張麗雅，李奇，史珊珊，馬雨夢，劉亞琪，趙超偉，王鶴如，操海群，廖敏，趙寧

稻田稗草對五氟磺草胺的抗性機制及其防治藥劑篩選

張麗雅1，李奇1，史珊珊1，馬雨夢1，劉亞琪1，趙超偉1，王鶴如2，操海群1，廖敏1，趙寧1

1安徽農業(yè)大學植物保護學院/作物有害生物綜合治理安徽省重點實驗室，合肥 230036；2天長市農業(yè)科技中心植保站，安徽天長 239300

【目的】稗草（）是我國水稻田主要惡性雜草之一，五氟磺草胺等乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase，ALS）抑制劑類除草劑是防治稻田稗草的主要除草劑種類。本研究團隊前期在安徽省天長市水稻主產區(qū)發(fā)現疑似五氟磺草胺抗性稗草種群AHTC-01，明確其對稻田不同種類除草劑的抗性水平及可能的抗性分子機制，為抗性稗草有效防治、延緩其抗藥性進一步發(fā)展提供理論依據?！痉椒ā坎捎脺厥遗柙苑ㄔ谡晁缴蠝y定稗草種群AHTC-01對五氟磺草胺的抗性水平及對不同除草劑的抗性模式，并通過靶標基因測序和實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）分析探索其靶標抗性分子機制。【結果】相比敏感稗草種群AHFY-01，疑似抗性稗草種群AHTC-01已對五氟磺草胺產生高水平抗性，抗性倍數（resistance index，RI）為620。靶標抗性機制分析表明，AHTC-01種群基因拷貝2（）第574位氨基酸由色氨酸（Trp）突變?yōu)榱涟彼幔↙eu），其種群突變頻率為100%；在五氟磺草胺處理后12 h，抗性稗草種群AHTC-01相對表達量為敏感稗草種群AHFY-01的2.26倍。AHTC-01同時對其他3種ALS抑制劑類除草劑雙草醚、嘧啶肟草醚、甲氧咪草煙產生不同水平交互抗性，抗性倍數分別為8.24、13.36、20.36；但是對乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACCase）抑制劑氰氟草酯、精噁唑禾草靈和烯草酮，4-羥基苯基丙酮酸雙氧化酶（4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD）抑制劑三唑磺草酮，合成生長素類（synthetic auxin mimic）氯氟吡啶酯等其他作用機制除草劑依舊較為敏感?！窘Y論】稗草種群AHTC-01靶標基因第574位氨基酸突變和過量表達是其對五氟磺草胺產生抗性的主要原因之一，該抗性機制同時賦予其對不同ALS抑制劑的交互抗性。農田生產實際中，可輪換使用其他作用機制除草劑對其進行有效防治。

稗草；五氟磺草胺；乙酰乳酸合成酶；基因突變；基因過量表達；抗性模式

0 引言

【研究意義】稗草（）是世界性惡性禾本科雜草之一，廣泛分布在全球各水稻生產區(qū)[1]。在我國，稗草主要危害水稻（）、玉米（）等秋熟作物，嚴重發(fā)生時可導致顯著減產。有研究表明，9株/m2稗草發(fā)生密度可導致水稻減產57%左右[2-4]。乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase，ALS）抑制劑類除草劑是水稻田常用除草劑類別之一，其主要通過抑制靶標雜草體內ALS活性，影響支鏈氨基酸合成并干擾有絲分裂，進而導致植物死亡[5]。目前，ALS抑制劑類除草劑主要包括5大類別：磺酰脲類（sulfonylurea，SU）、咪唑啉酮類（imidazolinone，IMI）、三唑并嘧啶磺酰胺類（triazolopyrimidine sulfonanilide，TP）、嘧啶硫代苯甲酸酯類（pyrimidinyl thiobenzoate，PTB）、磺酰胺基羰基三唑啉酮類（sulfonylaminocarbonyl- triazolinone，SCT）[6]，其中五氟磺草胺（penoxsulam）是TP類除草劑的典型代表[7]，其于2008年在我國首次登記，主要用于水稻田防除稗草、莎草和闊葉類等一年生惡性雜草。然而已有研究表明，作用位點單一的除草劑長期、頻繁、超量使用極易誘導雜草產生抗性[8]。在其登記過后僅7年，王瓊等就報道采集自黑龍江、安徽、江蘇、寧夏等地水稻田的稗草種群對五氟磺草胺產生了不同水平的抗性[9]，隨后我國水稻主產區(qū)五氟磺草胺抗性稗草案例頻發(fā)[10-17]，給水稻安全生產構成嚴重威脅。明確稗草抗性發(fā)展情況及其內在抗性分子機制，對于科學防治抗性稗草以及緩解稗草抗性發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】靶標抗性（target-site based resistance，TSR）和非靶標抗性（non-target-site based resistance，NTSR）是雜草對除草劑產生抗性的兩個主要機制[18]。靶標抗性主要涉及靶標基因突變和過量表達，二者分別通過改變靶標蛋白構象或者增加靶標蛋白含量而賦予雜草對除草劑的抗性[19]。目前已證實，不同雜草物種存在Domain A—E 5個高度保守區(qū)，其中在與ALS抑制劑結合過程中，有8個具有關鍵作用的氨基酸位點可能發(fā)生突變，分別為Ala122、Pro197、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653和Gly654，而且這些氨基酸位點的突變通常導致雜草對同一作用機制的藥劑產生交互抗性[20]。針對ALS抗性稗草，多數案例是由于靶標基因一個或者多個決定ALS蛋白構象的關鍵氨基酸發(fā)生了非同義突變[21]。此外，靶標基因過量表達也是某些雜草產生ALS抗性的分子機制之一。比如，Sen等[22]發(fā)現過量表達可能是貧育雀麥（）對啶磺草胺產生抗性的原因之一，Zhao等[23]也報道了抗甲基二磺隆的看麥娘（）發(fā)生過量表達。黃啟超等[24]發(fā)現抗性稗草種群18-WJJ-Ec表達量是敏感稗草種群18-NJ的8.72倍，進而推測過量表達參與了稗草的抗藥性表型。相比之下，非靶標抗性則幾乎包括所有可以影響除草劑到達靶標作用位點的機制，比如減少對除草劑吸收或轉運、增加對除草劑屏蔽和隔離、增強對除草劑解毒代謝等[25]。其中，代謝抗性也是多種雜草對ALS抑制劑類除草劑產生抗性的主要原因之一，其一般會賦予雜草不可預測的除草劑抗性模式。研究表明代謝抗性是多個超基因家族協同作用的結果，通常涉及到幾個主要的除草劑解毒酶家族，如細胞色素P450單加氧酶系（cytochrome P450 monooxygenases，CytP450s）、谷胱甘肽S-轉移酶系（glutathione S-transferases，GSTs）、UDP-糖基轉移酶系（UDP-glucosyltransferases，UDP-GTs）和ABC轉運體（ATP-binding cassette transporters，ABC transporters）等，其中某些能夠賦予雜草抗藥性的關鍵基因近年來也得到鑒定，比如CYP81A家族基因廣泛參與稗草、菵草（）等多種雜草對不同除草劑的代謝抗性等[26-27]。稗草P450s活性增強參與針對ALS抑制劑抗性的案例也在逐年增加[28-29]?！颈狙芯壳腥朦c】安徽省是我國長江中下游水稻主產省份之一。前期田間調查表明，該省各地市水稻田稗草、千金子（）等禾本科雜草發(fā)生較為嚴重[30-31]，其中安徽省天長市等地區(qū)農戶近年來普遍反映，五氟磺草胺等稻田常用除草劑在大田推薦劑量下防治效果較差，推測稗草等雜草已經對其產生了抗藥性。2020年10月，本課題組于該地區(qū)水稻田采集到一個稗草疑似抗性種群AHTC-01，然而其具體抗性發(fā)生情況以及內在抗性機制如何，目前尚不清楚。【擬解決的關鍵問題】針對AHTC-01稗草種群，首先采用整株生物測定明確該種群對五氟磺草胺的敏感性和抗性水平，隨后探索其潛在的靶標抗性分子機理，同時測定目標抗性機制所賦予該種群的交互抗性模式，以及其對不同作用機制除草劑的敏感性和抗性水平。預期研究結果將明確AHTC-01稗草種群對五氟磺草胺的抗性水平和靶標抗性分子機制，同時篩選可用于防治該稗草種群的有效藥劑，為抗性稗草科學防治、延緩其抗藥性發(fā)展提供依據。

1 材料與方法

1.1 雜草種子采集

2020年10月，于安徽省天長市萬壽鎮(zhèn)石莊村水稻田（119.09°E，32.73°N）采集到疑似抗五氟磺草胺稗草種群AHTC-01，據當地農戶反映，該田塊已連續(xù)至少10年使用ALS抑制劑五氟磺草胺防除稗草、千金子等惡性雜草，且種子采集當季以大田推薦劑量（30 g a.i.·hm-2）于水稻苗后早期、稗草3葉期左右施用過五氟磺草胺；同期于安徽省滁州市鳳陽縣趙家圩子村非耕地（117.68°E，32.83°N）采集到敏感稗草種群AHFY-01，該地塊近20年來未使用過任何除草劑。各種群種子均隨機采集自至少200株稗草成熟穗，于室溫下風干后分別裝入牛皮紙袋，保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 藥劑、試劑及儀器

主要供試藥劑：25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑（OD）、30%氰氟草酯（cyhalofop-butyl）乳油（EC）、3%氯氟吡啶酯（florpyrauxifen-benzyl）EC，美國陶氏益農公司；69 g·L-1精噁唑禾草靈（fenoxaprop-- ethyl）水乳劑（EW），拜耳作物科學（中國）有限公司；4%甲氧咪草煙（imazamox）水劑（AS）、240 g·L-1烯草酮（clethodim）EC，山東奧坤作物科學股份有限公司；10%雙草醚（bispyribac-sodium）懸浮劑（SC），安徽久易農業(yè)股份有限公司；5%嘧啶肟草醚（pyribenzoxim）微乳劑（ME），山東青島奧迪斯生物科技有限公司；6%三唑磺草酮（tripyrasulfone）OD，江蘇清原農冠雜草防治有限公司。

主要供試試劑：Nuclean Plant Genomic DNA Kit、HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit，北京康為世紀生物科技股份有限公司；ChamQ SYBR qPCR Master Mix、DNA凝膠回收試劑盒，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Quick RNA Isolation RNA Kit，北京華越洋生物科技有限公司；LA Taq DNA Polymerase with GC Buffer，北京寶日醫(yī)生物技術有限公司。

主要供試儀器：BIC-400型人工氣候箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；FA/B系列萬分之一天平，上海越平科學儀器（蘇州）制造有限公司；3WP-2000型行走式噴霧塔，農業(yè)農村部南京農業(yè)機械化研究所；T100型梯度PCR儀，美國Bio-Rad公司；ERS 200型電泳儀，北京原平皓生物技術有限公司；ZF-288型凝膠成像分析系統(tǒng)，上海金鵬分析儀器有限公司；Nanodrop 2000型分光光度計，美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 稗草對五氟磺草胺的敏感性和抗性水平測定 參照《農藥室內生物測定試驗準則除草劑第4部分：活性測定試驗莖葉噴霧法》（NY/T 1155.4—2006）進行，種子催芽和植株培養(yǎng)[30]后采用五氟磺草胺大田推薦劑量初篩進行預試驗（數據未展示），據此設定其梯度施藥劑量，以清水處理作為空白對照（表1）。使用3WP-2000型行走式噴霧塔進行莖葉噴霧處理，噴霧時扇形噴頭距離稗草葉片約50 cm，噴液壓力0.275 mPa，噴液量450 L·hm-2。施藥后繼續(xù)培養(yǎng)3周，第21天時稱量植株地上部鮮重。每個處理至少重復3次，整個試驗重復2次。

表1 整株劑量響應試驗所用除草劑處理詳細信息

本研究所使用各除草劑田間推薦劑量以粗體顯示，其中五氟磺草胺田間推薦劑量為30 g a.i.·hm-2

The field-recommended doses for each herbicide used in this study are marked in bold, among which the field-recommended dose for penoxsulam is 30 g a.i.·hm-2

1.3.2 稗草靶標基因序列擴增和比對 DNA提取和引物信息：稗草種子萌發(fā)和生長條件同1.3.1。待稗草生長至3—4葉期，分別于抗性、敏感種群中隨機選擇10個單株，每株剪取約50 mg幼嫩葉片組織，采用Nuclean Plant Genomic DNA Kit提取其基因組DNA（genomic DNA，gDNA），具體操作步驟參照試劑盒說明書進行，最終樣品保存于-20 ℃冰箱備用。稗草具有3個拷貝（、、），參照Iwakami等[32]報道的3對引物分別擴增每個拷貝全長序列，所得序列均包含目前已報道的8個突變位點，各引物均由南京擎科生物科技有限公司進行合成。

序列擴增和比對：以不同種群稗草單株gDNA為模板，采用 LA Taq DNA Polymerase with GC Buffer進行PCR擴增。PCR反應體系：LA Taq 0.5 μL、2×GC Buffer I 25 μL、dNTP Mixture 8 μL，Forward Primer 1 μL、Reverse Primer 1 μL、gDNA 2 μL、ddH2O 12.5 μL。參照試劑盒說明書設置PCR循環(huán)條件，其中退火溫度為59 ℃，待反應結束后，于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，切取目標條帶并采用DNA凝膠回收試劑盒進行回收，送至南京擎科生物科技有限公司測序。以擬南芥（）（GenBank登錄號：AJ310767）氨基酸序列全長為基準，使用DNAMAN v6.0（Lynnon Biosoft，Montreal，QC，Canada）軟件對不同稗草種群測序結果進行比對。

1.3.3 稗草相對表達差異分析 RNA提取和cDNA合成：稗草種子萌發(fā)和生長條件同1.3.1。待抗性、敏感稗草植株生長至3—4葉期，同時以田間推薦劑量（30 g a.i.·hm-2）噴施五氟磺草胺。施藥前0 h和施藥后12、24、48 h分別剪取各植株幼嫩葉片組織，采用Quick RNA Isolation RNA Kit提取其RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳測定RNA質量，采用Nanodrop 2000型分光光度計測定RNA濃度，保存于-80 ℃冰箱備用。使用HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit合成互補DNA（complementary DNA，cDNA），用于相對表達量分析。及內參基因引物參照Fang等[29]的報道，由南京擎科生物科技有限公司進行合成。

相對表達量測定：以五氟磺草胺處理前后不同時間點的稗草葉片cDNA為模板，采用ChamQ SYBR qPCR Master Mix進行實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）分析，具體PCR體系和循環(huán)條件均參照試劑盒說明書進行。以稗草作為內參基因對表達進行歸一化，采用2-ΔΔCT法計算在不同時間點的相對表達量。在本研究中，每個時間點樣品包含6個生物學重復（1株/重復），各生物學重復同時包括3個技術重復。采用SPSS v.26.0（IBM，Armonk，NY，USA）軟件一般線性模型對試驗數據進行ANOVA分析，當fold change＞2且＜0.05時判定為具有顯著差異。

1.3.4 稗草抗性種群交互抗性和多抗性模式測定 稗草種子萌發(fā)和生長條件同1.3.1。待抗性、敏感稗草植株生長至3—4葉期，采用溫室盆栽法在整株水平上分別測定其對3種ALS抑制劑、3種乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACCase）抑制劑、1種4-羥基苯基丙酮酸雙氧化酶（4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD）抑制劑、1種合成生長素類除草劑（synthetic auxin mimic）的抗性水平（表1）。采用各除草劑大田推薦劑量初篩進行預試驗（結果未展示），以明確其具體施用劑量（表1）。莖葉噴霧處理方式和結果調查方法均同1.3.1。每個處理至少重復3次，整個試驗重復2次。

1.3.5 數據處理 針對所有整株劑量響應試驗，以清水處理為空白對照，將各處理鮮重數據表示為空白對照相對鮮重（%）。使用SPSS v.26.0（IBM，Armonk，NY，USA）對重復試驗間相同處理下的數據進行ANOVA分析，由于兩組數據間無顯著差異（＞0.05），采用SigmaPlot v.12.3（Systat Software，Chicago，IL，USA）按照公式=+{(-)/[1+(/GR50)]^}對合并后的數據進行四參數雙邏輯非線性回歸分析，計算抑制50%植物生長所需除草劑劑量（GR50）。式中，為特定除草劑用量，為處理下雜草相對鮮重，為響應下限，為響應上限，為GR50處曲線斜率。

以敏感稗草種群AHFY-01為對照，計算抗性稗草種群AHTC-01對不同除草劑的抗性倍數（resistance index，RI）：RI=抗性種群GR50/敏感種群GR50。根據以下標準對種群的抗藥性水平進行分級：RI≥10，高抗；5≤RI＜10，中抗；2≤RI＜5，低抗；RI＜2，敏感[33]。

2 結果

2.1 不同稗草種群對五氟磺草胺的抗性水平

五氟磺草胺田間推薦劑量（30 g a.i.·hm-2）處理后，疑似抗性稗草種群AHTC-01各植株仍然存活，其GR50為155.00 g a.i.·hm-2；敏感稗草種群AHFY-01各植株均枯萎死亡，其GR50為0.25 g a.i.·hm-2。相比AHFY-01，AHTC-01稗草種群已對五氟磺草胺產生高水平抗性，抗性倍數為620（表2）。

表2 不同稗草種群對五氟磺草胺的抗性水平

2.2 稗草抗性和敏感種群ALS基因序列差異

序列比對結果顯示，AHFY-01種群各單株、、均未發(fā)生氨基酸突變，而AHTC-01種群各單株第574位氨基酸密碼子均由色氨酸（TGG）突變?yōu)榱涟彼幔═TG）（圖1），其余位點均未發(fā)生突變（表3），種群單株抗性突變頻率為100%。

2.3 稗草抗性和敏感種群ALS表達差異

以五氟磺草胺田間推薦劑量（30 g a.i.·hm-2）分別對稗草種群AHTC-01和AHFY-01進行莖葉處理，通過RT-qPCR分析相對表達量。結果表明在五氟磺草胺處理前（0 h）和處理后12、24、48 h，相對于敏感稗草種群AHFY-01，抗性稗草種群AHTC-01在各時間點的相對表達倍數分別為0.24、2.26、0.71、0.87（圖2）。AHTC-01稗草種群在藥劑處理后12 h時相對表達量為敏感種群AHFY-01的2.26倍，說明靶標基因過量表達可能是其對五氟磺草胺產生抗性的分子機制之一。

圖1 稗草敏感（AHFY-01，左）和抗性（AHTC-01，右）種群靶標基因ALS2的Trp574位密碼子

表3 稗草敏感和抗性種群ALS2序列比對

粗體表示已知可以發(fā)生抗性氨基酸的突變位點；下劃線表示該種群在該位點發(fā)生氨基酸替換

All known mutation sites inare shown in bold; amino acid substitutions in specific sites are underlined

圖2 稗草抗性種群ALS在五氟磺草胺處理前后相對于敏感種群的表達倍數

2.4 稗草抗性種群對其他除草劑的敏感性

整株劑量響應試驗表明，稗草種群AHFY-01對所測試的8種除草劑同樣較為敏感，其植株在各藥劑田間劑量處理下均枯萎死亡（圖3）。相比之下，抗五氟磺草胺稗草種群AHTC-01對其他3種ALS抑制劑產生交互抗性，其中對雙草醚產生中等水平抗性，抗性倍數為8.24；對嘧啶肟草醚、甲氧咪草煙均產生高水平抗性，抗性倍數分別為13.36、20.36（表4）。

同時選用其他3種作用機制的5種除草劑對抗性稗草種群AHTC-01進行多抗性模式測定，結果表明AHTC-01稗草種群對ACCase抑制劑氰氟草酯、精噁唑禾草靈、烯草酮，HPPD抑制劑三唑磺草酮，以及合成生長素類除草劑氯氟吡啶酯均較為敏感（圖3），其抗性倍數均低于2.00（表4）。

圖3 稗草抗性（AHTC-01）和敏感（AHFY-01）種群相對鮮重對不同除草劑的劑量響應曲線

表4 稗草抗性種群AHTC-01對其他除草劑的抗性水平

3 討論

3.1 水稻田稗草對五氟磺草胺的抗性

目前我國東北、長江中下游、華南等水稻主產區(qū)均有五氟磺草胺抗性稗草案例發(fā)生[16,34-35]。已有研究表明，作用機制單一的除草劑長期、頻繁、超量使用容易誘導雜草產生抗藥性[8]，而ALS抑制劑類除草劑至少連續(xù)使用10次即可誘導雜草產生抗性[33]。截至2023年4月，全球已有至少171種雜草對ALS抑制劑類除草劑產生抗性，這些抗性雜草廣泛分布于72個國家的97種作物田中[20]。本研究整株劑量響應試驗表明，采集自安徽省天長市水稻田的稗草種群AHTC-01已對五氟磺草胺產生約620倍的高水平抗性。據前期田間調查，該種群所在田塊五氟磺草胺已經連續(xù)使用超過10年，這再一次印證單一除草劑連續(xù)重復使用可以誘導雜草的抗藥性發(fā)展。

3.2 稗草對五氟磺草胺的靶標抗性機理

靶標基因突變是雜草對除草劑產生抗性的主要靶標分子機制之一[19]。針對ALS抑制類除草劑，靶標基因關鍵氨基酸位點突變以后可以改變ALS構象，進而影響除草劑與之結合[5]。目前，已經報道了8個基因突變位點，每個位點發(fā)生的不同氨基酸替換形式均有可能導致雜草對不同ALS抑制劑產生抗性。其中，Pro197位點在不同ALS抗性雜草中突變頻率最高，其次是Trp574位點和Ser653位點[36]。比如，Pro197位點發(fā)生5種突變形式和Trp574位點Leu突變是硬直黑麥草（）對甲嘧磺隆和咪唑乙煙酸產生抗性的主要原因之一[37]；Trp574位點Leu突變可以賦予薺菜（）對苯磺隆的高水平抗性[38]，也可以導致反枝莧（）對煙嘧磺隆產生抗性[39]。在本研究中，稗草種群AHTC-01所檢測的10個單株拷貝Trp574位點均發(fā)生了Leu突變，表明第574位突變是AHTC-01稗草種群對五氟磺草胺產生高水平抗性的重要靶標分子機制之一。

靶標基因過量表達也能夠導致雜草對除草劑產生靶標抗性。以往研究表明，該類抗性機制通常導致雜草對草甘膦等滅生性除草劑產生靶標抗性[40-41]。然而目前已有研究證實，靶標基因過量表達也可以導致雜草對選擇性除草劑產生抗性[42]。例如，Sen等報道過表達是貧育雀麥對啶磺草胺產生抗性的原因之一[22]，Zhao等在抗甲基二磺隆的看麥娘中也鑒定到過量表達[23]。本研究中，在五氟磺草胺處理后12 h，抗性稗草種群AHTC-01相對表達量為敏感稗草種群AHFY-01的2.26倍，表明過量表達可能是AHTC-01稗草種群對五氟磺草胺產生抗性的另一主要原因。目前，僅有少數案例報道過量表達可能參與了稗草對ALS抑制劑類除草劑的抗性[24]，本研究結果進一步印證了該觀點。

3.3 稗草靶標基因變化導致的交互抗性模式

據報道，雜草基因Ala122、Ser653和Gly654位點發(fā)生突變后一般會對SU和IMI類除草劑產生交互抗性，Pro197位點突變以后則通常對SU和TP類除草劑產生抗性，而Ala205、Asp376和Trp574位點突變會導致雜草對ALS抑制劑5種類別除草劑均產生抗性，不過具體交互抗性模式會受到雜草種類、種群用藥歷史以及靶標基因是否發(fā)生過量表達等因素影響[19,33]。比如，麥田雜草麥家公（）和播娘蒿（）發(fā)生Trp574Leu突變以后，均能夠對SU、TP、SCT、IMI和PTB產生廣譜交互抗性[43-44]；小飛蓬（）發(fā)生Pro197Ala突變以后僅對SU類除草劑產生抗性[45]，而攜帶Pro197Ala突變的看麥娘則對ALS抑制劑不同類別除草劑產生廣譜抗性[46]。本研究中，稗草種群AHTC-01各植株均發(fā)生了Trp574Leu突變，并且對所測試的3種ALS抑制劑雙草醚、嘧啶肟草醚、甲氧咪草煙均產生了中高水平交互抗性，這與相關研究結果相似[15]。Trp574位點突變能夠對ALS構象產生較為顯著的影響，進而容易導致雜草對ALS抑制劑類除草劑產生廣譜交互抗性[5]。

3.4 ALS抗性稗草的科學防治

水稻作為半數以上世界人口的重要糧食作物，其穩(wěn)收穩(wěn)產關系重大。雜草是影響水稻產量的重要威脅因素之一，其中稗草危害尤為突出。本研究采集到的抗性稗草種群AHTC-01對測定的其他3種ALS抑制劑均產生了中高水平抗性，說明目前水稻田常用ALS抑制劑類除草劑已經不能有效防除該類抗性稗草。為了篩選有效的抗性稗草防治藥劑，本研究選用ACCase抑制劑、HPPD抑制劑、合成激素類3種作用機制的5種除草劑，對抗性稗草種群AHTC-01進行敏感性測定。結果表明，AHTC-01稗草種群對上述5種除草劑均較為敏感。因此在水稻生產中，可以選用ACCase抑制劑氰氟草酯、HPPD抑制劑三唑磺草酮、激素類除草劑氯氟吡啶酯進行藥劑復配或輪換使用，以實現對具有ALS抑制劑類除草劑交互抗性機制稗草的科學有效防除。結合土地深翻耕、作物輪作等農業(yè)措施，進一步延緩稗草抗藥性的產生和發(fā)展[47-48]。

4 結論

采集自安徽省天長市水稻田疑似抗性稗草種群AHTC-01已對ALS抑制劑類除草劑五氟磺草胺產生了高達620倍的抗性，且對其他3種ALS抑制劑類除草劑產生了中高水平交互抗性。靶標基因Trp574位Leu突變和過量表達是該稗草種群對五氟磺草胺產生高水平抗性的重要分子機制之一。針對基因突變導致的抗性稗草，應盡量選擇對水稻較為安全的其他作用機制除草劑，如氰氟草酯、三唑磺草酮、氯氟吡啶酯等進行科學輪換使用，實現對抗性稗草的科學治理，延緩稗草抗藥性發(fā)展。

[1] GUO L, QIU J, YE C. Jin G, Mao L, Zhang H, Yang X, Peng Q, Wang Y, Jia L,.genome analysis provides insight into its adaptation and invasiveness as a weed.Nature Communications, 2017, 8(1): 1031.

[2] MAUN M A, BARRETT S C H. The biology of Canadian weeds. 77.(L.) Beauv. Canadian Journal of Plant Science, 1986, 66(3): 739-759.

[3] BAJWA A A, JABRAN K, SHAHID M, ALI H H, CHAUHAN B S. Eco-biology and management of. Crop Protection, 2015, 75: 151-162.

[4] CHAUHAN B S, JOHNSON D E. Implications of narrow crop row spacing and delayedandemergence for weed growth and crop yield loss in aerobic rice. Field Crops Research, 2010, 117(2/3): 177-182.

[5] LONHIENNE T, CHENG Y, GARCIA M D, HU S H, LOW Y S, SCHENK G, WILLIAMS C M, GUDDAT L W. Structural basis of resistance to herbicides that target acetohydroxyacid synthase. Nature Communications, 2022, 13(1): 3368.

[6] MCCOURT J A, PANG S S, KING-SCOTT J, GUDDAT L W, DUGGLEBY R G. Herbicide-binding sites revealed in the structure of plant acetohydroxyacid synthase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2006, 103(3): 569-573.

[7] JABUSCH T W, TJEERDEMA R S. Partitioning of penoxsulam, a new sulfonamide herbicide. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(18): 7179-7183.

[8] NORSWORTHY J K, WARD S M, SHAW D R, LLEWELLYN R S, NICHOLS R L, WEBSTER T M, Bradley K W, FRISVOLD G, POWLES S B, BURGOS N R, WITT W W, BARRETT M. Reducing the risks of herbicide resistance: best management practices and recommendations. Weed Science, 2012,60(SP1): 31-62.

[9] 王瓊, 陳國奇, 姜英, 王慶亞, 姚振威, 董立堯. 水稻田稗屬 (spp.) 雜草對稻田常用除草劑的敏感性. 南京農業(yè)大學學報, 2015, 38(5): 804-809.

WANG Q, CHEN G Q, JIANG Y, WANG Q Y, YAO Z W, DONG L Y. Sensitivity ofspecies to frequently used herbicides in paddy rice field. Journal of Nanjing Agricultural University, 2015, 38(5): 804-809. (in Chinese)

[10] 王曉琳, 牛利川, 蔣翊宸, 張卓亞, 李貴. 不同稗草種群對五氟磺草胺的敏感性差異. 雜草學報, 2017, 35(1): 8-14.

WANG X L, NIU L C, JIANG Y C, ZHANG Z Y, Li G. The sensitivity of different-populations to penoxsulam. Journal of Weed Science, 2017, 35(1): 8-14. (in Chinese)

[11] 仵奎. 硬稃稗 ()對五氟磺草胺的抗藥性機理研究[D]. 南京: 南京農業(yè)大學, 2017.

WU K. Study on resistance ofto penoxsulam[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2017. (in Chinese)

[12] FANG J P, YANG D C, ZHAO Z R, CHEN J Y, DONG L Y. A novel Phe-206-Leu mutation in acetolactate synthase confers resistance to penoxsulam in barnyardgrass (-(L.) P. Beauv). Pest Management Science, 2022, 78(6): 2560-2570.

[13] CHEN G Q, WANG Q, YAO Z W, ZHU L F, DONG L Y. Penoxsulam-resistant barnyardgrass (-) in rice fields in China. Weed Biology and Management, 2016, 16(1): 16-23.

[14] CHEN G Q, ZHANG W, FANG J P, DONG L Y. Identification of massive molecular markers inusing a restriction-site associated DNA approach. Plant Diversity, 2017, 39(5): 287-293.

[15] FENG T Q, PENG Q, WANG L, XIE Y, OUYANG K, LI F, ZHOU H Z, MA H J. Multiple resistance mechanisms to penoxsulam infrom China. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2022, 187: 105211.

[16] 馬國蘭, 劉都才, 張帥, 李新文, 劉雪源, 彭亞軍, 李巳夫, 柏連陽. 稻田稗屬雜草田間種群對五氟磺草胺的抗性監(jiān)測. 農藥學學報, 2021, 23(5): 905-914.

MA G L, LIU D C, ZHANG S, LI X W, LIU X Y, PENG Y J, LI S F, BAI L Y. Resistance detection of field populations ofspp. to penoxsulam. Chinese Journal of Pesticide Science, 2021, 23(5): 905-914. (in Chinese)

[17] 劉慶虎, 陳國奇, 張玉華, 孫仲華, 董立堯. 不同葉齡千金子、稗和馬唐對氰氟草酯和五氟磺草胺的敏感性. 南京農業(yè)大學學報, 2016, 39(5): 771-776.

LIU Q H, CHEN G Q, ZHANG Y H, SUN Z H, DONG L Y. Sensitivities of,andat different leaf stages to cyhalofop-butyl and penoxsulam. Journal of Nanjing Agricultural University, 2016, 39(5): 771-776. (in Chinese)

[18] GAINES T A, DUKE S O, MORRAN S, RIGON C A, TRANEL P J, KüPPER A, DAYAN F E. Mechanisms of evolved herbicide resistance. Journal of Biological Chemistry, 2020, 295(30): 10307-10330.

[19] POWLES S B, YU Q. Evolution in action: plants resistant to herbicides. Annual Review of Plant Biology, 2010, 61: 317-347.

[20] HEAP I. The International Herbicide-Resistant Weed Database. http:// www.weedscience.org.

[21] TRANEL P J, WRIGHT T R. Resistance of weeds to ALS-inhibiting herbicides: what have we learned?. Weed Science, 2002, 50(6): 700-712.

[22] SEN M K, HAMOUZOVá K, MIKULKA J, BHARATI R, KO?NAROVá P, HAMOUZ P, ROY A, SOUKUP J. Enhanced metabolism and target gene overexpression confer resistance against acetolactate synthase-inhibiting herbicides in. Pest Management Science, 2021, 77(4): 2122-2128.

[23] ZHAO N, YAN Y Y, WANG H Z, BAI S, WANG Q, LIU W T, WANG J X. Acetolactate synthase overexpression in mesosulfuron- methyl-resistant shortawn foxtail (Sobol.): Reference gene selection and herbicide target gene expression analysis. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2018, 66(37): 9624-9634.

[24] 黃啟超, 顧瓊楠, 褚世海, 陳安安, 李林, 李儒海, 孫正祥. 稗18-WJJ-Ec種群對五氟磺草胺的靶標抗性機制. 江蘇農業(yè)科學, 2022, 50(19): 104-110.

HUANG Q C, GU Q N, CHU S H, CHEN A A, LI L, LI R H, SUN Z X. Target-site resistance mechanism of barnyardgrass () population 18-WJJ-Ec to penoxsulam. Jiangsu Agricultural Sciences, 2022, 50(19): 104-110. (in Chinese)

[25] RIGON C A, GAINES T A, KüPPER A, DAYAN F E. Metabolism- based herbicide resistance, the major threat among the non-target site resistance mechanisms. Outlooks on Pest Management, 2020, 31(4): 162-168.

[26] DIMAANO N G, IWAKAMI S. Cytochrome P450-mediated herbicide metabolism in plants: current understanding and prospects. Pest Management Science, 2021, 77(1): 22-32.

[27] PAN L, GUO Q S, WANG J Z, SHI L, YANG X, ZHOU Y Y, YU Q, BAI L Y. CYP81A68 confers metabolic resistance to ALS and ACCase-inhibiting herbicides and its epigenetic regulation in. Journal of Hazardous Materials, 2022, 428: 128225.

[28] YAN B, ZHANG Y H, LI J, FANG J P, LIU T T, DONG L Y. Transcriptome profiling to identify cytochrome P450 genes involved in penoxsulam resistance in. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2019, 158: 112-120.

[29] FANG J P, ZHANG Y H, LIU T T, YAN B J, LI J, DONG L Y. Target-site and metabolic resistance mechanisms to penoxsulam in barnyardgrass ((L.) P. Beauv). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2019, 67(29): 8085-8095.

[30] LI Q, ZHAO N, JIANG M H, WANG M L, Zhang J X, Cao H Q, LIAO M. Metamifop resistance invia glutathione S-transferases-involved enhanced metabolism. Pest Management Science, 2023, doi: 10.1002/ps.7453.

[31] JIANG M H, WANG Y F, LI W, LI Q, ZHANG J X, LIAO M, ZHAO N, CAO H Q. Investigating resistance levels to cyhalofop-butyl and mechanisms involved in Chinese sprangletop (L.) from Anhui Province, China. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2022, 186: 105165.

[32] IWAKAMI S, HASHIMOTO M, MATSUSHIMA K I, WATANABE H, HAMAMURA K, UCHINO A. Multiple-herbicide resistance invar., an allohexaploid weed species, in dry-seeded rice. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2015, 119: 1-8.

[33] BECKIE H J, TARDIF F J. Herbicide cross resistance in weeds. Crop Protection, 2012, 35: 15-28.

[34] 郭文磊, 馮莉, 張純, 張?zhí)﹦? 吳丹丹, 田興山. 廣東省水稻田稗對五氟磺草胺的抗性分析. 植物保護學報, 2020, 47(5): 1131-1138.

GUO W L, FENG L, ZHANG C, ZHANG T J, WU D D, TIAN X S. Resistance of barnyard grassto penoxsulam in rice fields in Guangdong Province. Journal of Plant Protection, 2020, 47(5): 1131-1138. (in Chinese)

[35] LIU J, FANG J P, HE Z Z, LI J, DONG L Y. Target site-based resistance to penoxsulam in late watergrass () from China. Weed Science, 2019, 67(4): 380-388.

[36] NTOANIDOU S, MADESIS P, DIAMANTIDIS G, ELEFTHEROHORINOS I. Trp574 substitution in the acetolactate synthase ofconfers cross-resistance to tribenuron and imazamox. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2017, 142: 9-14.

[37] YU Q, HAN H, Powles S B. Mutations of thegene endowing resistance to ALS-inhibiting herbicides inpopulations. Pest Management Science, 2008, 64(12): 1229-1236.

[38] 張樂樂, 郭文磊, 李偉, 趙寧, 劉偉堂, 王金信. 薺菜對乙酰乳酸合成酶抑制劑類除草劑的抗性水平及其分子機制. 農藥學學報, 2016, 18(6): 717-723.

ZHANG L L, GUO W L, LI W, ZHAO N, LIU W T, WANG J X. Resistance to acetolactate synthase-inhibiting herbicides inand its molecular resistance mechanism. Chinese Journal of Pesticide Science, 2016, 18(6): 717-723. (in Chinese)

[39] HUANG Z F, HUANG H J, CHEN J Y, CHEN J C, WEI S H, ZHANG C X. Nicosulfuron-resistantL. in Northeast China. Crop Protection, 2019, 122: 79-83.

[40] SALAS R A, DAYAN F E, PAN Z Q, WATSON S B, DICKSON J W, SCOTT R C, BURGOS N R.gene amplification in glyphosate-resistant Italian ryegrass (ssp.) from Arkansas. Pest Management Science, 2012, 68(9): 1223-1230.

[41] LORENTZ L, GAINES T A, NISSEN S J, WESTRA P, STREK H J, DEHNE H W, RUIZ-SANTAELLA J P, BEFFA R. Characterization of glyphosate resistance inpopulations. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62(32): 8134-8142.

[42] TRANEL P J. Herbicide-resistance mechanisms: gene amplification is not just for glyphosate. Pest Management Science, 2017, 73(11): 2225-2226.

[43] WANG Q, GE L A, ZHAO N, ZHANG L L, YOU L D, WANG D D, LIU W T, WANG J X. A Trp-574-Leu mutation in the acetolactate synthase (ALS) gene ofL. confers broad-spectrum resistance to ALS inhibitors. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2019, 158: 12-17.

[44] DENG W, YANG Q, ZHANG Y Z, JIAO H T, MEI Y, LI X F, ZHENG M Q. Cross-resistance patterns to acetolactate synthase (ALS)-inhibiting herbicides of flixweed (L.) conferred by different combinations of ALS isozymes with a Pro-197-Thr mutation or a novel Trp-574-Leu mutation. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2017, 136: 41-45.

[45] ZHENG D, KRUGER G R, SINGH S, DAVIS V M, TRANEL P J, WELLER S C, JOHNSON W G. Cross-resistance of horseweed () populations with three differentmutations. Pest Management Science, 2011, 67(12): 1486-1492.

[46] TANG Z, WANG Z L, WANG M L, YIN F, LIAO M, CAO H Q, ZHAO N. Molecular mechanism of resistance to mesosulfuron-methyl in shortawn foxtail () from China. Weed Science, 2023, doi: 10.1017/wsc.2023.23.

[47] COLBACH N, CHAUVEL B, DARMENCY H, DELYE C, LE CORRE V. Choosing the best cropping systems to target pleiotropic effects when managing single-gene herbicide resistance in grass weeds. A blackgrass simulation study. Pest Management Science, 2016, 72(10): 1910-1925.

[48] OSIPITAN O A, DILLE J A, ASSEFA Y, RADICETTI E, AYENI A, KNEZEVIC S Z. Impact of cover crop management on level of weed suppression: a meta-analysis. Crop Science, 2019, 59(3): 833-842.

Resistance Mechanism of Barnyard Grass () to Penoxsulam and Screening Herbicides for Its Control in Rice Fields

ZHANG LiYa1, LI Qi1, SHI ShanShan1, MA YuMeng1, LIU YaQi1, ZHAO ChaoWei1, WANG HeRu2, CAO HaiQun1, LIAO Min1, ZHAO Ning1

1School of Plant Protection, Anhui Agricultural University/Anhui Province Key Laboratory of Crop Integrated Pest Management, Hefei 230036;2Tianchang Agricultural Science and Technology Center Plant Protection Station, Tianchang 239300, Anhui

【Objective】Barnyard grass () is one of the main malignant weeds in rice fields in China. Acetolactate synthase (ALS) inhibitors, such as penoxsulam, are the main herbicides for controllingin rice fields. Previously, our research team identified a suspected penoxsulam-resistantpopulation, AHTC-01, in the main rice production area of Tianchang City, Anhui Province, China. The objective of this study is to clarify its resistance levels to major herbicides, investigate the possible resistance molecular mechanisms, and to provide a theoretical basis for the effective control of resistantand the delay of further development of herbicide resistance.【Method】Using the greenhouse potting method, the resistance levels of AHTC-01 to penoxsulam and its resistance patterns to different herbicides were determined at the whole-plant level. The target resistance molecular mechanism was explored through target gene sequencing and real-time quantitative PCR (RT-qPCR) analysis.【Result】Compared with the susceptiblepopulation AHFY-01, the suspected resistant population AHTC-01 had developed high-level resistance to penoxsulam, with a resistance index (RI) of 620. Analysis of the target-site based resistance mechanisms showed that thegene copy in the AHTC-01 population had a mutation from tryptophan (Trp) to leucine (Leu) at codon position 574, with a population mutation frequency of 100%. At 12 h after penoxsulam treatment, the relative expression level ofin the resistantpopulation AHTC-01 was 2.26 times of that in the susceptiblepopulation AHFY-01. AHTC-01 also exhibited varying levels of cross-resistance to three other ALS inhibitors, bispyribac sodium, pyribenzoxim, and imazamox, with RIs of 8.24, 13.36, and 20.36, respectively. However, it remained susceptible to other herbicides with different modes of action (MOAs), including the acetyl-CoA carboxylase (ACCase) inhibitors cyhalofop-butyl, fenoxaprop--ethyl, and clethodim, the 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) inhibitor tripyrasulfone, and the synthetic auxin mimic florpyrauxifen-benzyl.【Conclusion】Mutation of theat amino acid position 574 andoverexpression are one of the main reasons for the resistance ofpopulation AHTC-01 to penoxsulam, which also confers cross-resistance to different ALS inhibitors. In actual agricultural production, effective control of this type of resistantcan still be achieved by rotating the use of other herbicides with different MOAs.

; penoxsulam; acetolactate synthase (ALS); gene mutation; gene overexpression; resistance pattern

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.14.007

2023-04-11；

2023-05-14

安徽省科技重大專項（201903a06020033）、安徽農業(yè)大學人才引進科研啟動項目（rc342004）、安徽農業(yè)大學大學生創(chuàng)新訓練項目（X202210364248）

張麗雅，E-mail：3012596087@qq.com。李奇，E-mail：qigi12345@163.com。張麗雅和李奇為同等貢獻作者。通信作者趙寧，E-mail：zhaon@ahau.edu.cn

（責任編輯 岳梅）