馬鳴超，姜昕，王鵬輝，關(guān)大偉，李俊

大豆根瘤菌菌株5873 PCR快速檢測方法的建立及應(yīng)用效果評價(jià)

馬鳴超，姜昕，王鵬輝，關(guān)大偉，李俊

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081

【目的】大豆根瘤菌（）是微生物肥料重要的功能菌種之一，可通過生物固氮為大豆生長提供氮素，實(shí)現(xiàn)節(jié)本增效，菌株5873作為其典型代表，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。篩選并鑒定其特異引物，建立大豆根瘤菌5873菌株水平的快速檢測方法，對微生物肥料生產(chǎn)菌種鑒定、產(chǎn)品質(zhì)量檢測和功能評價(jià)至關(guān)重要。【方法】以商業(yè)化菌株大豆根瘤菌5873為供試材料，基于其全基因組序列和NCBI數(shù)據(jù)庫中大豆根瘤菌種內(nèi)參比菌株相關(guān)序列，以及與其高度同源（基因組ANI值大于99.95%）的大豆根瘤菌USDA 6T差異片段，通過多重序列比對，進(jìn)行特異引物設(shè)計(jì)和篩選，獲得特異性引物對，并通過對PCR反應(yīng)條件/體系優(yōu)化、特異性及靈敏度檢測，建立大豆根瘤菌5873的快速檢測方法。然后，采用盆栽試驗(yàn)，將大豆根瘤菌5873與其他根瘤菌菌株混合接種于大豆根際，應(yīng)用上述方法對大豆根瘤菌5873競爭結(jié)瘤能力進(jìn)行評價(jià)和方法驗(yàn)證?！窘Y(jié)果】篩選獲得了一組特異引物4-4和Q1（4-4-F 5′-GATAAGGCCACGGGTGAACA-3′/4-4-R 5′-CACTCGATAAGCTCCGCTGT-3′和Q1-F 5′-CCGGTCGTGACTGGAATGAT-3′/Q1-R 5′-TCGAGGCCTACAAGAACGTC-3′），優(yōu)化并建立了PCR快速檢測方法，即反應(yīng)體系：Premix TaqTM12.5 μL，引物各1.0 μL，基因組DNA 15 ng左右，加ddH2O補(bǔ)足至25 μL；反應(yīng)條件：95℃ 預(yù)熱5 min，94℃ 變性45 s，61℃ 退火45 s，72℃ 延伸60 s，30個循環(huán)，再72℃ 延伸10 min。通過凝膠電泳檢測目的條帶的有無（355和218 bp），即可實(shí)現(xiàn)大豆根瘤菌5873的快速檢測，該方法檢出靈敏度為1 850 CFU/μL。此外，借助該方法可以成功地評價(jià)大豆根瘤菌5873競爭結(jié)瘤能力，與傳統(tǒng)BOX-PCR評價(jià)結(jié)果一致。【結(jié)論】大豆根瘤菌5873快速鑒定方法的建立實(shí)現(xiàn)了以菌體發(fā)酵液或根瘤破碎提取液為模板，直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增的鑒定操作，省去了根瘤的分離、根瘤菌分離純化、培養(yǎng)、DNA提取及測序鑒定等繁瑣的環(huán)節(jié)，大大減少了工作量，只需短短幾個小時便可準(zhǔn)確檢測大豆根瘤菌5873，為微生物肥料中根瘤菌菌劑的產(chǎn)品質(zhì)量檢測和競爭結(jié)瘤能力評價(jià)提供了參考。

大豆根瘤菌；特異引物；PCR擴(kuò)增；競爭結(jié)瘤

0 引言

【研究意義】隨著國家在農(nóng)業(yè)戰(zhàn)略上的調(diào)整，發(fā)展資源節(jié)約型、環(huán)境友好型的“兩型農(nóng)業(yè)”成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必由之路[1]。其中，包括根瘤菌在內(nèi)的微生物肥料作為綠色新型投入品和優(yōu)先發(fā)展的生物制品，在減肥減藥、節(jié)本增效、提高作物品質(zhì)等方面表現(xiàn)突出[2]。大豆根瘤菌（）可與大豆形成高效的共生固氮體系，有效減少化學(xué)氮肥的施用[3-4]，是微生物肥料中重要的功能菌種之一，大豆根瘤菌5873作為其典型代表，目前已在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部登記并廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。篩選并鑒定其特異性引物，建立菌株水平的快速檢測方法，對微生物肥料產(chǎn)品質(zhì)量檢測、功能評價(jià)及菌株知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)具有重要的研究意義和實(shí)踐價(jià)值。【前人研究進(jìn)展】目前對于大豆根瘤菌的檢測主要依靠傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分析和Biolog等生理生化鑒定[5-6]，基于16S rDNA、、、、、、和基因等保守序列的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析等傳統(tǒng)多相分類鑒定[7-13]，以及新發(fā)展起來的全基因組測序[14]、平均核苷酸一致性（ANI）比較[15]、多位點(diǎn)序列分析（MLSA）法[16]、BOX-PCR指紋圖譜分析[17]等技術(shù)，其結(jié)果通?？蓪?shí)現(xiàn)種水平、菌株水平上的鑒別[14-19]，但由于操作步驟多、時間長，難以廣泛地實(shí)施推廣。以慢生大豆根瘤菌為例，包括在國內(nèi)外廣泛商業(yè)化應(yīng)用的菌株大豆根瘤菌USDA 110T[20]（后改為有效慢生根瘤菌[21]）和國內(nèi)外研究較為常見模式菌株大豆根瘤菌USDA 6T[15,22-23]在內(nèi)，均未建立菌株水平的快速檢測技術(shù)。此外，在全基因組水平上，大豆根瘤菌5873和USDA 6T的基因組ANI值等于99.95%，前者與后者相比缺失了一段51 bp的序列，另外，兩個菌株間還有3個SNP位點(diǎn)差異，常規(guī)技術(shù)手段很難區(qū)分。在應(yīng)用層面上，土壤中存在大量競爭結(jié)瘤能力強(qiáng)而固氮能力弱的土著根瘤菌群，這直接影響到接種根瘤菌劑的占瘤率，導(dǎo)致其接種效果不理想[24-25]。目前，BOX-PCR被廣泛地應(yīng)用于根瘤菌占瘤率的測定[26-27]，但在操作中需要根瘤菌分離純化培養(yǎng)、DNA提取及需要結(jié)合基因測序鑒定等繁瑣環(huán)節(jié)，費(fèi)時費(fèi)力，且試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性差，實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果很難重現(xiàn)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】鑒于以上問題，亟需建立菌株快速檢測和評價(jià)技術(shù)。因此，本研究選用自主研發(fā)且已商業(yè)化的大豆根瘤菌5873為供試材料，設(shè)計(jì)特異性引物，建立PCR快速檢測方法。【擬解決的關(guān)鍵問題】在特異性引物設(shè)計(jì)上，除考慮大豆根瘤菌5873全基因組序列和NCBI數(shù)據(jù)庫大豆根瘤菌參比菌株相關(guān)序列外，重點(diǎn)分析與其高度同源的大豆根瘤菌USDA 6T差異片段，設(shè)計(jì)引物，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件/體系，并進(jìn)行特異性及靈敏度檢測，實(shí)現(xiàn)大豆根瘤菌菌株水平上的快速檢測，為微生物肥料中根瘤菌的檢測和競爭結(jié)瘤能力評價(jià)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2020—2021年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所完成。

1.1 供試菌株

選用商業(yè)化菌株大豆根瘤菌5873為供試菌株，以實(shí)驗(yàn)室保藏的42株慢生根瘤菌屬、2株中華根瘤菌屬和1株根瘤菌屬的菌株為參比菌株（含模式菌株），結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫中大豆根瘤菌相關(guān)序列，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和特異性驗(yàn)證。供試菌株及編號見表1。

表1 供試菌株

1.2 主要試劑和儀器

TIANamp Bacteria DNA Kit（天根生化科技北京有限公司）；Fast-T1化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞、5 minTMTA/ Blunt-Zero Cloning Kit、Fast Pure Gel DNA Extraction Mini Kit、Fast Pure Plasmid Mini Kit等均購自南京諾唯贊生物科技公司；裂解液配制[28]（20 mmol·L-1Tris（pH 8.0）、25 mmol·L-1NaCl、2.5 mmoL·L-1EDTA、0.05% SDS、5% chelex-100）；Premix Taq（TaKaRa公司）；YMA液體培養(yǎng)基（甘露醇10 g、七水合硫酸鎂0.2 g、氯化鈉0.1 g、磷酸二氫鉀0.5 g、酵母膏0.5 g，定容至1 L，pH 6.8—7.2）；C1000 PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）；DYY-8C電泳儀（北京市六一儀器廠）；NanoDropND-2000C微量紫外分光光度計(jì)（Thermo）。

1.3 菌株DNA提取與純度檢測

挑取培養(yǎng)好的單菌落，采用TIANamp Bacteria DNA Kit提取菌株DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并用NanoDropND-2000C微量紫外分光光度計(jì)檢測其濃度。

1.4 特異引物設(shè)計(jì)和篩選

大豆根瘤菌5873基因組總長度為9 160 134 bp（登錄號：WWEZ00000000），選取其中scf-1序列（總長度為1 442 588 bp），初步分割成721個2 kb的片段，在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，找出同源性較低的特異序列。在NCBI數(shù)據(jù)庫中，將特異序列進(jìn)行primer-BLAST，綜合考慮引物長度、GC含量、是否產(chǎn)生二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)等原則，引物設(shè)計(jì)選擇默認(rèn)值設(shè)定為20 bp，GC含量選擇為40%—60%，兩引物之間不存在互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)，然后從16個同源性較低的2 kb的片段中，選擇較好的20對引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

分別提取大豆根瘤菌5873和上述參比菌株DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以篩選具有特異性的引物，同時以無菌水為陰性對照。

1.5 PCR擴(kuò)增優(yōu)化及方法建立

1.5.1 PCR體系/反應(yīng)條件的建立與優(yōu)化 以大豆根瘤菌5873基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過優(yōu)化退火溫度（54—61℃）、模板DNA量（3—51 ng）、引物添加量（濃度為10 μmol·L-1，0.5—2.0 μL）等建立最適PCR反應(yīng)條件/體系。

1.5.2 菌落PCR擴(kuò)增 菌株用YMA液體培養(yǎng)基于30℃，180 r/min培養(yǎng)5 d。取2 μL作為模板，以最優(yōu)化的PCR條件進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。

1.5.3 靈敏度檢測 將大豆根瘤菌5873接種于YMA培養(yǎng)基，180 r/min，30℃，培養(yǎng)5 d，用無菌水對上述培養(yǎng)液進(jìn)行系列梯度稀釋。分別取2 μL為模板，進(jìn)行最優(yōu)條件的菌落PCR反應(yīng)。并將稀釋倍數(shù)為105、106和107的菌液涂布于添加瓊脂的YMA培養(yǎng)基平板上進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。每個稀釋梯度做3個平行。

1.5.4 目的條帶驗(yàn)證 以大豆根瘤菌5873 DNA為模板，以最優(yōu)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后，與pCE2載體連接，轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)后，隨機(jī)挑取陽性克隆，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.6 方法驗(yàn)證及評價(jià)應(yīng)用

1.6.1 菌劑制備及盆栽試驗(yàn) 將供試菌株大豆根瘤菌5873、實(shí)驗(yàn)室保存的菌株大豆根瘤菌5841、5821、5136、5119、5665和商業(yè)化菌株有效慢生根瘤菌USDA 110T，分別進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)。然后，將大豆根瘤菌5873分別與其他6株菌兩兩等體積混合后作為復(fù)合菌劑待用。

選擇大小相近的大豆種子，在95%的酒精中浸泡1 min，用5%次氯酸鈉滅菌5 min，然后用無菌水清洗5—6次。分別將每株菌的發(fā)酵液與保護(hù)劑共同包衣在滅菌的大豆種子表面，播種在盛有滅菌蛭石的塑料盆（9.5 cm×10 cm）中，作為陽性對照；把兩兩混合后的復(fù)合菌劑與保護(hù)劑共同包衣后播種，作為處理組。將植株置于光照培養(yǎng)箱中，光照10 h、28℃，黑暗14 h、25℃。出苗后每盆留苗3棵，并以不接種為陰性對照。每個處理設(shè)3個重復(fù)，培養(yǎng)40 d后測定大豆根瘤數(shù)量及大豆根瘤菌5873占瘤率。

1.6.2 占瘤率測定 分別用本研究建立的PCR快速檢測技術(shù)及傳統(tǒng)BOX-PCR兩種方法測定大豆根瘤菌5873占瘤率。測定時，將大豆根部置于自來水中沖洗干凈，把根瘤浸泡于蒸餾水中重復(fù)3—4次，然后，將清洗的根瘤蘸取95%的酒精，用火焰進(jìn)行灼燒。挑取充分滅菌的根瘤，放置于1.5 mL的EP管中，加入200 μL的裂解液，用滅菌的竹簽將根瘤破碎。破碎的液體置于振蕩儀上充分混合，置于沸水浴中5 min，在-20℃進(jìn)行冰凍。取2.0 μL凍融的樣品作模板，進(jìn)行上述特異PCR擴(kuò)增和BOX-PCR擴(kuò)增[22]，將產(chǎn)物電泳后統(tǒng)計(jì)條帶，計(jì)算大豆根瘤菌5873占瘤率。

2 結(jié)果

2.1 特異引物設(shè)計(jì)及篩選

2.1.1 基因組序列比對及特異引物設(shè)計(jì) 通過對大豆根瘤菌5873和USDA 6T的基因組比較發(fā)現(xiàn)（圖1），大豆根瘤菌5873基因組缺失了51 bp序列，經(jīng)測序和比對，該缺失序列參與編碼YcjX家族蛋白基因。因此，特異引物設(shè)計(jì)采用如下策略，即在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行大豆根瘤菌參比菌株序列比對，找到大豆根瘤菌5873的特異序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，保證其與除大豆根瘤菌USDA 6T之外的菌株有較好的特異性。其次，通過缺失段序列，設(shè)計(jì)特異性引物，以區(qū)分5873與USDA 6T。引物設(shè)計(jì)示意圖見圖2，引物部分結(jié)果如表2所示。

圖1 菌株的序列差異比較

表2 大豆根瘤菌5873的特異序列引物設(shè)計(jì)結(jié)果

圖2 引物設(shè)計(jì)示意圖

2.1.2 特異引物篩選 以大豆根瘤菌5873和上述參比菌株DNA為模板，分別將設(shè)計(jì)的20對特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，供試引物中只有4-4與5873、USDA 6T產(chǎn)生355 bp擴(kuò)增條帶（圖3-A、3-B），表明4-4引物擴(kuò)增的序列與菌株USDA 6T具有高度的同源性，與其他菌株不同源或同源性很低，使用該引物可以將5873和USDA 6T從其他菌株中區(qū)分出來。

為進(jìn)一步區(qū)分，利用引物4-4、Q1及上述兩對混合引物，同時擴(kuò)增高度同源的5873和USDA 6T，以有效慢生根瘤菌USDA 110T為對照，結(jié)果如圖4所示，使用引物4-4時，僅5873和USDA 6T可擴(kuò)增出355 bp左右的條帶；使用引物Q1時，5873可擴(kuò)增出長度為218 bp左右的條帶，而USDA 6T和有效慢生根瘤菌USDA 110T均擴(kuò)增出269 bp左右的條帶。因此，引物4-4和Q1復(fù)合使用，可通過檢測目的條帶的有無（355和218 bp），實(shí)現(xiàn)大豆根瘤菌5873的快速檢測。

A: M: 2-Log ladder marker. 1: B. japonicum 5873; 2: B. japonicum 5841; 3: B. elkanii 5136; 4: B. diazoefficiens 5119; 5-17: B. japonicum 5821, 5129, 4892, 5452, 5599, 5016, 5437, 4129, 4470, 4530, 4438, 5547, 5248; 18: S. fredii 4475; 19: R. alamii 4370; 20-24: B. japonicum 5876, 4784, 5528, 5412, 5260. B: M: 2-Log ladder marker. 1: B. japonicum 5873; 25: B. diazoefficiens USDA 110T; 26: B. japonicum 5665; 27: S. fredii USDA 205T; 28-33: B. japonicum 5588, 4503, 5039, 4248, 5240, 5190; 34-35: B. elkanii 5109, 5161; 36-45: B. japonicum 5742, 4855, 4794, 4291, 4698, 5128, 4770, 4296, 4207, 4543; 46: B. japonicum USDA 6T

1—3：引物為4-4 The primer is 4-4；4—6：引物為Q1 The primer is Q1；7—9：4-4與Q1混合引物The mixed primers of 4-4 and Q1；M：DL1000 ladder marker；1、4、7：B. japonicum 5873；2、5、8：B. japonicum USDA 6T；3、6、9：B. diazoefficiens USDA 110T

2.2 PCR條件/體系優(yōu)化和驗(yàn)證

2.2.1 PCR條件的優(yōu)化 以大豆根瘤菌5873的基因組DNA為模板，建立PCR反應(yīng)體系并進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，DNA模板含量為3—51 ng時均有條帶產(chǎn)生，但添加量為15 ng時條帶開始變亮，所以體系模板DNA需15 ng以上（圖5-A）；在引物濃度為10 μmol·L-1時，添加均有產(chǎn)物形成，在添加1.0 μL時條帶較亮，從成本及引物二聚體問題考慮，選擇添加最適引物量為1.0 μL（圖5-B）；退火溫度在54—61℃均有產(chǎn)物形成，但考慮到較高的退火溫度有利于PCR反應(yīng)的特異性，所以選擇61℃作為最適的退火溫度（圖5-C）。因此，通過優(yōu)化條件，確定4-4引物PCR反應(yīng)的最優(yōu)體系為Premix TaqTM12.5 μL，引物各1.0 μL，基因組DNA 15 ng左右，加ddH2O補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增程序如圖5-D。

M：2-Log ladder Marker。A：不同DNA濃度Different concentrations of DNA templates。1—3：3 ng；4—6：15 ng；7—9：27 ng；10—12：51 ng。B：不同引物濃度Different dosages of primers。1—3：0.5 μL；4—6：1.0 μL；7—9：1.5 μL；10—12：2.0 μL，10 μmol·L-1 of each primer。C：不同退火溫度Different annealing temperatures。1—8：54、55、56、57、58、59、60、61℃。D：最適的擴(kuò)增程序optimized amplification procedure

2.2.2 菌落PCR擴(kuò)增驗(yàn)證 以大豆根瘤菌5873菌液為模板，用引物4-4進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，可擴(kuò)增到355 bp長的特異性片段。由此可以說明，以基因組DNA為模板和以菌懸液為模板均可擴(kuò)增出目的條帶。因此，所建立的PCR快速檢測方法是可行的。

2.2.3 靈敏度檢測 將大豆根瘤菌5873的菌懸液連續(xù)稀釋10倍，以不同稀釋梯度的菌液為模板，以最優(yōu)PCR體系擴(kuò)增。結(jié)果表明，PCR反應(yīng)體系含有超過1 850 CFU/μL時能擴(kuò)增355 bp的特異性條帶。因此，所建立的PCR快速檢測方法的靈敏限度是每微升反應(yīng)體系達(dá)到1 850 CFU以上。

2.2.4 目的條帶驗(yàn)證 以大豆根瘤菌5873的總DNA為模板，進(jìn)行特異PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物純化、連接、轉(zhuǎn)化、篩選后，進(jìn)行測序。其結(jié)果與大豆根瘤菌5873的特異片段相似性為100%。

2.3 特異PCR快速檢測評價(jià)菌株5873競爭結(jié)瘤能力

對生長40 d后的對照組大豆根瘤數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，接種菌株5873的根瘤數(shù)與其他菌株無顯著差異（＞0.05）。應(yīng)用上述建立的特異PCR快速鑒定方法和BOX-PCR，對處理組的大豆根瘤進(jìn)行5873占瘤率的測定，根據(jù)電泳條帶計(jì)算占瘤率，結(jié)果見表3，本研究建立的PCR快速檢測方法和基于BOX-PCR方法測定的大豆根瘤菌5873占瘤率一致，該方法可以成功地評價(jià)菌株5873競爭結(jié)瘤能力，方法可行。

表3 大豆根瘤菌5873占瘤率

3 討論

3.1 慢生大豆根瘤菌檢測和鑒定技術(shù)

慢生根瘤菌屬是大豆種植中應(yīng)用最為廣泛的菌種，起源于熱帶酸性土壤，被認(rèn)為是所有根瘤菌的祖先，由于該屬的菌種組成非常復(fù)雜，涉及各種類型的生態(tài)系統(tǒng)，屬內(nèi)種的確定與分類系統(tǒng)進(jìn)展較為緩慢，分類仍然很復(fù)雜。此外，由于慢生根瘤菌屬16S rRNA基因的高度保守性，只有極少的物種進(jìn)行了明確的鑒定[16]。目前對于慢生大豆根瘤菌的檢測和鑒定，主要依靠傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分析、Biolog生理生化鑒定、保守基因系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析、全基因組測序、平均核苷酸一致性比較、BOX-PCR指紋圖譜分析等多相分類技術(shù)[7-17]。但根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理生化表型等實(shí)驗(yàn)和生物功能特征設(shè)計(jì)檢測方法很難將近源種準(zhǔn)確區(qū)分；而基于16SrDNA、、基因等保守序列的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析方法只能鑒定到種屬水平[18-19]。本研究建立的特異PCR快速檢測技術(shù)是在目標(biāo)菌株全基因組序列的基礎(chǔ)上，根據(jù)菌株特異的堿基序列設(shè)計(jì)引物，并進(jìn)行特異PCR擴(kuò)增。通過目的產(chǎn)物的有無及大小，對目標(biāo)微生物進(jìn)行準(zhǔn)確檢測或鑒定。該技術(shù)具有特異性強(qiáng)、敏感度高、快速靈敏的優(yōu)點(diǎn)，為微生物肥料根瘤菌等生產(chǎn)菌株的快速檢測提供了重要參考。

3.2 特異引物設(shè)計(jì)

特異引物的設(shè)計(jì)是特異PCR技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，常見的特異引物設(shè)計(jì)方法包括：針對研究的特定菌株，從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取較常用的種屬特異基因或功能基因，通過多重序列比對，進(jìn)而確定引物序列[29-30]。例如，Wu等[31]基于基因序列設(shè)計(jì)引物，成功地利用特異引物擴(kuò)增出膠質(zhì)類芽孢桿菌519 bp的保守序列。而本試驗(yàn)并沒有局限于特異基因或功能基因，而是通過對大豆根瘤菌5873的全基因組序列與NCBI中已報(bào)道的大豆根瘤菌菌株序列進(jìn)行全面的篩選與比對，從而實(shí)現(xiàn)在最大范圍內(nèi)檢索菌株5873的特異序列，這樣可有效促進(jìn)特異的非編碼序列被深度挖掘和發(fā)現(xiàn)。在設(shè)計(jì)的20對特異引物中，包含具有功能的編碼基因以及基因間的非編碼序列，本研究篩選的特異引物4-4為非編碼序列。同樣，本課題組王璇等[32]在建立膠質(zhì)類芽孢桿菌PCR快速檢測方法時，也是基于基因間的一段非編碼序列進(jìn)行了特異引物設(shè)計(jì)。由于在物種進(jìn)化的過程中，大多數(shù)的編碼基因具有進(jìn)化保守性，尤其在與近源種進(jìn)行比對分析時，其同源性相對較高。因此，在設(shè)計(jì)種內(nèi)特異引物時，非編碼序列可作為篩選的重要部分。引物設(shè)計(jì)時，其引物的長度一般為18—30 bp，考慮到引物太短會提高錯配率，導(dǎo)致引物缺乏特異性，而引物過長會導(dǎo)致其延伸溫度過高，進(jìn)而影響聚合酶的工作效率等原因，引物設(shè)計(jì)選擇默認(rèn)值20 bp。引物序列的GC含量選擇為40%—60%，過高或過低都會影響PCR反應(yīng)的發(fā)生。此外，為避免產(chǎn)生二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)，兩引物之間不能存在互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，否則會降低引物的有效濃度。根據(jù)以上過程及原則，從16個同源性較低的2 kb的片段中，選擇較好的20對引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，建立快速檢測方法。

3.3 特異PCR方法的建立

雖然特異PCR技術(shù)鑒別大豆根瘤菌菌株的效果明顯，但在建立PCR技術(shù)時，只是盡可能多的對與其相關(guān)的菌株進(jìn)行特異性驗(yàn)證。為提高特異PCR的準(zhǔn)確性，特異性驗(yàn)證時，應(yīng)盡量多地選取近緣菌種作為參比菌株。本研究中，采用軟件OrthoANIu（https://www. ezbiocloud.net/tools/ani）進(jìn)行ANI計(jì)算發(fā)現(xiàn)，大豆根瘤菌5873的全基因組序列與模式菌株大豆根瘤菌USDA 6T的ANI值為99.95%，上述兩株菌親緣關(guān)系很近[33]。引物4-4基本可以區(qū)分大部分的菌株，但遇到與其全基因組極其相近的菌株，還需通過全基因組序列比對等手段，找到其差異并將其區(qū)分。如通過上述兩株菌的全基因組比較發(fā)現(xiàn)了51 bp特異性缺失序列，通過這段序列，設(shè)計(jì)了一段引物，以區(qū)分5873與USDA 6T。后續(xù)的驗(yàn)證中，使用引物Q1擴(kuò)增分別得到長度為218和269 bp的擴(kuò)增條帶，正是缺失片段所致。此外，通過靈敏度試驗(yàn)，確定所建立特異PCR反應(yīng)的靈敏度為1 850 CFU/μL，與其他學(xué)者[31-32]特異PCR的檢測靈敏度相近。本試驗(yàn)建立的PCR快速檢測體系具有較高的敏感性，在較低濃度DNA或者一定濃度的菌體發(fā)酵液或根瘤破碎提取液為模板的體系中，可以方便、快捷檢測大豆根瘤菌5873。

3.4 基于特異PCR技術(shù)評價(jià)菌株競爭結(jié)瘤能力

在應(yīng)用層面，接種的根瘤菌劑能否在田間得到推廣受諸多因素的影響。其中，與根瘤菌-宿主匹配性及根瘤菌在不同理化性質(zhì)的土壤適應(yīng)性相比，根瘤菌的競爭結(jié)瘤能力是限制其應(yīng)用的關(guān)鍵因素[34-35]。通常采用占瘤率來評價(jià)根瘤菌和宿主的匹配性以及菌株競爭結(jié)瘤能力。然而，在測定根瘤菌的占瘤率時，重要的前提是一株根瘤菌侵染形成一個根瘤。在正常情況下，一個根瘤由一個細(xì)胞侵染形成所致，由兩個菌株侵染形成的根瘤（即所謂的“雙侵染根瘤”）概率不到千分之一。此外，很多文獻(xiàn)報(bào)道在計(jì)算根瘤菌占瘤率時，也以一株根瘤菌侵染一個根瘤為前提。傳統(tǒng)方法常借助BOX-PCR指紋圖譜研究接種根瘤菌的占瘤率[24,36]，但需要從根瘤中分離、純化根瘤菌，進(jìn)而進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增等繁瑣的環(huán)節(jié)，其過程費(fèi)時費(fèi)力。本研究建立的特異PCR鑒定技術(shù)，大大減少了傳統(tǒng)技術(shù)中的繁瑣環(huán)節(jié)，實(shí)現(xiàn)了對大豆根瘤菌5873的競爭結(jié)瘤能力快速評價(jià)，且與傳統(tǒng)BOX-PCR檢測結(jié)果一致。

4 結(jié)論

建立了大豆根瘤菌5873菌株的快速檢測方法，利用建立的特異PCR檢測方法可快速、準(zhǔn)確評價(jià)大豆根瘤菌5873競爭結(jié)瘤能力，與傳統(tǒng)BOX-PCR評價(jià)結(jié)果一致。該方法省去了根瘤的分離、根瘤菌分離純化、DNA提取及測序鑒定等繁瑣的環(huán)節(jié)，大大提高了工作效率，可為微生物肥料中根瘤菌劑的產(chǎn)品質(zhì)量檢測、菌種鑒定和功能評價(jià)提供參考。

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Rapid identification for5873 by PCR and its evaluation in application

MA MingChao, JIANG Xin, WANG PengHui, GUAN DaWei, LI Jun

Institute of Agricultural Resources and Agricultural Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081

【Objective】is one of the important functional bacteria in microbial fertilizer products. As a commercialized strain,5873 was wildly used in agricultural production and played important roles in symbiotic nitrogen fixation. Therefore, it isnecessary to establish a rapid identification method at the strain level by screening and identifying specific primers for rhizobia, and is of great importance in the aspects of microbial fertilizer product quality inspection, strain identification and function evaluation.【Method】According to the whole genome sequencing of5873 and other strain related sequences from NCBI, as well as the differential fragments ofUSDA 6Twhich is highly homologous to5873 (the ANI value of the genome is greater than 99.95%), specific PCR primers were designed and obtained. After optimization of PCR reaction conditions and the detection of sensitivity and specificity, a rapid detection method for5873 was established. Then, using pot experiment,5873 was mixed with other rhizobium strains and inoculated in the soybean rhizosphere, and the above method was used to evaluate the competitive nodulation ability of5873.【Result】A set of species-specific primers 4-4 and Q1 (4-4-F 5′-GATAAGGCCACGGGTGAACA-3′/4-4-R 5′-CACTCGATAAGCTCCGCTGT-3′ and Q1-F 5′-CCGGTCGTGACTGGAATGAT-3′/Q1-R 5′-TCGAGGCCTACAAGAACGTC -3′), were successfully designed to selectively amplify 355 and 218 bp amplicon from5873. Well specificity was demonstrated by reference strains, from which only the targeted bands of5873 were observed. Amplifications were performed in a 25 μl reaction mixture, which contained Premix TaqTM12.5 μL, template DNA (15 ng of genomic DNA), primers 4-4 and Q1 (1.0 μL, respectively). The PCR cycling consisted of one cycle of 5 min at 95 ℃and 30 cycles of 45 s at 94 ℃, 45 s at 61 ℃, and 60 s at 72 ℃. A final extension step was run for 10 min at 72 ℃. The sensitivity was 1 850 CFU/μL. In addition, the method mentioned above was successfully used to evaluate the competitive nodulation ability of5873, which was consistent with the results of traditional BOX-PCR identification.【Conclusion】The established rapid detection method can directly use the bacterial solution or squeezed nodules as templates, which will eliminate laborious tasks, such as processes of nodule isolation, purification, culture, DNA extraction, sequencing and sequence comparison. It only takes a few hours to accurately detect5873, which provides a reference for product quality detection and competitive nodulation ability evaluation of microbial fertilizers.

; strain-specific primer pair; PCR amplification; competitive nodulation

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.14.010

2022-11-13；

2022-12-21

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFD1700200）、云南省重大科技專項(xiàng)計(jì)劃（202202AE090025）、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-04）

馬鳴超，E-mail：mamingchao@caas.cn。通信作者姜昕，E-mail：jiangxin@caas.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）