李 芹 湯勁松

1 揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué),江蘇省揚(yáng)州市 225000; 2 江蘇省蘇北人民醫(yī)院

肝癌是一種常見的惡性腫瘤,其死亡率極高。大約85%的肝惡性腫瘤為肝細(xì)胞癌,且非常容易惡化及轉(zhuǎn)移,肝細(xì)胞癌患者的5年生存率很低,預(yù)后極差[1]。因此迫切需要進(jìn)一步深層次了解肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,發(fā)現(xiàn)新的肝細(xì)胞癌治療靶點(diǎn),為肝癌的診療提供新的方向。NOP56是一種核仁蛋白,在腫瘤細(xì)胞中對snoRNA的生成和snoRNA的穩(wěn)定性維持中起著至關(guān)重要的作用[2]。研究表明,在某種情況下snoRNA的失調(diào)是癌變的必要條件[3-4]。因此可以推測NOP56可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到至關(guān)重要的作用。本研究通過生物信息學(xué)探討NOP56的臨床意義及潛在的分子機(jī)制,為肝細(xì)胞癌的診斷與治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 NOP56在肝細(xì)胞癌的總體表達(dá)情況 利用Oncomine數(shù)據(jù)庫及HCCDB數(shù)據(jù)庫分析肝細(xì)胞癌組織中NOP56基因在肝癌及正?；虬┡越M織的表達(dá)水平,P<0.01被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 臨床相關(guān)分析 TCGA數(shù)據(jù)庫下載在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及對應(yīng)的臨床信息,并排除了臨床信息不完整的樣本。

1.3 生存分析 通過Kaplan-Meier plotter(http://kmplot.com/)評估NOP56對于肝癌患者及其各個亞組的預(yù)后價值。利用多因素Cox回歸模型評估NOP56是否為影響肝癌患者總生存期的獨(dú)立危險因素。

1.4 NOP56互相作用基因篩選和功能及藥物富集分析 利用GeneMANIA(https://genemania.org/)建立NOP56互作蛋白網(wǎng)絡(luò),并且對此網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了富集分析。此外,通過使用WebGestalt(http://www.webgestalt.org/)對該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了靶向藥物的預(yù)測。

1.5 GSEA富集分析 利用R軟件通過Spearman檢驗(yàn)將肝細(xì)胞癌mRNA表達(dá)譜分成NOP56的正相關(guān)組及負(fù)相關(guān)組。使用基因集富集分析(GSEA)對NOP56正負(fù)相關(guān)的基因進(jìn)行基于京都基因與基因組百科全書(KEGG)注釋。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用非配得t檢驗(yàn)對兩組滿足正態(tài)分布的連續(xù)性變量進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢查。兩組以上正態(tài)分布的連續(xù)性變量,采用方差分析。利用多因素Cox回歸模型評估NOP56是否為影響肝癌患者總生存期的獨(dú)立危險因素。P<0.05時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NOP56在肝細(xì)胞癌中高表達(dá) 筆者利用HCCDB數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn),與鄰近的正常組織相比,HCC中NOP56 mRNA表達(dá)更高(P<0.01)。Oncomine數(shù)據(jù)庫中得出類似的結(jié)果(P<0.01 &logFC>2)。此外,值得注意的是,肝硬化中NOP56 mRNA水平高于正常組織(P<0.01 &logFC=1.3)。因此,這些結(jié)果表明NOP56可能是正常肝組織發(fā)展至肝硬化、肝癌的關(guān)鍵分子。

2.2 NOP56與臨床相關(guān)性 通過下載TCGA的肝細(xì)胞癌數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,進(jìn)一步證明了NOP56 mRNA在HCC組織的高表達(dá)。NOP56的表達(dá)與肝細(xì)胞癌分級正相關(guān)(P<0.01),無肝細(xì)胞癌家族史患者NOP56的表達(dá)高于有肝細(xì)胞癌家族史患者(P<0.01),有鄰近肝組織驗(yàn)證患者NOP56的表達(dá)高于無鄰近肝組織驗(yàn)證患者(P<0.01)。

2.3 NOP56高表達(dá)的患者具有相對差的預(yù)后 為了進(jìn)一步評估NOP56評估肝細(xì)胞癌的預(yù)后價值,筆者使用了KMPLOT對肝細(xì)胞患者進(jìn)行生存分析。這些結(jié)果表明,在NOP56 mRNA高表達(dá)組中,肝細(xì)胞癌患者的OS(總體生存期)(log-rank test,P<0.05)、PFS(無進(jìn)展生存期)(log-rank test,P<0.05)、RFS(無復(fù)發(fā)生存期)(log-rank test,P<0.05)和DSS(疾病特異性生存期)(log-rank test,P<0.05)相對于NOP56低表達(dá)組顯著減少。此外,筆者對370個肝細(xì)胞癌患者進(jìn)行了亞組生存分析并發(fā)現(xiàn)除女性肝癌患者、肝癌Ⅱ期患者和飲酒的肝癌患者以外,所有肝癌亞組中NOP56 mRNA高表達(dá)的患者均與較差的OS及PFS相關(guān)(P<0.05)。此外NOP56 mRNA高表達(dá)的女性肝癌患者及飲酒肝癌患者與較短的OS相關(guān)。多因素COX回歸分析提示NOP56是OS的獨(dú)立危險因素。

2.4 NOP56的基因網(wǎng)絡(luò) 通過GeneMAINA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建基于NOP56的蛋白互作網(wǎng)絡(luò),這些分子富集于核糖體生物發(fā)生和rRNA代謝過程,表明NOP56可能通過這些生物學(xué)過程促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。 通過WebGestalt數(shù)據(jù)庫分析上述網(wǎng)絡(luò),筆者發(fā)現(xiàn)放射菌素D可能是影響NOP56蛋白分子的關(guān)鍵藥物(見表1)。

表1 靶向基因藥物

2.5 NOP56 表達(dá)的生物學(xué)功能分析 為了進(jìn)一步探索NOP56潛在的生物學(xué)機(jī)制,通過Spearman檢驗(yàn)將肝細(xì)胞癌mRNA表達(dá)譜分為正相關(guān)組(cor>0)和負(fù)相關(guān)組(cor<0),然后進(jìn)行以KEGG注釋的GSEA。如圖1所示,正相關(guān)組主要富集于核糖體、DNA復(fù)制、細(xì)胞周期。此外,負(fù)相關(guān)組富集于脂肪酸、氨基酸和丁酸等的代謝。

圖1 NOP56的KEGG富集分析

3 討論

筆者使用了不同的數(shù)據(jù)庫評估了NOP56在肝細(xì)胞癌中的表達(dá),這些結(jié)果都表明肝細(xì)胞癌NOP56 mRNA的表達(dá)顯著高于正常組織。此外,NOP56高表達(dá)組的OS、PFS、RFS和DSS明顯少于NOP56的低表達(dá)組。然而, Ⅱ期肝細(xì)胞癌患者NOP56高低表達(dá)組的OS無明顯差異(P>0.05),考慮到Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ肝癌患者的高低表達(dá)組存在顯著差異(P<0.05)。筆者認(rèn)為Ⅱ期肝細(xì)胞癌患者NOP56高低表達(dá)組無明顯差異的原因可能是抽樣誤差。因此,這些結(jié)果強(qiáng)烈表明NOP56的表達(dá)可能有助于肝癌患者的診斷和預(yù)后評估。然而TCGA數(shù)據(jù)庫中的Ⅳ期肝癌患者相對較少,但這些患者剛發(fā)現(xiàn)肝癌已經(jīng)就是肝癌晚期,預(yù)后極差。因此,有必要通過足夠的不同階段的樣本來進(jìn)一步證明筆者的結(jié)論。

基因的調(diào)控就像多米諾骨牌,只要存在單個基因的錯誤調(diào)控就會導(dǎo)致下游基因的失調(diào),這是導(dǎo)致癌癥發(fā)生發(fā)展的根本原因之一。筆者對以NOP56為核心的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行富集分析,發(fā)現(xiàn)這些基因主要參與核糖體生物發(fā)生和rRNA代謝,這些功能與目前的研究一致[5-6],筆者接著使用了WebGestalt數(shù)據(jù)庫分析NOP56網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)了放射菌素D是影響NOP56發(fā)揮致癌作用的關(guān)鍵藥物。事實(shí)上,放射菌素D是臨床上常見的抗腫瘤藥物,目前主要應(yīng)用于一些小兒腫瘤,如肌肉瘤、腎母細(xì)胞瘤、尤文氏肉瘤等[7-8]。多項(xiàng)研究表明,低濃度的放射菌素D可以破壞核糖體的生物學(xué)過程,最終導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和凋亡[9]。最新研究表明,放射菌素D通過調(diào)控CD133顯著抑制肝癌干細(xì)胞(LCSCs),并且不損傷正常的肝細(xì)胞[10]。根據(jù)這些研究筆者可以推測放射菌素D對肝細(xì)胞癌的治療作用也可以通過靶向NOP56來實(shí)現(xiàn),有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。為了進(jìn)一步揭示NOP56的潛在功能,筆者對NOP56正負(fù)相關(guān)組進(jìn)行可富集分析。結(jié)果表明,正相關(guān)組富集于DNA復(fù)制、核糖體、細(xì)胞周期,負(fù)相關(guān)組富集于脂肪酸、氨基酸和丁酸等的代謝。結(jié)合對以NOP56為中心的基因網(wǎng)絡(luò)的功能分析,筆者的研究進(jìn)一步證明NOP56可能通過調(diào)節(jié)核糖體影響癌癥的發(fā)展。一項(xiàng)研究表明,在NOP56基因敲除后,乳腺癌細(xì)胞G0/G1細(xì)胞周期明顯停滯[11]。另一項(xiàng)研究表明,在促進(jìn)NOP56過度表達(dá)后,HEK293細(xì)胞凋亡或S期數(shù)量減少,而G2/M期細(xì)胞數(shù)量增加2倍[12]。因此,NOP56可能通過影響細(xì)胞周期通路促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。

本研究通過多個隊(duì)列研究證明了NOP56在肝細(xì)胞癌的高表達(dá),并通過KM法及構(gòu)建多因素COX回歸證明的NOP56在肝細(xì)胞癌的預(yù)后價值。此外,構(gòu)建了以NOP56為核心的基因網(wǎng)絡(luò),并預(yù)測了靶向該網(wǎng)絡(luò)的藥物。最后通過GSEA計算了NOP56在肝細(xì)胞癌所影響的潛在通路。綜上所述,NOP56是評估肝細(xì)胞癌患者的一種新型的預(yù)后指標(biāo),可能為潛在的治療靶標(biāo)。