呈現(xiàn)黃綠色,酪蛋白殘留較少,且乳清中核黃素使溶液的顏色為黃綠色[15]。通過SEM觀察乳清的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),離心、鹽酸和乙酸法得到的乳清呈片狀,檸檬酸和乙醇分級沉淀法得到的乳清呈塊狀結(jié)合在一起,MA等[16]研究表明,使用噴霧干燥工藝形成的乳清是球形結(jié)構(gòu),而通過冷凍干燥工藝處理得到的樣品呈破碎的片狀結(jié)構(gòu),這也與本試驗結(jié)果一致。乳清表面的小孔是由于冷凍干燥時乳清中被凍結(jié)的水升華造成的[17]。

由于酪蛋白表面的靜電荷相互排斥,使酪蛋白聚集程度較低,僅能形成較短的酪蛋白膠束結(jié)構(gòu),而離心處理所得樣品酪蛋白去除率低,仍含有大量酪蛋白顆粒,乳清蛋白純度低,所以平均粒徑遠低于酸處理法所得樣品,這與李子超等[18]的試驗結(jié)果一致。王美玉等[19]研究發(fā)現(xiàn),有機溶劑對蛋白質(zhì)的疏水相互作用、氫鍵和靜電相互作用的穩(wěn)定性會產(chǎn)生一定影響,一些有機溶劑在低濃度條件下可以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,但在高濃度條件時,這些有機溶劑也會導致蛋白質(zhì)變性。這是由于它們破壞了氨基酸非極性側(cè)鏈之間的疏水相互作用,同時增強靜電相互作用、改變蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)、促進蛋白質(zhì)聚集。乙醇分級沉淀制備的樣品無法有效提取乳清蛋白,未去除的酪蛋白在乙醇的作用下形成較大聚集體,故平均粒徑大于離心處理。Zeta電位是衡量樣品長期儲藏能力的一個重要指標[20]。Zeta電位絕對值越大則說明乳狀液液滴表面具有越多靜電荷,液滴間具有越大的靜電斥力和距離[21]。鹽酸、乙酸和檸檬酸法分離乳清的Zeta電位均顯著大于離心法和乙醇分級沉淀法得到的乳清,這可能是因為酸處理使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)展開,暴露了內(nèi)部帶負電荷的氨基酸殘基,導致Zeta電位的絕對值較高。此外,樣品Zeta電位絕對值在30 mV以上時,樣品處于穩(wěn)定狀態(tài)。因此,本試驗獲得的乳清具有良好的穩(wěn)定性。傅里葉紅外光譜分析表明,經(jīng)酸處理的樣品α-螺旋含量增加,顯示出明顯的吸收峰,可能是因為酸誘導α-螺旋結(jié)構(gòu)形成,這與HUANG等[22]的研究結(jié)果一致。乙酸酸性較弱,相比于鹽酸法提取乳清,經(jīng)乙酸法提取乳清蛋白二級結(jié)構(gòu)變化較小。乙醇處理會使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中的β-折疊轉(zhuǎn)變?yōu)棣?螺旋和β-轉(zhuǎn)角,這2種結(jié)構(gòu)增加可以增強蛋白質(zhì)分子的無序性和柔韌性[23],這與本試驗結(jié)果相似。乳清中的蛋白是一種典型的球狀蛋白,游離巰基及其他功能基團隱藏在其緊密的分子結(jié)構(gòu)內(nèi)部。乙酸法和檸檬酸法提取的乳清中游離巰基含量較低,可能是由于酸處理導致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)舒展、暴露出隱藏的巰基形成二硫鍵,穩(wěn)定存在于溶液中。LIU等[24]提出二硫鍵在酸性環(huán)境中較穩(wěn)定,不易斷裂。乙醇分級沉淀法得到乳清的游離巰基含量高,可能是由于醇類極性低于水,加入蛋白溶液中會使溶液介電常數(shù)降低、分子間靜電相互作用增強,削弱或破壞穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的非共價相互作用,改變蛋白質(zhì)的分子構(gòu)象,包裹在蛋白分子中的二硫鍵暴露之后又被重新包裹在變性的蛋白質(zhì)分子中,引起游離巰基含量增大[25]。

在5種羊奶乳清分離提取方法中,離心法乳清蛋白和酪蛋白的分離效果差,乙醇分級沉淀法不僅無法有效去除酪蛋白,且α-La和β-Lg損失較大。乙酸處理不僅有效的除去了大量酪蛋白、獲得了純度較高的乳清蛋白、α-La和β-Lg損失小,且對乳清蛋白的二級結(jié)構(gòu)影響較弱,是一種有效、科學的羊奶乳清分離方法。