張楠，韓光杰，劉琴，李傳明，祁建杭，陸玉榮，夏楊，徐健

稻縱卷葉螟轉(zhuǎn)錄因子CncC對(duì)桿狀病毒CnmeGV感染的響應(yīng)及功能

張楠，韓光杰，劉琴，李傳明，祁建杭，陸玉榮，夏楊，徐健

江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/國(guó)家農(nóng)業(yè)微生物揚(yáng)州觀(guān)測(cè)實(shí)驗(yàn)站，江蘇揚(yáng)州 225007

【目的】研究稻縱卷葉螟（）轉(zhuǎn)錄因子CncC（Cap‘n’Collar Isoform C）及其調(diào)控的抗氧化酶基因在抗稻縱卷葉螟顆粒體病毒（Cnaphalocrocis medinalis granulovirus，CnmeGV）感染中的作用，進(jìn)一步豐富昆蟲(chóng)抗桿狀病毒感染的免疫調(diào)控機(jī)制研究?！痉椒ā渴褂肦T-PCR克隆得到稻縱卷葉螟（）cDNA全長(zhǎng)序列并分析其蛋白結(jié)構(gòu)；以106OB/mL濃度的CnmeGV或同濃度的CnmeGV和1 mmol·L-1CncC抑制劑——ML385混合液飼喂稻縱卷葉螟3齡幼蟲(chóng)，感染后6—48 h取樣，分析ML385對(duì)CnmeGV誘導(dǎo)的稻縱卷葉螟丙二醛（MDA）含量變化的影響，同時(shí)采用RT-qPCR分析病毒DNA復(fù)制水平、稻縱卷葉螟、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶-3（，）、錳超氧化物歧化酶（，）和硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶（，）等基因的表達(dá)水平，并每隔24 h統(tǒng)計(jì)幼蟲(chóng)死亡數(shù)，繪制10 d內(nèi)幼蟲(chóng)的Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)。使用1 mmol·L-1ML385或1 mmol·L-1ML385和200 μg·mL-1抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）混合液飼喂感染的幼蟲(chóng)，使用RT-qPCR分析不同時(shí)間病毒DNA復(fù)制水平?！窘Y(jié)果】cDNA全長(zhǎng)為3 404 bp，包括321 bp的5-UTR，847 bp的3-UTR和2 211 bp的ORF，編碼一個(gè)長(zhǎng)度為736 aa的蛋白，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為75.8 kDa。稻縱卷葉螟感染CnmeGV后丙二醛含量在感染的前12 h內(nèi)顯著上調(diào)，隨后在24 h恢復(fù)到正常水平，而在48 h低于對(duì)照組。病毒感染導(dǎo)致在12、24和48 h顯著上調(diào)表達(dá)，分別為對(duì)照組的1.56、2.16和2.63倍，NAC處理顯著降低了CnmeGV誘導(dǎo)的表達(dá)上調(diào)的倍數(shù)，分別降低至對(duì)照組的48.12%、59.83%和56.32%。ML385處理導(dǎo)致病毒基因拷貝數(shù)在12和24 h分別增至對(duì)照組的1.79和1.76倍，同時(shí)導(dǎo)致稻縱卷葉螟感染CnmeGV 10 d后的死亡率顯著升高，從單CnmeGV處理組的73.33%升至94.14%，而NAC處理能夠減輕由于CncC抑制導(dǎo)致的病毒基因拷貝數(shù)的上調(diào)。CnmeGV感染分別導(dǎo)致表達(dá)量在感染后48 h上調(diào)至對(duì)照組的3.68倍，表達(dá)量在12、24和48 h分別上調(diào)至對(duì)照組的1.73、2.62和2.77倍，表達(dá)量在12和24 h分別上調(diào)至對(duì)照組的1.76和2.10倍，但48 h恢復(fù)至對(duì)照組水平。使用NAC或CncC抑制劑處理感病幼蟲(chóng)發(fā)現(xiàn)，、和對(duì)CnmeGV感染的響應(yīng)被顯著削弱?！窘Y(jié)論】介導(dǎo)了CnmeGV感染誘導(dǎo)的、和上調(diào)表達(dá)，降低CnmeGV感染導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，從而限制病毒在其體內(nèi)的復(fù)制并降低氧化損傷。

稻縱卷葉螟；稻縱卷葉螟顆粒體病毒；CncC轉(zhuǎn)錄因子；氧化應(yīng)激；抗氧化基因；桿狀病毒

0 引言

【研究意義】稻縱卷葉螟（）是水稻上重要的遷飛性害蟲(chóng)之一，幼蟲(chóng)通過(guò)卷葉取食危害，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致水稻出現(xiàn)大片白葉，影響水稻產(chǎn)量[1]。目前生產(chǎn)上主要采用化學(xué)殺蟲(chóng)劑對(duì)其進(jìn)行控制，但化學(xué)農(nóng)藥的頻繁使用已導(dǎo)致稻縱卷葉螟抗藥性顯著上升[2]，因此，亟需尋求綠色高效的防控技術(shù)。桿狀病毒科是具有大型雙鏈DNA基因組的無(wú)脊椎動(dòng)物病毒，目前根據(jù)病毒基因組的比較，將桿狀病毒科分為4個(gè)屬：甲型桿狀病毒屬（，鱗翅目特異性核多角體病毒）、乙型桿狀病毒屬（，鱗翅目特異性顆粒體病毒）、丙型桿狀病毒屬（，膜翅目特異性核多角體病毒）和丁型桿狀病毒屬（，雙翅目特異性核多角體病毒）[3-5]，桿狀病毒作為一種新型的生物殺蟲(chóng)劑，具有毒力高、專(zhuān)一性強(qiáng)、不易產(chǎn)生抗性和環(huán)境穩(wěn)定性好等特性[6]，有希望成為防治農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的首選生物農(nóng)藥。1979年，研究人員首次從廣東省恩平縣水稻田稻縱卷葉螟幼蟲(chóng)體內(nèi)分離得到一株可感染稻縱卷葉螟的桿狀病毒——稻縱卷葉螟顆粒體病毒（Cnaphalocrocis medinalis granulovirus，CnmeGV）[7]，其在田間可有效控制稻縱卷葉螟種群數(shù)量，應(yīng)用前景廣泛[8]。同時(shí)又有研究發(fā)現(xiàn)CnmeGV感染稻縱卷葉螟的預(yù)期初始死亡時(shí)間約為8.4 d，致死中時(shí)間為20.16—21.98 d[9]，這一特性導(dǎo)致感染的幼蟲(chóng)仍可取食葉片危害，嚴(yán)重限制其推廣應(yīng)用。因此，探明稻縱卷葉螟對(duì)桿狀病毒的防御機(jī)制將為增強(qiáng)桿狀病毒殺蟲(chóng)劑應(yīng)用效果提供有力的技術(shù)支撐?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在哺乳動(dòng)物中研究發(fā)現(xiàn)，病毒誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是病毒感染引起的炎癥反應(yīng)和組織損傷的一個(gè)關(guān)鍵致病機(jī)制[10]。因此，清除體內(nèi)多余的活性氧（reactive oxygen species，ROS）對(duì)于保護(hù)細(xì)胞免受病毒感染損傷至關(guān)重要[11]。在昆蟲(chóng)中，病毒感染同樣會(huì)導(dǎo)致宿主氧化應(yīng)激損傷，例如，使用表達(dá)錳超氧化物歧化酶基因（-）的重組苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）感染粉紋夜蛾（）細(xì)胞系Tn-5B1-4后，其生存時(shí)間顯著高于感染野生型AcMNPV的細(xì)胞[12]。棉鈴蟲(chóng)（）感染棉鈴蟲(chóng)核多角體病毒（Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus，HearNPV）后，其體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的ROS，導(dǎo)致血淋巴中的丙二醛（MDA）濃度顯著升高[13]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HearNPV感染棉鈴蟲(chóng)誘導(dǎo)的高水平ROS限制了幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)和發(fā)育[14]。另外，硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶基因（）的敲低導(dǎo)致棉鈴蟲(chóng)對(duì)HearNPV的易感性顯著增加[13]。對(duì)稻縱卷葉螟的研究發(fā)現(xiàn)，9種抗氧化酶基因和4種抗氧化蛋白基因mRNA表達(dá)響應(yīng)CnmeGV的感染而上調(diào)，其中包括谷胱甘肽過(guò)氧化物酶-3基因（-）、-和[15]。桿狀病毒的感染會(huì)造成昆蟲(chóng)氧化損傷，并激活昆蟲(chóng)抗氧化酶系統(tǒng)。由于昆蟲(chóng)不像脊椎動(dòng)物那樣擁有完整的免疫系統(tǒng)，抗氧化酶系統(tǒng)在昆蟲(chóng)防御病毒感染中就起著更為關(guān)鍵的作用，然而對(duì)于昆蟲(chóng)在感染桿狀病毒過(guò)程中的抗氧化機(jī)制研究還較少?？寡趸磻?yīng)通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子——核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）屬于亮氨酸拉鏈家族。在正常生理?xiàng)l件下，Kelch ECH結(jié)合蛋白1（Keap1）結(jié)合Nrf2蛋白，使其定位于細(xì)胞質(zhì)中，最終被蛋白酶體降解。在氧化脅迫下，Keap1與Nrf2蛋白解離，Nrf2易位至細(xì)胞核，與小分子Maf蛋白結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子中的抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant responsive element，ARE），加速抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄[16-17]。Nrf2通過(guò)誘導(dǎo)多種關(guān)鍵抗氧化基因的表達(dá)來(lái)消除細(xì)胞中過(guò)量ROS的積累，包括谷胱甘肽代謝酶[18-19]、參與硫氧還蛋白代謝的酶[20]以及多種過(guò)氧化物代謝酶[19,21]，因此Nrf2在細(xì)胞抗氧化防御中具有重要作用。Nrf2在昆蟲(chóng)中又被稱(chēng)為Cap ‘n’ Collar Isoform C（CncC）。在黑腹果蠅（）中，使用RNA干擾（RNAi）技術(shù)敲減的表達(dá)，顯著降低了果蠅取食百草枯后的存活率。相反，過(guò)表達(dá)則分別使雌、雄蟲(chóng)存活率升高[22]。同樣在果蠅的研究中發(fā)現(xiàn)，CncC通過(guò)調(diào)控等抗氧化基因表達(dá)顯著降低了腸道干細(xì)胞中的ROS水平，導(dǎo)致腸道干細(xì)胞的增殖受到抑制，維持了腸道的穩(wěn)態(tài)[23]。Nrf2調(diào)節(jié)病原微生物誘導(dǎo)的ROS生成，在細(xì)胞消除細(xì)菌和病毒等病原體的過(guò)程中具有同樣重要的作用[24]。甲型流感病毒（H1N1 virus）感染人鼻黏膜上皮細(xì)胞（HNEpC）會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)ROS水平的嚴(yán)重失調(diào)，mRNA的敲減則顯著增強(qiáng)了H1N1病毒在細(xì)胞中的復(fù)制[25]。有研究顯示，使用Nrf2激活劑激活Nrf2后，鯉春病毒血癥病毒（SVCV）在胖頭鯉肌肉細(xì)胞系（FHM）中的復(fù)制水平被顯著降低，而的敲減導(dǎo)致病毒-的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對(duì)照組[26]。在甜菜夜蛾（）中，敲減顯著下調(diào)過(guò)氧化物酶基因的表達(dá)，幼蟲(chóng)感染囊泡病毒后病毒滴度和幼蟲(chóng)死亡率均顯著上升[27]。【本研究切入點(diǎn)】已有多項(xiàng)研究揭示了Nrf2通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化酶參與宿主防御病原微生物在感染過(guò)程中的作用。然而，昆蟲(chóng)CncC通路響應(yīng)桿狀病毒感染調(diào)控抗氧化系統(tǒng)的功能還未見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】克隆稻縱卷葉螟同源基因的全長(zhǎng)序列，分析響應(yīng)CnmeGV感染引起氧化應(yīng)激的表達(dá)模式，明確其通過(guò)調(diào)節(jié)稻縱卷葉螟抗氧化能力以抵抗病毒感染的作用。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2022年在江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所完成。

1.1 試蟲(chóng)與供試病毒

將稻縱卷葉螟成蟲(chóng)按雌雄比1﹕1配對(duì)，放入1 L的杯口蓋有保鮮膜的塑料水杯中交配產(chǎn)卵。幼蟲(chóng)使用玉米幼苗飼養(yǎng)于溫度（28±1）℃、相對(duì)濕度80%、光照強(qiáng)度6 000 lx的生化培養(yǎng)箱。飼養(yǎng)繁殖多代后，挑選健康、蟲(chóng)體大小一致的3齡幼蟲(chóng)供試。CnmeGV原始毒株為實(shí)驗(yàn)室保存，以無(wú)菌水稀釋至1×106OB/mL后噴施于玉米葉片，供試蟲(chóng)取食以增殖病毒。

1.2 CmCncC克隆

利用家蠶（）序列在稻縱卷葉螟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)[15]中檢索稻縱卷葉螟同源基因，設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物（表1）進(jìn)行中間片段的RT-PCR、克隆和測(cè)序，拼接獲得中間片段序列。根據(jù)測(cè)序結(jié)果分別在5和3端設(shè)計(jì)兩條特異性引物（表1），使用cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)進(jìn)行巢式PCR，并克隆和測(cè)序，與上述獲得的中間片段拼接獲得全長(zhǎng)cDNA?？俁NA提取和單鏈cDNA合成以及RACE具體方法分別參照Qiagen公司RNeasy Mini Kit和寶生物工程（大連）有限公司PrimescriptTMFirst-Strand cDNA Synthesis kit以及SMARTTMRACE cDNA Amplification試劑盒（Clontech）說(shuō)明書(shū)。

1.3 稻縱卷葉螟丙二醛含量測(cè)定

分別使用1×106OB/mL CnmeGV飼喂稻縱卷葉螟3齡幼蟲(chóng)，收集取食6、12、24和48 h后的試蟲(chóng)，以未感染幼蟲(chóng)作為對(duì)照（Control），使用脂質(zhì)氧化檢測(cè)試劑盒（碧云天生物）檢測(cè)CnmeGV感染對(duì)丙二醛含量的影響。同時(shí)，使用1 mmol·L-1ML385和CnmeGV混合液飼喂稻縱卷葉螟幼蟲(chóng)，以使用ML385飼喂的幼蟲(chóng)作為對(duì)照，檢測(cè)ML385對(duì)CnmeGV感染誘導(dǎo)的丙二醛含量的影響。所有處理設(shè)置3個(gè)生物重復(fù)組，每組收集試蟲(chóng)30只。

1.4 CmCncC在CnmeGV感染過(guò)程中的功能分析

1.4.1mRNA表達(dá)對(duì)CnmeGV感染的響應(yīng) 分別使用CnmeGV或200 μg·mL-1NAC和CnmeGV的混合液噴于玉米葉片上，接種稻縱卷葉螟3齡幼蟲(chóng)，收集感染6、12、24和48 h的試蟲(chóng)，以未感染幼蟲(chóng)作為對(duì)照（Control）。使用Trizol（Invitrogen）提取RNA后，熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-qPCR）檢測(cè)的表達(dá)，以稻縱卷葉螟-作為內(nèi)參基因，引物見(jiàn)表1。所有試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物重復(fù)組，每組收集試蟲(chóng)30只。

1.4.2 CmCncC抑制對(duì)CnmeGV DNA復(fù)制的影響 使用涂抹有CnmeGV或1 mmol·L-1ML385和CnmeGV混合液的玉米葉片飼喂幼蟲(chóng)，6、12、24和48 h后收集試蟲(chóng)，根據(jù)Lo等[28]和韓光杰等[29]的方法并進(jìn)行稍微修改進(jìn)行病毒DNA的qPCR檢測(cè)，稱(chēng)取100 mg幼蟲(chóng)，使用DNAiso Reagent（Takara）提取DNA，并通過(guò)qPCR檢測(cè)病毒基因拷貝數(shù)以確定病毒DNA的復(fù)制水平，引物見(jiàn)表1。接著，為了檢測(cè)CncC的抑制是否是通過(guò)改變氧化還原狀態(tài)影響病毒的復(fù)制，使用有NAC、ML385和CnmeGV混合液的玉米葉片飼喂幼蟲(chóng)，6、12、24和48 h后收集試蟲(chóng)，如上檢測(cè)病毒DNA復(fù)制水平，以1 mmol·L-1ML385和CnmeGV混合液飼喂的幼蟲(chóng)作為對(duì)照。所有試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物重復(fù)組，每組收集試蟲(chóng)30只。

表1 用于RT-PCR、RT-qPCR和RACE的引物序列

1.4.3 CmCncC抑制對(duì)CnmeGV殺蟲(chóng)效果的影響 首先，為了明確飼喂ML385對(duì)幼蟲(chóng)生存率的影響，使用涂抹有ML385的玉米葉片飼喂幼蟲(chóng)，每隔24 h統(tǒng)計(jì)試蟲(chóng)的死亡數(shù)，并以健康幼蟲(chóng)作為對(duì)照。接著使用涂抹有ML385和CnmeGV混合液的玉米葉片飼喂幼蟲(chóng)，每隔24 h統(tǒng)計(jì)試蟲(chóng)的死亡數(shù)，并以?xún)H感染CnmeGV的幼蟲(chóng)作為對(duì)照。參見(jiàn)徐健等[9]方法統(tǒng)計(jì)蟲(chóng)口死亡率和死亡時(shí)間，繪制生存曲線(xiàn)。所有試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物重復(fù)組，每組收集試蟲(chóng)30只。

1.5 GPx-3、Mn-SOD和TPx響應(yīng)CnmeGV感染的表達(dá)分析

使用CnmeGV飼喂稻縱卷葉螟3齡幼蟲(chóng)，收集感染6、12、24和48 h的試蟲(chóng)，以未感染幼蟲(chóng)作為對(duì)照（Control）。使用Trizol（Invitrogen）提取RNA后，利用RT-qPCR分析-、-和表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化，以稻縱卷葉螟-作為內(nèi)參基因，引物見(jiàn)表1。接著使用NAC和CnmeGV混合液或ML385和CnmeGV混合液的玉米葉片飼喂幼蟲(chóng)，6、12、24和48 h后收集試蟲(chóng)，如上方法檢測(cè)、和的mRNA表達(dá)，以CnmeGV飼喂的稻縱卷葉螟為對(duì)照。所有試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物重復(fù)組，每組收集試蟲(chóng)30只。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)表示為至少3個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM）。通過(guò)檢驗(yàn)分析基因表達(dá)量及丙二醛含量的差異，Kaplan-Meier法繪制生存曲線(xiàn)，并采用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存曲線(xiàn)比較，＜0.01或＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CmCncC克隆及分析

（Genbank登錄號(hào)：OQ606863）cDNA全長(zhǎng)3 404 bp，包括321 bp的5-UTR、847 bp的3-UTR和2 211 bp的ORF，編碼一個(gè)長(zhǎng)度為736 aa的蛋白，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為75.8 kDa，等電點(diǎn)為6.36。氨基酸序列比對(duì)顯示，CmCncC與小菜蛾（）、棉鈴蟲(chóng)、二化螟（）、草地貪夜蛾（）的CncC分別具有74.63%、75.03%、75.03%和75.03%的一致性，并且均包含有6個(gè)功能性Nrf2-ECH（Neh）同源結(jié)構(gòu)域、CNC-bZIP DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和Keap1結(jié)合基序（DMG和ETGE）（圖1）。

圖中紅框標(biāo)注的Neh1-6為CncC的6個(gè)保守功能域，藍(lán)框標(biāo)注的為CNC-bZIP DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，綠框標(biāo)注的為與Keap1結(jié)合基序（DMG和ETGE）

The six conserved functional domains of CncC, denoted by Neh1-6 in red boxes, are shown, as well as the CNC-bZIP DNA binding domain denoted by blue boxes, and the Keap1 binding motifs (DMG and ETGE) denoted by green boxes

圖1 CmCncC與小菜蛾CncC、棉鈴蟲(chóng)Nrf2、二化螟CncC和草地貪夜蛾CncC氨基酸序列的比對(duì)

Fig. 1 Amino acid sequence alignments of CmCncC withCncC,Nrf2,CncC andCncC

2.2 稻縱卷葉螟體內(nèi)丙二醛含量分析

以丙二醛含量作為脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)來(lái)驗(yàn)證CnmeGV感染影響稻縱卷葉螟體內(nèi)氧化應(yīng)激的反應(yīng)，結(jié)果顯示在感染6和12 h后，其體內(nèi)丙二醛含量顯著上升至對(duì)照組（未感染CnmeGV）的4.84和17.25倍（＜0.05），而在感染48 h時(shí)，丙二醛含量則降為對(duì)照組的46.23%（＜0.05）（圖2-A）。進(jìn)一步檢測(cè)了CmCncC抑制后稻縱卷葉螟丙二醛含量，結(jié)果顯示ML385+CnmeGV處理導(dǎo)致丙二醛含量在處理6、12、24和48 h后分別顯著上調(diào)至對(duì)照組（ML385處理）的7.25、23.62、3.88和2.10倍。與使用CnmeGV處理導(dǎo)致的丙二醛含量上調(diào)倍數(shù)比較顯示，ML385處理在12、24和48 h后顯著增強(qiáng)了病毒感染導(dǎo)致的丙二醛含量上調(diào)倍數(shù)（圖2-B）。結(jié)果表明ML385對(duì)CmCncC的抑制能夠增強(qiáng)CnmeGV感染導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷。

A：稻縱卷葉螟感染CnmeGV后丙二醛含量檢測(cè)Detection of MDA content after GnmeGV infection；B：ML385處理對(duì)病毒誘導(dǎo)的丙二醛含量變化的影響The effect of ML385 treatment on virus-induced changes in MDA content

2.3 稻縱卷葉螟感染CnmeGV后CmCncC表達(dá)水平

使用CnmeGV感染稻縱卷葉螟后，RT-qPCR檢測(cè)其體內(nèi)mRNA表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示，在感染12—48 h內(nèi)，的表達(dá)分別上調(diào)至對(duì)照組（未感染CnmeGV）的1.56、2.16和2.63倍（＜0.05）（圖3-A）。NAC處理顯著降低了CnmeGV誘導(dǎo)的表達(dá)上調(diào)的倍數(shù)，在處理12、24和48 h后，分別降低至GV/Control組比值的48.12%、59.83%和56.32%（＜0.05）（圖3-B）。結(jié)果表明，CnmeGV感染可能通過(guò)氧化應(yīng)激途徑誘導(dǎo)表達(dá)。

2.4 抑制CmCncC功能對(duì)CnmeGV增殖及稻縱卷葉螟生存率影響

使用CncC抑制劑（ML385）與CnmeGV共同飼喂稻縱卷葉螟，檢測(cè)其體內(nèi)病毒DNA復(fù)制水平，結(jié)果顯示CmCncC的抑制導(dǎo)致病毒基因拷貝數(shù)在12和24 h分別增至對(duì)照組（飼喂CnmeGV）的1.79和1.76倍（＜0.05）（圖4-A）。但附加NAC處理則會(huì)減輕由CmCncC抑制導(dǎo)致的病毒基因拷貝數(shù)的上調(diào)（＜0.05）（圖4-B）。同時(shí)，檢測(cè)抑制CmCncC功能對(duì)CnmeGV致死作用的影響，發(fā)現(xiàn)抑制劑本身對(duì)稻縱卷葉螟生長(zhǎng)無(wú)明顯影響（＝0.7235）（圖4-C），而抑制劑與病毒共處理導(dǎo)致稻縱卷葉螟10 d死亡率顯著升高，從單病毒處理組的73.33%升至94.14%，兩者生存曲線(xiàn)呈顯著差異（＝0.018）（圖4-C）。

A：稻縱卷葉螟感染CnmeGV后CmCncC mRNA表達(dá)量檢測(cè)Detection of CmCncC mRNA level after CnmeGV infection；B：NAC處理對(duì)病毒誘導(dǎo)的CmCncC表達(dá)變化的影響The effect of NAC treatment on virus-induced changes in CmCncC mRNA level

A：CnmeGV合并ML385處理后，提取DNA，檢測(cè)CnmeGV granulin基因拷貝數(shù)After treatment with CnmeGV combined ML385, DNA was extracted and the copy number of the CnmeGV granulin was detected；B：NAC對(duì)抑制劑處理導(dǎo)致的病毒基因拷貝數(shù)變化的影響檢測(cè)The effect of NAC on the changes in viral gene copy numbers caused by ML385 treatment was examined；C：病毒感染后稻縱卷葉螟的生存動(dòng)態(tài)分析The survival dynamics of the C. medinalis after viral infection were analyzed

2.5 CncC介導(dǎo)了CnmeGV感染對(duì)GPx-3、Mn-SOD和TPx mRNA表達(dá)的誘導(dǎo)

CncC通過(guò)調(diào)控抗氧化基因轉(zhuǎn)錄可有效防止氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，、和等作為CncC重要的下游基因，在CncC調(diào)控宿主抗氧化應(yīng)激中具有重要功能[30-32]。本研究發(fā)現(xiàn)，CnmeGV感染后，表達(dá)水平在48 h上調(diào)至對(duì)照組（未感染CnmeGV）的3.68倍（＜0.01）（圖5-A），表達(dá)水平在12和24 h分別上調(diào)至對(duì)照組的1.76和2.10倍（＜0.05），但是在48 h降低至對(duì)照組水平（圖5-B），表達(dá)水平在12、24和48 h分別上調(diào)至對(duì)照組的1.73（＜0.05）、2.62和2.77倍（＜0.01）（圖5-C）。使用NAC或CncC抑制劑處理則顯著降低病毒感染對(duì)、和表達(dá)的誘導(dǎo)作用（＜0.05）（圖6）。

3 討論

3.1 稻縱卷葉螟CncC蛋白具有典型的Nrf2轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域

Nrf2是響應(yīng)氧化應(yīng)激的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在昆蟲(chóng)體內(nèi)一般稱(chēng)為CncC，被氧化應(yīng)激激活的CncC通過(guò)與下游基因啟動(dòng)子區(qū)的ARE元件結(jié)合刺激抗氧化基因轉(zhuǎn)錄，在保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷方面具有重要作用[33-34]。在果蠅和哺乳動(dòng)物中的抗氧化作用已多有研究，但是在昆蟲(chóng)抵抗桿狀病毒過(guò)程中的作用還未有報(bào)道。本研究克隆了稻縱卷葉螟同源基因的cDNA全長(zhǎng)序列，氨基酸序列比對(duì)顯示，CmCncC與小菜蛾、棉鈴蟲(chóng)、二化螟、草地貪夜蛾的同源蛋白具有較高的一致性，且均包含有6個(gè)功能性Neh結(jié)構(gòu)域、CNC-bZIP DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和Keap1結(jié)合基序（DMG和ETGE）（圖1）。Neh1區(qū)域負(fù)責(zé)DNA識(shí)別；Neh2包含ETGE和DLG基序，這是與Keap1相互作用所必需的；Neh4和Neh 5是基因轉(zhuǎn)錄的反式激活域；Neh6充當(dāng)降解決定子，介導(dǎo)細(xì)胞核中Nrf2的降解[35]。Keap1通過(guò)與Nrf2的Neh2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，將Nrf2隔離在細(xì)胞質(zhì)中，形成Keap1-Nrf2復(fù)合物[36-38]。一旦進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，Keap1-Nrf2復(fù)合物就會(huì)與E3泛素連接酶結(jié)合，導(dǎo)致Nrf2降解并終止Nrf2信號(hào)通路[39-40]。氧化應(yīng)激則使該復(fù)合物解離，導(dǎo)致Nrf2轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核以激活其轉(zhuǎn)錄因子功能。

**：差異極顯著extremely significant difference (P＜0.01)。下同The same as below

圖6 NAC或ML385處理對(duì)CnmeGV誘導(dǎo)的抗氧化基因表達(dá)水平影響

3.2 CncC降低CnmeGV誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激以抵抗感染損傷

研究發(fā)現(xiàn)包括桿狀病毒在內(nèi)的昆蟲(chóng)病毒感染會(huì)導(dǎo)致昆蟲(chóng)體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量ROS[27,41-42]。本研究檢測(cè)了稻縱卷葉螟感染CnmeGV后體內(nèi)丙二醛含量的變化，結(jié)果顯示，在感染后6和12 h，丙二醛含量顯著增加，而在48 h顯著降低（圖2），表明CnmeGV在感染前期迅速誘導(dǎo)大量的ROS生產(chǎn)，造成脂質(zhì)氧化，而丙二醛在感染48 h后降低，則可能與細(xì)胞的大量死亡有關(guān)。研究結(jié)果表明在感染前期，病毒會(huì)迅速誘導(dǎo)宿主的氧化應(yīng)激反應(yīng)。這與在家蠶中的研究一致，家蠶核多角體病毒（Bombyx mori nuclearpolyhedrosisvirus）感染導(dǎo)致家蠶體內(nèi)ROS含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)先升高后降低，在72 h時(shí)達(dá)到最高水平，在96 h則有所下降[43]。因此，為了降低氧化損傷，宿主昆蟲(chóng)會(huì)激活自身的抗氧化防御系統(tǒng)以應(yīng)對(duì)病毒的感染。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)感染CnmeGV后稻縱卷葉螟表達(dá)會(huì)在12—24 h顯著上調(diào)（圖3-A），而抗氧化劑NAC處理則會(huì)導(dǎo)致對(duì)CnmeGV的響應(yīng)顯著減弱（圖3-B）。與此發(fā)現(xiàn)相似，BmNPV感染導(dǎo)致家蠶超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化物酶等抗氧化酶的活性先降低后升高[43]，表明桿狀病毒感染會(huì)引起宿主抗氧化防御系統(tǒng)的響應(yīng)。使用ML385處理發(fā)現(xiàn)，CmCncC的抑制進(jìn)一步提高了病毒感染導(dǎo)致的丙二醛含量升高（圖2），并顯著增加病毒復(fù)制和幼蟲(chóng)死亡率（圖4-A、4-C），而CmCncC抑制導(dǎo)致病毒復(fù)制的增強(qiáng)會(huì)在一定程度上被NAC處理所拯救（圖4-B），這些結(jié)果表明誘導(dǎo)宿主的抗氧化功能對(duì)于保護(hù)宿主免受病毒引起的氧化損傷具有重要的作用。有研究指出，人樹(shù)突狀細(xì)胞感染登革熱病毒后，會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加，而由Nrf2調(diào)節(jié)的抗氧化通路的激活有助于通過(guò)維持氧化還原穩(wěn)態(tài)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞抗病毒和凋亡反應(yīng)[44]。然而在埃及伊蚊（）中發(fā)現(xiàn)，中腸中敲減導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平的上調(diào)則會(huì)顯著降低中腸中寨卡病毒的感染，這可能由于控制下的抗氧化機(jī)制在促進(jìn)氧化還原平衡和中腸組織穩(wěn)態(tài)的同時(shí)，也減弱了中腸屏障感染的作用[45]，因此有必要進(jìn)一步研究在稻縱卷葉螟不同組織部位發(fā)揮功能的差異性。

3.3 CncC通過(guò)調(diào)控GPx-3、Mn-SOD和TPx mRNA表達(dá)參與減輕病毒感染誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激

Nrf2/ARE通路是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最重要的內(nèi)源性抗氧化信號(hào)通路之一。當(dāng)體內(nèi)氧化還原平衡失調(diào)時(shí)，Nrf2被激活，通過(guò)結(jié)合ARE來(lái)調(diào)節(jié)抗氧化基因的表達(dá)，例如-、-和等[30,46]。在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞研究中，氧化應(yīng)激促進(jìn)Keap1-Nrf2復(fù)合物的解離，從而激活Nrf2，激活的Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)和等抗氧化酶基因的表達(dá)[47]。暴露于過(guò)量ROS時(shí)，昆蟲(chóng)體內(nèi)的CncC同樣會(huì)被激活。近期在赤擬谷盜（）的研究中指出，由溴氰菊酯引起的ROS過(guò)量導(dǎo)致昆蟲(chóng)體內(nèi)AMP依賴(lài)的蛋白激酶（AMPK）被磷酸化激活，激活的AMPK又使CncC磷酸化從而也被激活[48]。之前有研究顯示，核多角體病毒感染棉鈴蟲(chóng)后會(huì)導(dǎo)致過(guò)量ROS的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)表達(dá)顯著上調(diào)，同時(shí)的敲減則顯著增加棉鈴蟲(chóng)對(duì)病毒的敏感性[13]。在家蠶和果蠅研究中也發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子CncC參與了對(duì)表達(dá)的調(diào)控[23,30]。這些報(bào)道與本研究結(jié)果一致，在稻縱卷葉螟中，、-和表達(dá)會(huì)響應(yīng)CnmeGV感染顯著上調(diào)（圖5），并且NAC或CncC抑制劑處理都會(huì)在一定程度上削弱CnmeGV感染對(duì)這些基因表達(dá)的誘導(dǎo)（圖6），這些結(jié)果表明作為響應(yīng)氧化應(yīng)激的轉(zhuǎn)錄因子，可能在病毒感染期間參與了對(duì)、和表達(dá)的調(diào)控以減輕氧化損傷，但CmCncC是否能結(jié)合這3個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)而直接調(diào)控這3個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

由于昆蟲(chóng)的抗病毒機(jī)制，桿狀病毒制劑的殺蟲(chóng)速度慢于傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥，桿狀病毒殺蟲(chóng)劑的殺蟲(chóng)速度因昆蟲(chóng)的抗病毒機(jī)制而變得很慢。因此，了解昆蟲(chóng)抗病毒感染的免疫機(jī)制將有助于桿狀病毒殺蟲(chóng)劑的推廣應(yīng)用。本研究從CnmeGV感染引起氧化損傷的角度出發(fā)，分析了重要抗氧化轉(zhuǎn)錄因子CncC在抗病毒過(guò)程中的作用，闡明了昆蟲(chóng)可通過(guò)CncC信號(hào)通路調(diào)節(jié)抗氧化基因表達(dá)，減少氧化損傷的功能。該結(jié)果為進(jìn)一步明確害蟲(chóng)免疫桿狀病毒的機(jī)制打下基礎(chǔ)，為增強(qiáng)桿狀病毒殺蟲(chóng)劑的殺蟲(chóng)效果提供了潛在靶標(biāo)，有利于相關(guān)產(chǎn)品的推廣與應(yīng)用。

4 結(jié)論

稻縱卷葉螟CncC屬于昆蟲(chóng)Cap ‘n’ Collar家族，具有完整的CncC結(jié)構(gòu)域，其通過(guò)介導(dǎo)桿狀病毒CnmeGV感染引起的、和mRNA表達(dá)上調(diào)，減輕了感染導(dǎo)致的氧化損傷。結(jié)果揭示了CncC的抗氧化功能對(duì)昆蟲(chóng)免疫桿狀病毒的重要作用，為通過(guò)破壞稻縱卷葉螟的抗氧化能力提高桿狀病毒的殺蟲(chóng)效果打下理論基礎(chǔ)。

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Response and function of the transcription factor CncC ininfected with baculovirus CnmeGV

ZHANG Nan, HAN GuangJie, LIU Qin, LI ChuanMing, QI JianHang, LU YuRong, XIA Yang, XU Jian

Lixiahe District Institute of Agricultural Sciences in Jiangsu/National Agricultural Experimental Station for Agricultural Microbiology in Yangzhou, Yangzhou 225007, Jiangsu

【Objective】The objective of this study is to research the role of transcription factor CncC (Cap ‘n’ Collar Isoform C) ofand its regulation of antioxidant enzyme genes in the infection ofCnaphalocrocis medinalis granulovirus (CnmeGV), and to further enrich the study of immune regulation mechanism of insects against baculovirus.【Method】The full-length cDNA sequence ofin() was cloned by RT-PCR, and its protein structure was analyzed. Third instar larvae ofwere fed with 106OB/mL concentration of CnmeGV or a mixture of the same concentration of CnmeGV and 1 mmol·L-1CncC inhibitor ML385. Samples were taken 6-48 h after infection to analyze the effect of ML385 on the change of malondialdehyde (MDA) content induced by CnmeGV, and viral DNA replication levels, the expression levels of,-(-),(-), and() were analyzed by RT-qPCR. The number of larval deaths was counted every 24 hours, and the Kaplan-Meier survival analysis of the larvae within 10 d was conducted. Infected larvae were fed with 1 mmol·L-1ML385 or a mixture of 1 mmol·L-1ML385 and 200 μg·mL-1antioxidant N-acetyl-L-cysteine (NAC), and viral DNA replication levels at different times were analyzed using RT-qPCR.【Result】The full length cDNA ofwas 3 404 bp, including a 321 bp 5-UTR, an 847 bp 3-UTR, and a 2 211 bp ORF that encoded a protein of 736 amino acids. The predicted molecular weight of the protein was 75.8 kDa. The MDA content insignificantly increased within the first 12 h of CnmeGV infection and returned to normal levels at 24 h, but was lower than the control group at 48 h. The expression ofwas significantly up-regulated at 12, 24, and 48 h after viral infection, by 1.56, 2.16, and 2.63 folds of the control group, respectively. NAC treatment significantly reduced the fold increase ofexpression induced by CnmeGV, to 48.12%, 59.83%, and 56.32% of the control group, respectively. Treatment with the ML385 caused an increase in viral gene copy number to 1.79 and 1.76 folds of the control group at 12 and 24 h, respectively, and significantly increased the mortality rate ofinfected with CnmeGV 10 d after treatment, from 73.33% to 94.14%. NAC treatment partially alleviated the up-regulation of viral gene copy number caused by CncC inhibition. CnmeGV infection led to a 3.68-fold increase in-expression level at 48 h after infection, and 1.73-, 2.62-, and 2.77-folds increase in-expression level at 12, 24, and 48 h after infection, respectively. The expression level ofincreased by 1.76 and 2.10 folds at 12 and 24 h after infection, respectively, but returned to the control group level at 48 h, and treatment with NAC or the CncC inhibitor significantly weakened the responses of-,-, andto CnmeGV infection.【Conclusion】CmCncC mediates the CnmeGV infection-induced up-regulation of-,-andmRNA levels and reduces oxidative stress caused by CnmeGV infection, thereby limiting virus replication, and reducing oxidative damage.

; Cnaphalocrocis medinalis granulovirus (CnmeGV); CncC transcription factor; oxidative stress; antioxidant gene; baculovirus

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.13.005

2023-03-21；

2023-05-13

江蘇省自然科學(xué)基金（BE20191216）、江蘇省自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目（CX[20]1004）、江蘇省“333”優(yōu)秀青年人才項(xiàng)目（蘇人才辦[2022]21號(hào)）、揚(yáng)州市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)項(xiàng)目（YZ2021034）

張楠，E-mail：znfezhangnan@hotmail.com。韓光杰，E-mail：hanguangjie177@163.com。張楠和韓光杰為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者徐健，E-mail：bio-xj@163.com

（責(zé)任編輯 岳梅）