郝瑞杰，邱晨，耿曉云，賈浩田，張雅靜，?，B，馮新新

梅花在苯甲醇揮發(fā)中的功能分析

郝瑞杰1，邱晨2，耿曉云1，賈浩田1，張雅靜1，常珺1，馮新新1

1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷 030801；2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)城鄉(xiāng)建設(shè)學(xué)院，山西太谷 030801

【目的】挖掘與梅花重要芳香成分跨膜運輸相關(guān)的基因，進一步完善梅花芳香成分轉(zhuǎn)運機制?！痉椒ā恳悦坊ā手ξ璺邸癁樵嚥模诜治雒坊ú煌_花時期苯甲醇的揮發(fā)量與內(nèi)源含量基礎(chǔ)上，通過加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)（WGCNA）、系統(tǒng)進化樹、表達量分析，篩選與苯甲醇跨膜運輸相關(guān)的ABC轉(zhuǎn)運蛋白（ATP-binding cassette transporter）。利用亞細胞定位、轉(zhuǎn)基因技術(shù)和底物孵育試驗，驗證參與轉(zhuǎn)運苯甲醇的功能?！窘Y(jié)果】將梅花品種‘彩枝舞粉’的開花進程分為7個時期，苯甲醛、苯甲醇和乙酸苯甲酯在各個時期的揮發(fā)物中都能檢測到，進入初花期后，這3種成分的總相對含量超過80%，是‘彩枝舞粉’的主要芳香成分。定量分析各主要芳香成分的揮發(fā)量和內(nèi)源含量，苯甲醛內(nèi)源含量最高，但揮發(fā)量最高僅有13.17 ng·g-1·h-1，苯甲醇內(nèi)源含量和揮發(fā)量最高時期為末花期，揮發(fā)量達到82.28 ng·g-1·h-1，乙酸苯甲酯揮發(fā)量最高時期為盛花期，揮發(fā)量為280.21 ng·g-1·h-1。利用WGCNA方法聯(lián)合分析不同開花時期花朵轉(zhuǎn)錄組與芳香成分揮發(fā)量數(shù)據(jù)，獲得與苯甲醇揮發(fā)量相關(guān)性高的turquoise模塊，在該模塊中鑒定到11個ABCG亞家族基因。通過不同部位、不同時期的表達模式分析，推測與梅花中苯甲醇跨膜轉(zhuǎn)運相關(guān)。克隆，分析結(jié)果表明該基因具有典型的NBD-TMD結(jié)構(gòu)域，亞細胞定位結(jié)果證實其能在細胞膜上表達。構(gòu)建過表達載體并轉(zhuǎn)化本氏煙草，利用苯甲醇溶液孵育轉(zhuǎn)基因及野生型煙草葉片，頂空分析各株系苯甲醇揮發(fā)量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草揮發(fā)量顯著高于野生型，證明具有轉(zhuǎn)運苯甲醇的功能?！窘Y(jié)論】苯甲醛、苯甲醇、乙酸苯甲酯是梅花‘彩枝舞粉’花期主要的芳香成分。梅花PmABCG9屬于ABCG亞家族的半分子轉(zhuǎn)運蛋白類型，的表達與苯甲醇揮發(fā)量相關(guān)，其能有效地將苯甲醇通過細胞膜轉(zhuǎn)運到空氣中。

梅花；苯甲醇；；轉(zhuǎn)運；花香

0 引言

【研究意義】梅花（Sieb. et Zucc.）是著名的觀賞樹種，其花香馥郁、樹姿古樸，在中國已有三千多年的栽培歷史，積淀了厚重的梅花花文化，梅花花、果皆可利用，栽培梅花有著重要的經(jīng)濟價值[1]。梅花開花時能向空氣中釋放大量芳香成分，其主要成分為苯環(huán)類物質(zhì)[2]。苯環(huán)類物質(zhì)是莽草酸代謝通路的下游分支[3-4]，其中苯甲醛是重要的節(jié)點，通過苯甲醛可進一步合成苯甲醇[5]，苯甲醛、苯甲醇也能被梅花花朵揮發(fā)，共同存在于梅花揮發(fā)物中影響梅花的芳香特征[6]。苯環(huán)類物質(zhì)也廣泛存在于梅花近緣屬種的花朵揮發(fā)物中[7]，目前梅花已經(jīng)成為研究苯環(huán)類物質(zhì)生物合成和跨膜轉(zhuǎn)運的重要材料?！厩叭搜芯窟M展】苯甲醇是用途廣泛的芳香醇類化合物，在低濃度下能產(chǎn)生抑菌作用，也可作為前體合成多種風味的酯類物質(zhì)，在食品加工、保健、化妝品等領(lǐng)域都有重要的用途[8]。苯甲醇具有微甜的氣味，是茉莉精油、秘魯香樹脂等的主要成分[9]，與一定比例苯甲醛混合可以產(chǎn)生類似杏仁和茴香的氣味[10]。苯甲醇在植物中廣泛存在，調(diào)查發(fā)現(xiàn)多達49個被子植物科中可檢測到苯甲醇，其揮發(fā)與被子植物吸引昆蟲授粉有很強的相關(guān)性[11]。苯甲醇是蘋果花的主要芳香成分，能夠有效吸引蜜蜂授粉以保障果實產(chǎn)量[12]。植物花朵芳香成分合成于花器官釋香部位的細胞質(zhì)中，并逐步通過細胞膜、細胞壁等結(jié)構(gòu)釋放到空氣中，由于細胞膜是封閉的脂質(zhì)生物膜，形成了芳香成分自由擴散的主要限制因子[13]。傳統(tǒng)上認為芳香成分的釋放速率依賴于細胞質(zhì)中芳香成分的濃度[14]，但在矮牽?；ǘ鋼]發(fā)模式研究中發(fā)現(xiàn)，矮牽牛苯甲酸甲酯的跨膜運輸需要借助定位在細胞膜上特異的ABC轉(zhuǎn)運蛋白[15]。ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族普遍存在于生物中，承擔多種代謝產(chǎn)物的跨膜運輸[16]。植物中ABC家族基因分為8個亞家族[17]，其中ABCG亞家族成員眾多，轉(zhuǎn)運的底物涉及蠟質(zhì)[18]、木質(zhì)素[19]、激素[20]等，研究認為該亞家族蛋白的轉(zhuǎn)運特點與陸生植物的環(huán)境適應(yīng)性密切相關(guān)[17]。ABCG亞家族包括半分子的WBC（white-brown complex）和全分子的PDR（pleiotropic drug resistance）兩個類型[21]，多項研究表明WBC類型參與了植物花器官次生代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運[22-23]，矮牽牛中能夠轉(zhuǎn)運特異芳香成分的即屬于WBC類型[15]?！颈狙芯壳腥朦c】筆者前期系統(tǒng)研究了梅花花朵不同部位的揮發(fā)特征，發(fā)現(xiàn)各部位內(nèi)源苯甲醇含量遠遠大于揮發(fā)到空氣中的量，并且各部位之間揮發(fā)量差異顯著[24]，苯甲醇的揮發(fā)并不依賴細胞中的積累量，推測梅花中可能存在特異轉(zhuǎn)運苯甲醇的ABC家族蛋白?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為進一步挖掘梅花中特異轉(zhuǎn)運苯甲醇的ABC家族基因，本研究系統(tǒng)比較梅花開花過程各時期苯甲醇的揮發(fā)特征，利用各時期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)合WGCNA分析，篩選與苯甲醇跨膜轉(zhuǎn)運相關(guān)的ABCG家族基因；構(gòu)建表達載體，通過在煙草中轉(zhuǎn)基因驗證，鑒定能夠轉(zhuǎn)運苯甲醇的基因。

1 材料與方法

試驗于2020—2022年在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院進行。

1.1 材料及處理

試驗材料為梅花品種‘彩枝舞粉’，于梅花花期根據(jù)花蕾大小及開放程度將梅花開花過程分為7個時期（圖1），分別標記為露瓣期（LB）、小蕾期（XL）、中蕾期（ZL）、大蕾期（DL）、初花期（CH）、盛花期（SH）、末花期（MH）。的亞細胞定位及過量表達采用本氏煙草（）。

1.2 梅花芳香成分收集與分析

梅花芳香成分收集采用頂空固相微萃取法，分別采集梅花7個不同時期的花朵，稱重后置于固相微萃取采樣瓶中，萃取頭老化后30 ℃頂空萃取30 min。梅花內(nèi)源芳香成分收集采用溶劑萃取法，各時期花朵稱重后用液氮研磨至粉末，分別加入乙酸乙酯溶劑進行萃取，無水硫酸鈉去除水分，收集上清液備用。芳香成分分析采用GC-MS（Trace, ISQ, Thermo）檢測，程序升溫條件依據(jù)HAO等[24]的方法。芳香成分的相對含量計算采用峰面積歸一法，定量采用外標法。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序及分析

選擇露瓣期、大蕾期、初花期、盛花期、末花期5個時期的花朵，分別提取總RNA。取梅花盛花期花朵，迅速分解為花瓣、花絲、花藥、花萼、花盤+雌蕊5個部分，分別提取總RNA。所得總RNA委托北京百邁客生物科技有限公司的NovaSeq 6000平臺進行高通量測序，測序結(jié)果已經(jīng)上傳到NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫中，GenBank：PRJNA905928。梅花ABC家族基因的鑒定采用HAO等[24]的分析結(jié)果，基因表達量熱圖采用FPKM值，并用Tbtools可視化呈現(xiàn)。

1.4 共表達模塊構(gòu)建與分析

利用R軟件（R version 4.1.3）裝載WGCNA軟件包構(gòu)建不同開花時期花朵的基因共表達模塊[25]。基于梅花露瓣期、大蕾期、初花期、盛花期、末花期5個時期轉(zhuǎn)錄組分析獲得的基因表達FPKM值計算并構(gòu)建基因共表達網(wǎng)絡(luò)，表達閾值設(shè)置為1，模塊相似度值設(shè)置為0.25，利用動態(tài)混合剪切法建樹并獲得不同的基因表達模塊。根據(jù)苯甲醛揮發(fā)量（Ben_Vol）、苯甲醇揮發(fā)量（Bal_Vol）和乙酸苯甲酯揮發(fā)量（Bac_Vol）的性狀數(shù)據(jù)與獲得的模塊關(guān)聯(lián)分析確定與3種芳香成分跨膜轉(zhuǎn)運關(guān)系緊密的模塊。在獲得的模塊中鑒定PmABCG亞家族基因。

1.5 PmABCG9克隆與生物信息學(xué)分析

根據(jù)梅花（GenBank：XM_008228297.2）的CDS全長序列信息設(shè)計特異性引物（表1），以‘彩枝舞粉’cDNA為模板獲得目的基因。利用無縫克隆技術(shù)，將目的基因連接至載體pHZM27，構(gòu)建過表達載體pHZM27-，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得陽性克隆并進行測序分析。的保守結(jié)構(gòu)域分析和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測分別利用Pfam數(shù)據(jù)庫和TMHMM在線軟件進行[26]。利用MEGA 8.0軟件構(gòu)建PmABCGs的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，建樹方法為鄰接法，各物種ABCG亞家族基因氨基酸序列來自GenBank：黃瓜CsPDR12（ACU82515.1）、大豆GmPDR12（NP_001237697.2）、擬南芥AtABCG5（Q9SIT6.1）、AtABCG11（Q8RXN0.1）、AtABCG12（Q9C8K2.1）、AtABCG25（Q84TH5.1）、AtABCG28（Q9FF46.1）、AtABCG29（AT3G16340）、AtABCG34（Q7PC87.1）以及矮牽牛PhABCG1（H9BZ66.1）。

表1 引物序列及其用途

*有下劃線的序列表示與載體的同源堿基 *The underlined sequence is homologous bases to the vector

1.6 PmABCG9的亞細胞定位

將序列連接至pBWA(V)HS-GFP載體，構(gòu)建亞細胞定位載體pBWA(V)HS-- GFP，設(shè)計引物序列為ABCG9-GFP-F、ABCG9-GFP-R（表1），將構(gòu)建好的亞細胞定位載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。挑選生長良好的本氏煙草植株，用轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌注射煙草下表皮，弱光培養(yǎng)2 d后，用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.7 PmABCG9過表達載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化煙草

為了研究轉(zhuǎn)運功能，將質(zhì)粒pHZM27-轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞，采用葉盤法轉(zhuǎn)化本氏煙草，用20 mg·L-1Basta篩選陽性植株，并用目的基因PCR和熒光定量PCR對轉(zhuǎn)基因植株進行鑒定，獲得T3代轉(zhuǎn)基因陽性株系進行后續(xù)研究。在轉(zhuǎn)基因株系中的qRT-PCR分析采用HAO等[27]的方法，設(shè)計的引物序列如表1所示，選用的內(nèi)參基因為[28]。

1.8 苯甲醇底物孵育轉(zhuǎn)基因株系

將苯甲醇標品配制4 mmol·L-1溶液，各取5 mL溶液至10 mL離心管中。取WT、Line-1、Line-2株系葉片進行孵育試驗，葉片統(tǒng)一為生長點下第3片葉，精確稱量葉片0.5 g置于苯甲醇溶液中，并確保葉片處于溶液液面以下。將離心管置于25 ℃水浴鍋孵育2 h，孵育后迅速將葉片從溶液中取出，用濾紙吸干殘存于葉片表面的溶液。隨后將葉片置于20 mL進樣瓶中，利用1.2的方法收集測量頂空芳香成分。頂空分析結(jié)束后將葉片用液氮速凍，隨后用乙酸乙酯萃取內(nèi)源成分并用GC-MS測量其含量，方法同1.2。

2 結(jié)果

2.1 梅花花朵不同時期芳香成分含量變化

由圖2-A可知，苯甲醛、苯甲醇和乙酸苯甲酯三者的總相對含量在露瓣期最低，隨著梅花花蕾膨大、開放而逐漸升高，開花后，3種成分的總相對含量都大于80%，是梅花開花時的主要芳香成分。由圖2-B可知，從露瓣期到末花期都可以檢測到苯甲醛的揮發(fā)，初花期苯甲醛的揮發(fā)量最高，達到13.17 ng·g-1·h-1，苯甲醛在各個時期的內(nèi)源含量差異顯著，中蕾期苯甲醛的內(nèi)源含量最高，為1 954.39 μg·g-1。在梅花開花過程中，苯甲醇的揮發(fā)量和內(nèi)源含量均表現(xiàn)出隨開花進程逐步升高的規(guī)律（圖2-C），到末花期苯甲醇的揮發(fā)量為82.28 ng·g-1·h-1，顯著高于其他各個時期，該時期苯甲醇內(nèi)源含量也達到27.78 μg·g-1。乙酸苯甲酯的揮發(fā)量在大蕾期后迅速升高，并在盛花期達到最高（280.21 ng·g-1·h-1）（圖2-D），乙酸苯甲酯的內(nèi)源含量也在大蕾期開始快速增高，在初花期達到最高（276.23 μg·g-1），顯著高于其他各個時期。比較3種芳香成分，苯甲醛內(nèi)源含量遠高于苯甲醇和乙酸苯甲酯，但揮發(fā)量間相比（以盛花期為例），苯甲醇和乙酸苯甲酯的揮發(fā)量均較高，說明梅花各芳香成分的揮發(fā)量并不依賴于其內(nèi)源含量的高低。

A：不同時期苯甲醛、苯甲醇、乙酸苯甲酯相對含量；B：不同時期苯甲醛揮發(fā)量與內(nèi)源含量；C：不同時期苯甲醇揮發(fā)量與內(nèi)源含量；D：不同時期乙酸苯甲酯揮發(fā)量與內(nèi)源含量。不同大、小寫字母分別表示揮發(fā)量、內(nèi)源含量間差異顯著（P＜0.05）。下同

2.2 梅花不同時期芳香成分的WGCNA分析

為了篩選與梅花芳香成分轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因，比較梅花‘彩枝舞粉’露瓣期、大蕾期、初花期、盛花期、末花期5個時期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共篩選到9 029個差異基因，不同時期之間差異基因的表達趨勢如附表1所示。將差異基因進行WGCNA分析，結(jié)果產(chǎn)生3個模塊。利用各個模塊的特征值與梅花各個時期苯甲醛、苯甲醇和乙酸苯甲酯的揮發(fā)量進行相關(guān)性分析，得出梅花苯甲醇揮發(fā)量與turquoise模塊相關(guān)性較高，相關(guān)性指數(shù)高達0.94（圖3）。進一步分析，發(fā)現(xiàn)該模塊包括、、、、、、、、、和共11個ABCG亞家族基因。

2.3 ABCGs系統(tǒng)進化分析

將turquoise模塊中的ABCGs與擬南芥、矮牽牛、黃瓜、大豆中已知功能的ABCGs共同構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖4）。由圖4可知，這11個ABCGs可分為兩大類，其中PmABCG33、PmABCG37、PmABCG38、PmABCG42、PmABCG43、PmABCG45和PmABCG50 是ABCG亞家族的PDR類型，為全分子轉(zhuǎn)運蛋白，有研究表明親緣關(guān)系較近的CsPDR12與植物的非生物脅迫相關(guān)[29]，GmPDR12與水楊酸代謝相關(guān)，受茉莉酸甲酯等物質(zhì)誘導(dǎo)[30]，AtABCG29、AtABCG34也關(guān)系到對香豆醛[19]、植保素的跨膜轉(zhuǎn)運[31]。另一大類包括PmABCG2、PmABCG9、PmABCG11、PmABCG18等，都屬于ABCG亞家族的WBC類型。該類型屬于半分子轉(zhuǎn)運蛋白，其中與PmABCG9親緣關(guān)系較近的AtABCG5，可能與AtABCG11、AtABCG12等共同參與了向細胞表皮轉(zhuǎn)運脂質(zhì)的過程，進而影響了葉片表皮的蠟質(zhì)成分[32]；另外，PhABCG1已被證明是矮牽牛中轉(zhuǎn)運苯甲酸甲酯等芳香成分的轉(zhuǎn)運蛋白[15]。

模塊中的數(shù)值表示模塊與表型的相關(guān)性系數(shù)，括號中的數(shù)值表示顯著性P值

圖4 梅花與其他物種ABCGs的系統(tǒng)進化分析

2.4 梅花PmABCGs表達模式分析

為進一步探索turquoise模塊ABCG亞家族基因的表達模式，分別利用‘彩枝舞粉’開花過程中露瓣期、大蕾期、初花期、盛花期、末花期5個時期和盛花期花瓣、花絲、花藥、花萼、花盤+雌蕊的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行各基因的表達情況分析（圖5）。結(jié)果表明，在各個時期表達量均較高，而且表現(xiàn)出從露瓣期到末花期表達量逐漸降低的規(guī)律。在末花期表達量最高，而在大蕾和初花期表達量最高（圖5-A）。由圖5-B可知，在花絲的表達量最高，在花瓣和花藥的表達量次之；在花藥的表達量最高，而、均在花萼、花盤+雌蕊等部位表達量較高。結(jié)合筆者前期研究結(jié)果，苯甲醇在花絲、花藥部位揮發(fā)量最高[24]，推斷與苯甲醇的轉(zhuǎn)運有關(guān)。

2.5 PmABCG9保守結(jié)構(gòu)域分析及亞細胞定位

‘彩枝舞粉’的克隆測序結(jié)果表明，所獲得的全長1 821 bp，編碼606個氨基酸。PmABCG9的保守結(jié)構(gòu)域分析，確定PmABCG9屬于半分子轉(zhuǎn)運蛋白，其NBD與TMD的組裝方式為NBD-TMD（圖6-A），是ABCG亞家族特有的方式。通過TMHMM網(wǎng)站對進行結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)該基因具有6個跨膜結(jié)構(gòu)域（圖6-B）。進一步亞細胞定位觀察，發(fā)現(xiàn)在煙草葉片細胞膜表達（圖6-C），與預(yù)測一致，具有轉(zhuǎn)運蛋白的特征。

A：PmABCG9的保守結(jié)構(gòu)域；B：PmABCG9的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測；C：PmABCG9的亞細胞定位

2.6 PmABCG9載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

將插入pHZM27載體構(gòu)建植物表達載體pHZM27-（圖7-A），進一步通過煙草遺傳轉(zhuǎn)化篩選轉(zhuǎn)植株。研究共獲得含有Basta抗性株系18株，以未轉(zhuǎn)基因植株（WT）為對照，對轉(zhuǎn)基因株系進行PCR鑒定，確定18個株系均為轉(zhuǎn)基因植株。對18個株系進行表型觀測，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)株系與野生型對照植株的表型差異不顯著（圖7-B）。RT-PCR分析各株系的表達量，發(fā)現(xiàn)Line-1、Line-2兩個株系的表達量均較高（7-C），因此選擇Line-1、Line-2株系用于下一步研究。

2.7 苯甲醇孵育轉(zhuǎn)PmABCG9煙草株系

煙草葉片孵育后測量葉片頂空芳香成分，Line-1、Line-2與野生型煙草對苯甲醇的轉(zhuǎn)運能力差異顯著，Line-2的揮發(fā)量達到124.88 ng·g-1·h-1，顯著高于野生型煙草葉片的揮發(fā)量（圖8-A）。通過檢測Line-1、Line-2與野生型煙草葉片內(nèi)源苯甲醇含量也可以看出（圖8-B），在Line-2中苯甲醇含量為3.40 μg·g-1，顯著低于野生型煙草的含量，以上結(jié)果說明Line-2能夠?qū)⒏嗟谋郊状嫁D(zhuǎn)運到空氣中，而留在葉片中的苯甲醇含量相對較少。

A：pHZM27-PmABCG9質(zhì)粒示意圖；B：轉(zhuǎn)PmABCG9煙草幼苗；C：PmABCG9在轉(zhuǎn)基因煙草株系的表達情況

A：苯甲醇孵育轉(zhuǎn)PmABCG9煙草株系的頂空揮發(fā)分析；B：苯甲醇孵育轉(zhuǎn)PmABCG9煙草株系的內(nèi)源含量

3 討論

3.1 芳香成分在不同時期的揮發(fā)規(guī)律

芳香成分的揮發(fā)一般認為是植物開花后的特征，Colquhoun等[33]將矮牽牛開花過程分為11個時期，花蕾發(fā)育過程中檢測不到芳香成分揮發(fā)，花開時花蕾停止伸長并開始釋放苯甲醛、苯甲醇等揮發(fā)物，花開后2 d揮發(fā)量達到最高。在晚香玉[34]、滇丁香[35]的研究中也都發(fā)現(xiàn)蕾期芳香成分少，而花初開時芳香成分揮發(fā)量迅速達到最高。本研究發(fā)現(xiàn)梅花芳香成分揮發(fā)表現(xiàn)出不同的規(guī)律，從蕾期到末花期，苯甲醇都能在揮發(fā)成分和內(nèi)源成分中檢測到，說明梅花芳香成分的釋放不依賴于開花進程，芳香成分在蕾期即可合成，而且可以揮發(fā)到空氣中。結(jié)合梅花花朵從花蕾到盛花期的重量和體積都發(fā)生了顯著性變化，尤其在大蕾期后，花蕾體積迅速增大，梅花芳香成分揮發(fā)量也迅速增加，說明梅花揮發(fā)量與花朵大小存在緊密的聯(lián)系。不同于矮牽牛等植物的筒狀花冠，梅花花朵呈淺碗形，各花瓣相互分離[36]，基于不同花型吸引昆蟲策略推斷，梅花的開花與揮發(fā)模式更有利于提高花朵群體的揮發(fā)量，以起到吸引昆蟲的目的。

3.2 PmABCG9對苯甲醇的選擇性

本研究中與親緣關(guān)系較近，被認為參與了擬南芥葉片蠟質(zhì)層變致密的過程[32]，從而使擬南芥幼苗在土壤多水的環(huán)境下得以生存，但其轉(zhuǎn)運的代謝物種類仍未得到闡明。與親緣關(guān)系較近的參與了擬南芥中苯丙素類物質(zhì)的轉(zhuǎn)運[37]，其中松柏醇等酚類聚合物也關(guān)系到植物表皮致密性[38]。本研究發(fā)現(xiàn)梅花芳香成分主要為苯環(huán)類物質(zhì)，其與苯丙素類物質(zhì)同為莽草酸代謝的下游產(chǎn)物[39]，這些轉(zhuǎn)運底物都有著相似的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，說明與其親緣關(guān)系較近的基因?qū)江h(huán)化合物可能具有相似的底物選擇性。共表達分析表明turquoise模塊與乙酸苯甲酯的揮發(fā)量也有一定相關(guān)性，梅花花朵末花期表達量出現(xiàn)下降，乙酸苯甲酯揮發(fā)量也相應(yīng)降低，因此推測與苯甲醇、乙酸苯甲酯等多種苯環(huán)類芳香成分的轉(zhuǎn)運關(guān)系密切。本研究通過WGCNA分析確定了11個與苯甲醇轉(zhuǎn)運緊密聯(lián)系的ABCG基因，但是其中PDR類型基因多達7個（圖5），已有研究認為PDR轉(zhuǎn)運蛋白多與重金屬[40]、植物激素[41]等物質(zhì)的轉(zhuǎn)運有關(guān)，而PDR涉及小分子揮發(fā)物的轉(zhuǎn)運仍然鮮有報道，開花過程中關(guān)系到多種進程，該模塊中PDR基因與開花進程的關(guān)系有待進一步探討。

3.3 苯甲醇溶液孵育轉(zhuǎn)基因植株

有研究表明本氏煙草缺乏苯甲醇等苯環(huán)類芳香成分[42]，本研究也證實本氏煙草花朵、葉片等組織內(nèi)源揮發(fā)性化合物中檢測不到苯甲醇等芳香成分。Adebesin等[15]利用苯甲酸甲酯和苯甲醇孵育煙草BY-2細胞，成功將底物導(dǎo)入煙草細胞內(nèi)部并驗證了對芳香成分的轉(zhuǎn)運能力。Fang等[43]利用苯甲醇溶液孵育轉(zhuǎn)基因洋桔梗葉片，將苯甲醇引入葉片細胞從而生成下游苯環(huán)類物質(zhì)。本研究利用苯甲醇溶液處理煙草葉片，同樣實現(xiàn)了苯甲醇在細胞內(nèi)部的富集，由此可見，本氏煙草可作為研究苯環(huán)類芳香成分跨膜轉(zhuǎn)運的重要工具。本研究中，煙草葉片經(jīng)孵育后，Line-2內(nèi)源苯甲醇濃度高達3.40 μg·g-1，該含量與梅花小蕾期花朵中苯甲醇含量相近，但Line-2苯甲醇的揮發(fā)量遠遠大于小蕾期，說明的異源超表達促進了苯甲醇的揮發(fā)，表現(xiàn)出相應(yīng)的轉(zhuǎn)運功能。本研究用苯甲醇孵育野生型煙草葉片，其揮發(fā)物中也能檢測到苯甲醇的揮發(fā)，已知煙草自身缺乏苯甲醇，但是煙草基因組中也存在自身的ABC基因家族[44]，雖然轉(zhuǎn)運蛋白具有一定的底物特異性[45]，但半分子的WBC型轉(zhuǎn)運蛋白能形成同源和異源二聚體，通過多種組合從而可以轉(zhuǎn)運更多類型的底物[46]，推測本研究中野生型煙草中的轉(zhuǎn)運蛋白也通過類似的機制轉(zhuǎn)運了外源導(dǎo)入的苯甲醇。

4 結(jié)論

梅花‘彩枝舞粉’從露瓣期到末花期的各個階段都能揮發(fā)芳香成分，苯甲醛、苯甲醇、乙酸苯甲酯是各時期主要的芳香成分。苯甲醇的揮發(fā)量隨開花進程逐步升高，其揮發(fā)規(guī)律與的表達模式相關(guān)。梅花具有典型的NBD-TMD結(jié)構(gòu)，屬于ABCG亞家族的WBC類型，其表達定位于細胞膜，具有轉(zhuǎn)運蛋白的特征，通過構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植株孵育體系，證明能有效轉(zhuǎn)運苯甲醇經(jīng)過細胞膜進入空氣中。

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The Function ofTransporter Related to the Volatilization of Benzyl Alcohol in

HAO RuiJie1, QIU Chen2, GENG XiaoYun1, JIA HaoTian1, ZHANG YaJing1, CHANG Jun1, FENG XinXin1

1College of Horticulture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi;2College of Urban and Rural Construction, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi

【Objective】The aim of this study was to improve the volatilization mechanism of floral scent by exploring the gene related to the transmembrane transport of important aromatic components in. 【Method】TheCaizhiwufen was applied as material plant. Based on the analysis of volatile and endogenous contents of benzyl alcohol at different blooming stages, the ABC transporters (ATP-binding cassette transporter) involved in the transmembrane transport of benzyl alcohol were identified by weighted gene co-expression network analysis (WGCNA), phylogenetic analysis, and gene expression profiles. Finally, the functions ofwere validated by subcellular localization, transgenic technology and incubation assay with substrates. 【Result】The flowering process ofwas divided into seven blooming stages, and the total relative content of benzaldehyde,benzyl alcohol and benzyl acetate reached more than 80% at the initial blooming stage, indicating that they were the key aromatic components of Caizhiwufen. The quantitative analysis showed that the endogenous content of benzaldehyde was the highest among the above three, while its volatile content was only 13.17 ng·g-1·h-1at the highest level. The endogenous and volatile content of benzyl alcohol reached the highest at wither stage, up to 82.28 ng·g-1·h-1of the volatile content. The highest volatile content of benzyl acetate was at full blooming stage and up to 280.21 ng·g-1·h-1. WGCNA between the transcriptome data of different blooming stages and the volatile content of aromatic components showed that the turquoise module highly correlated with the volatile content of benzyl alcohol, importantly. 11subfamily genes were identified. Moreover, based on the expression patterns of, it was inferred thatwas related to the transmembrane transport of benzyl alcohol in. Therefore,gene was cloned, and the typical NBD-TMD domain ofgene was confirmed. Subcellular localization showed that PmABCG9 was localized on the cell membrane. The leaves of transgenicand wild-type plants were incubated with benzyl alcohol solution, and the volatile content of benzyl alcohol from each line were analyzed by GC-MS. It was noted that the volatile content of benzyl alcohol from transgenic tobaccos was significantly higher than that of wild-type ones, demonstrating thathad the function of transporting benzyl alcohol. 【Conclusion】 Benzaldehyde, benzyl alcohol and benzyl acetate were the key aromatic components at florescence ofCaizhiwufen. PmABCG9 belonged to the semi-molecular transporters type from ABCG subfamily,was closely related to volatile content benzyl alcohol, furthermore, it could effectively transport benzyl alcohol into the air through cell membrane.

; benzyl alcohol;; transport; floral scent

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.13.011

2022-09-23；

2023-01-12

國家自然科學(xué)基金（31870696）

通信作者郝瑞杰，E-mail：hrj000@126.com

（責任編輯 趙伶俐）