吳倍佩，左云，倪晨，朱惠平，張永芹，張王吉，錢曉蘭，張敏，蔣健

蘇州大學(xué)附屬張家港醫(yī)院腫瘤科，江蘇 張家港 2156000

胃癌是目前全球范圍內(nèi)第五大腫瘤，每年有超過100 萬新發(fā)病例，由于胃癌早期診斷率低，大多數(shù)患者在診斷時已是晚期，錯過了最佳的手術(shù)時機(jī)，病死率很高，因此胃癌是全球范圍內(nèi)第三大腫瘤死因，在2018 年全球有78.4 萬例胃癌患者死亡[1-2]。晚期胃癌患者的主要治療方法是聯(lián)合使用放化療、分子靶向治療和免疫治療，但療效并不理想，患者5 年生存率僅為30%～40%[2-3]。因此，探索具有診治價值的生物標(biāo)志物對胃癌患者早期診斷、治療及預(yù)后評估具有重要臨床意義。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族，可調(diào)控上皮細(xì)胞更新、增殖和分化，還具有強(qiáng)大的抗腫瘤活性[4]。腱蛋白樣蛋白2（chordin like 2，CHRDL2）是一種分泌蛋白，是BMP 的拮抗劑，可以阻止BMP 與其識別的細(xì)胞表面受體相互作用[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，CHRDL2 高表達(dá)與乳腺癌、結(jié)直腸癌、骨肉瘤的預(yù)后不良相關(guān)[7-9]。目前國內(nèi)尚無CHRDL2 表達(dá)與胃癌患者預(yù)后關(guān)系的相關(guān)報(bào)道，本研究探討胃癌組織中CHRDL2 的表達(dá)情況，并分析CHRDL2 表達(dá)情況與胃癌患者臨床特征的關(guān)系及對預(yù)后的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2015 年1 月至2016 年6 月于蘇州大學(xué)附屬張家港醫(yī)院接受手術(shù)治療的86 例胃癌患者作為研究對象，術(shù)中取得86 例胃癌組織及79 例對應(yīng)的癌旁組織。所有患者均經(jīng)病理檢查確診為胃腺癌，未合并其他腫瘤，并且均未行術(shù)前放化療及其他抗腫瘤治療。86 例胃癌患者中，男性56 例，女性30 例；平均年齡（67.74±12.74）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過，所有患者均知情同意。

1.2 主要試劑

兔抗CHRDL2 多克隆抗體購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，生物素高效標(biāo)記山羊抗兔二抗、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）辣根過氧化物酶顯色試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化染色方法

術(shù)中取得的新鮮胃癌組織及癌旁組織標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋后進(jìn)行4 μm 厚連續(xù)切片。將石蠟切片進(jìn)行二甲苯、梯度乙醇脫蠟和水化；用3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫避光孵育20 min，磷酸鹽緩沖液洗滌5 min×3次；加入檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)；滴加10%正常山羊血清室溫封閉30 min；滴加兔抗CHRDL2多克隆一抗（1∶100）于4 ℃孵育過夜；待切片復(fù)溫后采用磷酸鹽緩沖液洗滌5 min×3 次，加入生物素高效標(biāo)記的山羊抗兔二抗室溫孵育40 min；磷酸鹽緩沖液洗滌5 min×3 次，滴加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（streptavidin-biotin complex，SABC）工作液孵育30 min；磷酸鹽緩沖液洗滌5 min×3 次，滴加DAB 顯色，在光學(xué)顯微鏡下控制顯色程度；蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片。

1.4 免疫組化染色結(jié)果判定

CHRDL2 定位于細(xì)胞質(zhì)，染色細(xì)胞中見棕黃色顆粒狀蛋白。免疫組化結(jié)果由3 名資深病理科醫(yī)師同時讀片評分，若結(jié)果不一致，則復(fù)閱達(dá)成一致意見。每張切片隨機(jī)計(jì)數(shù)10 個高倍視野（×200），每個視野計(jì)數(shù)100 個細(xì)胞并統(tǒng)計(jì)分?jǐn)?shù)。按陽性細(xì)胞所占比例評分：無陽性細(xì)胞計(jì)0 分，≤25%計(jì)1 分，26%～50%計(jì)2 分，51%～75%計(jì)3 分，＞75%計(jì)4 分。按染色強(qiáng)度評分：無著色計(jì)0 分，淡黃色計(jì)1 分（+），黃色或棕黃色計(jì)2 分（++），棕褐色或褐色計(jì)3分（+++）?？傇u分=陽性細(xì)胞所占比例評分×染色強(qiáng)度評分，總評分≤4 分為CHRDL2 低表達(dá)，5～12 分為CHRDL2 高表達(dá)。

1.5 隨訪

以門診復(fù)診或電話等方式對胃癌患者進(jìn)行隨訪，總生存期為術(shù)后至隨訪截止時間（2022 年7 月）或患者死亡時間，記錄患者預(yù)后情況，分析CHRDL2 蛋白表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，生存情況的比較采用Log-rank 檢驗(yàn)；影響因素分析采用Cox 多因素回歸分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織與癌旁組織中CHRDL2 表達(dá)情況的比較

免疫組化結(jié)果顯示，胃癌組織中CHRDL2 陽性表達(dá)呈棕黃色，主要位于細(xì)胞質(zhì)（圖1）。79 例胃癌組織標(biāo)本中，49 例（62.0%）患者CHRDL2 高表達(dá)，30 例（38.0%）患者CHRDL2 低表達(dá)；79 例癌旁組織標(biāo)本中，16 例（20.3%）患者CHRDL2 高表達(dá)，63 例（79.7%）患者CHRDL2 低表達(dá)；胃癌組織中CHRDL2 蛋白高表達(dá)率明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=28.464，P＜0.01）。

圖1 胃癌組織及癌旁組織中CHRDL2的表達(dá)情況（免疫組化染色，×200）

2.2 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中CHRDL2蛋白表達(dá)情況的比較

不同性別、年齡、病理分級、腫瘤直徑、T分期及TNM 分期胃癌患者的胃癌組織中CHRDL2 蛋白表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；N1～3期胃癌患者的胃癌組織中CHRDL2 蛋白高表達(dá)率高于N0期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中CHRDL2 蛋白表達(dá)情況的比較

2.3 不同CHRDL2 蛋白表達(dá)情況胃癌患者預(yù)后的比較

CHRDL2 低表達(dá)患者的總生存率高于CHRDL2 高表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.196，P=0.023）。（圖2）

圖2 CHRDL2蛋白高表達(dá)（n=54）與低表達(dá)（n=32）胃癌患者的生存曲線

2.4 胃癌患者預(yù)后影響因素的單因素及多因素Cox 回歸分析

單因素Cox 回歸分析結(jié)果顯示，CHRDL2 表達(dá)、病理分級、腫瘤直徑、T 分期、N 分期、TNM 分期可能是胃癌患者預(yù)后的影響因素。將單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素納入Cox 多因素回歸分析，結(jié)果顯示，腫瘤直徑＞5 cm、TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期均為胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素（P＜0.05）。（表2）

表2 胃癌患者預(yù)后影響因素的單因素及多因素Cox 回歸分析

3 討論

胃癌是一種侵襲性疾病，5 年生存率低，全球疾病負(fù)擔(dān)沉重。目前，盡管許多基因在胃癌中的作用機(jī)制尚不清楚，但它們對預(yù)后的預(yù)測價值已被確定，可以根據(jù)腫瘤的生物學(xué)行為和對系統(tǒng)治療的反應(yīng)來對患者進(jìn)行分層[10]。

BMP 是一種重要的分泌型細(xì)胞因子，是TGF-β超家族中的一員，也是TGF-β超家族的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)媒介[11-12]，能夠抑制腫瘤的發(fā)生[13-16]。CHRDL2是BMP 細(xì)胞外拮抗劑，是與BMP 配體結(jié)合以干擾其功能的分泌性蛋白，可以下調(diào)TGF-β超家族信號，促進(jìn)腫瘤發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制劑Noggin拮抗BMP2 加速了胃癌細(xì)胞的增殖[17]。研究表明，CHRDL2 不僅在乳腺癌中高表達(dá)，而且在肺癌和結(jié)腸癌中也高表達(dá)[9]。據(jù)報(bào)道，高水平CHRDL2 通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）和下調(diào)p21 來促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞在體外和體內(nèi)的增殖，并且證明高水平CHRDL2 與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后不良相關(guān)[8]。此外，CHRDL2 在骨肉瘤中表達(dá)上調(diào)，并且通過激活BMP9/磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移[7]。為了研究CHRDL2與胃癌發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系，本研究分析了CHRDL2 在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況及對預(yù)后的影響。

本研究結(jié)果表明，CHRDL2 蛋白位于胃癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，并且胃癌組織中CHRDL2 高表達(dá)率明顯高于癌旁組織，表明CHRDL2 可能與胃癌發(fā)生相關(guān)。此外，N1～3期胃癌患者的胃癌組織中CHRDL2 蛋白高表達(dá)率高于N0期患者（P＜0.05）；CHRDL2 表達(dá)與患者性別、年齡、病理分級、腫瘤直徑、T 分期及TNM 分期無關(guān)，這表明CHRDL2 可能參與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。生存分析結(jié)果顯示，CHRDL2 低表達(dá)患者的總生存率高于CHRDL2 高表達(dá)患者，表明CHRDL2 可能作為判斷胃癌預(yù)后的生物標(biāo)志物。最后，Cox 多因素分析結(jié)果表明，CHRDL2 表達(dá)不是胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。

然而，本研究的不足之處在于未深入探討CHRDL2 對胃癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制；其次本研究樣本量較少，影響因素分析不夠全面，因此在今后的研究工作中需要擴(kuò)大樣本量，同時對胃癌預(yù)后的影響因素進(jìn)行全面探討。

綜上所述，胃癌組織中CHRDL2 呈高表達(dá)，CHRDL2 表達(dá)與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及生存期有關(guān)，CHRDL2 可能作為預(yù)測腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及患者預(yù)后的新的生物標(biāo)志物，為胃癌臨床診治提供新思路。