戴桂琴 何卓俊 劉德亮 趙鵬飛 廖明鳳 宋麗軍楊倩婷 趙文昌 鄭明彬

（1）廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，東莞 523808；2）深圳市第三人民醫(yī)院（南方科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院），國家感染性疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，肝病研究所，深圳 518112；3）中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，中國科學(xué)院健康信息學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省納米醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳 518055；4）深圳大學(xué)物理與光電工程學(xué)院，深圳 518060）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mtb）感染引起、經(jīng)呼吸道傳播并可累及全身器官的慢性傳染病，常合并艾滋?。ˋIDS）、糖尿病等并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅患者的生存與健康。據(jù)2021 年世界衛(wèi)生組織（WHO）全球結(jié)核病報(bào)告顯示，全球約有20 億人處于潛伏性結(jié)核感染（LTBI）狀態(tài)，免疫功能受損的潛伏感染者易于轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袀魅拘缘幕顒?dòng)性結(jié)核，造成肺功能受損，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，結(jié)核感染晚期出現(xiàn)的持續(xù)咳嗽和咯血等癥狀甚至危及生命（圖1）。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年有990 萬例新發(fā)活動(dòng)性結(jié)核確診（發(fā)病率為127/10 萬人，死亡率高達(dá)15%），其中非洲、亞太區(qū)域結(jié)核新發(fā)病例最多，占全球新發(fā)病例的43%［1-3］，給結(jié)核高負(fù)擔(dān)國家?guī)砹司薮蟮慕?jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和醫(yī)療困境。

Fig. 1 The progression and harm of latent tuberculosis infection and active tuberculosis［3］圖1 潛伏結(jié)核感染及活動(dòng)性結(jié)核的進(jìn)展與危害［3］

結(jié)核早期診斷和有效治療是結(jié)核病防控的核心手段。臨床結(jié)核病診斷方式主要包括醫(yī)學(xué)影像學(xué)檢查、涂片鏡檢、分子診斷、痰液培養(yǎng)、免疫學(xué)診斷等，但是這些診斷手段存在特異性差、敏感性低、培養(yǎng)周期長、實(shí)驗(yàn)室裝備要求高等局限性［4-5］，缺乏及時(shí)、靈敏的診斷手段會(huì)延誤結(jié)核病的確診并增加結(jié)核傳播風(fēng)險(xiǎn)。因此，開發(fā)快速、準(zhǔn)確的結(jié)核診斷新策略，是遏制結(jié)核病蔓延和早期治療疾病的首要任務(wù)。

另一方面，臨床采用大劑量多聯(lián)藥物療法來治療結(jié)核病，這一治療方法面臨藥物治療方案復(fù)雜、療程周期長、生物利用度低、毒副作用高等挑戰(zhàn)，并面臨患者依從性差、合并人類免疫缺陷病毒（HIV）治療復(fù)雜性增加等問題，嚴(yán)重影響疾病治療效果［6-8］。結(jié)核分枝桿菌通過在肺部形成生物膜、潛伏于巨噬細(xì)胞內(nèi)和促進(jìn)機(jī)體肉芽腫形成等機(jī)制抵抗藥物治療［9］，也為結(jié)核治療帶來巨大挑戰(zhàn)。此外，全球范圍內(nèi)仍然缺乏預(yù)防性治療藥物，無法有效、全面地預(yù)防結(jié)核分枝桿菌感染。1908 年即被研制成功的卡介苗（BCG）在AIDS 患者、免疫抑制兒童和成年人中的免疫保護(hù)效果有限（保護(hù)效力最高為80%）［10］，而且產(chǎn)生的毒副作用會(huì)導(dǎo)致受試者死亡［11］。因此，開發(fā)安全有效的新型抗結(jié)核藥物對(duì)于預(yù)防、治療結(jié)核病和阻止結(jié)核病傳播尤為重要。

納米技術(shù)的快速發(fā)展為結(jié)核病的診斷、治療和預(yù)防帶來新機(jī)遇。納米材料具有可控的粒徑大小和表面化學(xué)特性，表現(xiàn)出優(yōu)異的光電傳感、導(dǎo)電性、磁性、催化、抗菌活性等獨(dú)特性能［12-13］。聯(lián)合熒光標(biāo)記技術(shù)的納米探針已廣泛用于結(jié)核分枝桿菌的快速、靈敏、準(zhǔn)確診斷［14-16］?；诩{米載體和抗結(jié)核藥物構(gòu)建的納米藥物，可通過破壞結(jié)核細(xì)胞膜完整性、促進(jìn)活性氧釋放、促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡等方式清除結(jié)核分枝桿菌，或作為藥物載體靶向遞送抗生素藥物至病灶部位和巨噬細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)核病（尤其是耐多藥結(jié)核?。┑木珳?zhǔn)診療［7，17-20］。本綜述旨在總結(jié)納米材料在結(jié)核分枝桿菌診斷、治療和預(yù)防等領(lǐng)域的研究進(jìn)展，展望納米診療體系在結(jié)核病診療的應(yīng)用前景，為尋求更好的結(jié)核診療工具，控制結(jié)核病全球大流行提供新思路和策略。

1 結(jié)核病診斷面臨的問題

目前臨床結(jié)核病診斷方法可分為醫(yī)學(xué)影像學(xué)診斷、細(xì)菌學(xué)診斷、免疫學(xué)診斷和分子診斷等。其中，胸部X 線影像學(xué)檢查適用于早期篩查結(jié)核感染，但其敏感性和特異性不高，無法與其他肺部感染性疾病區(qū)分開，需聯(lián)合其他診斷方法［21］。細(xì)菌學(xué)診斷主要依賴于抗酸涂片鏡檢和痰培養(yǎng)，該測(cè)試方法具有成本低廉、操作簡單、特異性高等特點(diǎn)，但僅有約59%的肺結(jié)核患者能通過實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢測(cè)獲得確診［3］；抗酸涂片存在陽性率低、操作復(fù)雜、靈敏度差（20%~80%） 以及檢測(cè)限高（5 000~10 000個(gè)菌/ml）等局限性［22］；痰培養(yǎng)是臨床結(jié)核診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但診斷周期需耗時(shí)4~6 周，且污染率高，無法滿足臨床快速診斷的需求［23］。通過檢測(cè)機(jī)體對(duì)結(jié)核免疫反應(yīng)產(chǎn)生的標(biāo)志物的免疫學(xué)診斷方法包括結(jié)核菌素（PPD）皮膚試驗(yàn)和γ 干擾素（IFN-γ）釋放試驗(yàn)（IGRA，如結(jié)核桿菌斑點(diǎn)試驗(yàn)T-SPOT），應(yīng)用于結(jié)核大規(guī)模普查時(shí)可在72 h內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果，具有經(jīng)濟(jì)、操作簡單的優(yōu)點(diǎn)，但該法靈敏性差，且受疾病窗口期、機(jī)體免疫、實(shí)驗(yàn)操作的影響，容易出現(xiàn)假陰性反應(yīng)［24］。全自動(dòng)醫(yī)用核酸擴(kuò)增（PCR）檢測(cè)分析系統(tǒng)（GeneXpert?）是集痰標(biāo)本處理、脫氧核糖核酸（DNA）提取、PCR 和利福平（RIF）耐藥基因檢測(cè)于一體的分子診斷技術(shù)，只需2 h 即可同時(shí)實(shí)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌定性和利福平耐藥檢測(cè)，但由于價(jià)格昂貴、檢測(cè)要求高，GeneXpert?技術(shù)在偏遠(yuǎn)和欠發(fā)達(dá)地區(qū)很難實(shí)施和推廣［25］。因此，臨床結(jié)核診斷策略面臨著診斷延誤和漏診誤診等難題，導(dǎo)致非必要或無效治療，最終加速結(jié)核病傳播，亟需開發(fā)新的快速診斷技術(shù)。

結(jié)核即時(shí)（POC）診斷技術(shù)是遏制結(jié)核病流行的關(guān)鍵策略。但是，POC 診斷需要滿足成本低、靈敏度高、特異性好、快速穩(wěn)定、操作簡便等特殊要求［5］。同時(shí)，與POC 診斷匹配的即時(shí)診斷設(shè)備必須具備體積小、操作簡便、結(jié)果及時(shí)等優(yōu)勢(shì)，以滿足臨床治療或家用監(jiān)護(hù)的診斷需求，獲取可信診斷結(jié)果［26］。引入新技術(shù)、新設(shè)備用于臨床樣本檢測(cè)，對(duì)于提高結(jié)核診斷的靈敏度和特異性具有重要的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。結(jié)核診斷面臨的另一巨大挑戰(zhàn)是如何對(duì)結(jié)核分枝桿菌的耐藥性能進(jìn)行評(píng)估。據(jù)報(bào)道，2020 年全球大約新增13.2 萬例利福平耐藥結(jié)核病例及2.6萬例廣泛耐藥結(jié)核病例，大量的耐多藥結(jié)核病例影響了結(jié)核病治療預(yù)后，阻礙了疾病防控［3］。一方面，檢測(cè)結(jié)核耐藥性能可以為耐藥患者制定個(gè)體化治療方案；另一方面，通過監(jiān)測(cè)耐藥結(jié)核病的流行情況，為耐藥結(jié)核臨床控制策略提供依據(jù)。因此，開發(fā)可大規(guī)模和快速篩查結(jié)核耐藥基因的診斷工具與診斷技術(shù)，對(duì)于提高結(jié)核治療效果、加強(qiáng)患者護(hù)理和減少結(jié)核病傳播至關(guān)重要。

2 納米探針在結(jié)核分枝桿菌診斷中的應(yīng)用

基于納米材料強(qiáng)吸附性、高催化率、強(qiáng)導(dǎo)電性、光穩(wěn)定性等特性，納米診斷技術(shù)有助于解決結(jié)核病延誤、漏診、誤診以及耐藥檢測(cè)技術(shù)匱乏等問題，為高效和精準(zhǔn)的診斷提供了新機(jī)遇，有望廣泛應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌快速檢測(cè)和抗結(jié)核藥物敏感性檢測(cè)。按照組成成分的不同，用于結(jié)核診斷的納米材料可分為無機(jī)納米探針（金、磁性、碳、量子點(diǎn)納米探針等）和有機(jī)納米探針（脂質(zhì)體、聚合物納米探針）兩大類（表1）。

2.1 無機(jī)納米探針

金納米探針具有良好的生物相容性和光學(xué)特性，可通過調(diào)節(jié)自身形貌、尺寸與元素分布等精確控制其力學(xué)行為、表面吸附、催化活性和光學(xué)性能等，且在最適激發(fā)波長下材料表面可產(chǎn)生局域表面等離子體共振效應(yīng)，用于比色測(cè)定［27］，是實(shí)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌靈敏和準(zhǔn)確診斷的最佳替代方案之一。結(jié)核分枝桿菌相關(guān)抗原培養(yǎng)濾液蛋白10（CFP-10）是結(jié)核優(yōu)勢(shì)標(biāo)志物，偶聯(lián)寡核苷酸的金納米顆粒（GNP）基于抗原抗體特異性識(shí)別作用可快速捕獲結(jié)核分枝桿菌CFP-10，通過實(shí)時(shí)免疫熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-Im-PCR）技術(shù)，檢測(cè)GNP 中結(jié)合的CFP-10 抗體水平，以此來反映結(jié)核分枝桿菌的增殖情況和病程進(jìn)展，相比于傳統(tǒng)的免疫PCR （Im-PCR） 檢測(cè)方法，基于GNP 發(fā)展的RT-Im-PCR技術(shù)對(duì)肺結(jié)核患者的檢測(cè)靈敏度從55%提高至84%，對(duì)肺外結(jié)核的檢測(cè)靈敏度從26%提高到76%［28］。利用金鈀（Au@Pd）雙金屬納米顆粒和納米磁珠構(gòu)建的酶聯(lián)免疫吸附比色平臺(tái)，其納米磁珠可快速捕獲血清樣本中的結(jié)核相關(guān)抗原CFP-10，Au@Pd 納米酶則通過催化顯色底物實(shí)現(xiàn)濃度依賴的信號(hào)指示和結(jié)核超敏診斷，對(duì)結(jié)核相關(guān)抗原CFP-10的檢測(cè)限可達(dá)3.3 fmol/L，比標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒靈敏40 倍，且在3 h內(nèi)即可獲取檢測(cè)結(jié)果，大幅度減少診斷工作量，縮短檢測(cè)時(shí)間［29］。

磁性納米探針（MNPs）一般是由鐵、鎳、鈷等金屬及其氧化物組成的磁性復(fù)合材料，比表面積大、催化效率高，可以作為過氧化氫酶，催化促進(jìn)底物顯色［30］，達(dá)到快速、準(zhǔn)確診斷結(jié)核的目的。核酸適配體聯(lián)合四氧化三鐵磁納米顆粒構(gòu)建的比色生物傳感系統(tǒng)，可以應(yīng)用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌64蛋白（MPT64）。吸附在四氧化三鐵磁納米顆粒表面的核酸適配體，能夠掩蔽磁納米顆粒的過氧化氫酶活性，與樣品中的MPT64 結(jié)合后，適配體從納米顆粒表面釋放出來，恢復(fù)磁納米顆粒的催化活性，通過檢測(cè)酶底物的熒光光譜變化，70 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)核病的快速診斷［31］。氧化鐵-金納米酶可利用磁富集和三明治夾心法特異性識(shí)別尿液中的結(jié)核特異性抗原CFP-10 和抗原85 復(fù)合體（Ag85），其自身的過氧化氫酶活性聯(lián)合過氧化氫和顯色底物進(jìn)行酶促反應(yīng)，可進(jìn)一步放大熒光信號(hào)，對(duì)結(jié)核相關(guān)抗原CFP-10 和Ag85 的檢測(cè)限分別為2.5 和1.6 fmol/L， 且 結(jié) 核 診 斷 特 異 性 高 達(dá)96%（圖2）［32］。

Fig. 2 Using the magnetic plasma nanoenzyme for the detection of Mycobacterium tuberculosis antigen（CFP-10）in urine via magnetic enrichment and catalyzed amplification of fluorescent signals［32］圖2 氧化鐵-金磁性納米酶基于磁富集和催化放大熒光信號(hào)檢測(cè)尿液中的結(jié)核分枝桿菌相關(guān)抗原CFP-10及Ag85［32］

碳納米材料是分散相至少有一維尺度小于100 nm 的碳材料，具有比表面積大、電導(dǎo)率良好和吸附能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)［33］。摻雜聚苯胺（PAN）的碳納米管（CNTs）具有比表面積大、活性基團(tuán)豐富和氧化還原活性高等特點(diǎn)，以人型結(jié)核分枝桿菌強(qiáng)毒株（H37Rv）的IS6110基因?yàn)榘袠?biāo)，通過分子雜交技術(shù)，可快速實(shí)時(shí)地對(duì)碳納米管表面結(jié)合的H37Rv IS6110 基因產(chǎn)生的電信號(hào)變化產(chǎn)生響應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)臨床痰液結(jié)核特異性抗原H37Rv IS6110的靈敏檢測(cè)，對(duì)H37Rv IS6110 的檢測(cè)限低至0.33 fmol/L［34］。二維碳納米石墨炔（GDY NSs）具有豐富的碳化學(xué)鍵、共軛體系、半導(dǎo)體性能和化學(xué)穩(wěn)定性［35］。通過鋰嵌入法制備的石墨炔納米薄片（GDY NSs）作為實(shí)時(shí)多重DNA 檢測(cè)的熒光傳感平臺(tái)，具有高效的熒光猝滅效應(yīng)和極大的比表面積，其搭載的DNA 探針分子可強(qiáng)力吸附和互補(bǔ)目標(biāo)單鏈DNA 分子，可用于結(jié)核分枝桿菌及其耐藥突變株DNA 的超靈敏檢測(cè)，對(duì)結(jié)核分枝桿菌的單鏈DNA 檢測(cè)限達(dá)到2.5×104fmol/L。其中，石墨炔作為熒光猝滅劑可高效猝滅吸附在其表面單鏈DNA的熒光，一旦其搭載的單鏈DNA與目標(biāo)DNA互補(bǔ)雜交即可從石墨炔納米薄片表面釋放并恢復(fù)DNA 探針熒光，為開發(fā)敏感、準(zhǔn)確的結(jié)核分子診斷技術(shù)提供了重要應(yīng)用基礎(chǔ)［36］。

量子點(diǎn)（QDs）是由II-VI 族，III-V 族或IV 族元素構(gòu)成的小尺寸（1~10 nm）、零維半導(dǎo)體納米晶，通過控制量子點(diǎn)尺寸和金屬摻雜比例，可產(chǎn)生極強(qiáng)的光致發(fā)光現(xiàn)象，具有光穩(wěn)定性好、光譜范圍窄、信噪比高等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于熒光成像、傳感等領(lǐng)域［37-38］。工程化重組抗體分別結(jié)合到硅涂層量子點(diǎn)和金納米棒表面，利用雙抗體夾心法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原85B（Ag85B），在1 h內(nèi)即可快速檢測(cè)到尿液中的Ag85B，檢測(cè)限為0.43 fmol/L［39］。聯(lián)合鈷-卟啉納米顆粒（nanoCoTPyP）和碲化鎘雙色量子點(diǎn)構(gòu)建的DNA 熒光傳感平臺(tái)，可用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的耐藥基因（利福平耐藥基因rpoB531和異煙肼耐藥基因katG315），由于nanoCoTPyP 對(duì)單鏈DNA 和雙鏈DNA（ds-DNA）具有親和力差異，對(duì)于吸附在其表面的量子點(diǎn)-單鏈DNA（QDs-ssDNA）表現(xiàn)出良好的熒光猝滅效果，附著在量子點(diǎn)上的單鏈DNA 與結(jié)核耐藥基因的單鏈DNA 分子特異性互補(bǔ)雜交后，量子點(diǎn)從nanoCoTPyP 上脫落并恢復(fù)熒光，通過觀察量子點(diǎn)熒光信號(hào)的變化，高靈敏檢測(cè)結(jié)核耐藥基因［40］。

2.2 有機(jī)納米探針

脂質(zhì)體納米探針是由兩親性脂質(zhì)分子構(gòu)成的雙層脂質(zhì)球形囊泡，常作為小分子藥物、蛋白質(zhì)/多肽藥物和基因的遞送載體［41］，在結(jié)核分枝桿菌診斷中應(yīng)用前景廣闊。經(jīng)抗菌肽激活的靶響應(yīng)脂質(zhì)體可用于高靈敏的結(jié)核分枝桿菌診斷，基于催化發(fā)夾自組裝（CHA）策略，IFN-γ 配體序列特異性識(shí)別靶點(diǎn)IFN-γ后自組裝成DNA，利用點(diǎn)擊化學(xué)偶聯(lián)能破壞脂質(zhì)體膜上的抗菌肽Temporin L，從而釋放脂質(zhì)體內(nèi)裝載的熒光信號(hào)分子，通過追蹤響應(yīng)的熒光信號(hào)，從而靈敏地檢測(cè)結(jié)核病相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ，檢測(cè)限為47 fmol/L［42］。多克隆抗體（IgG）修飾的脂質(zhì)體診斷試紙可利用免疫凝集反應(yīng)，特異性結(jié)合結(jié)核分枝桿菌抗原CFP后出現(xiàn)肉眼可見的凝集小塊，可以快速（4~5 min）、靈敏（97.48%）檢測(cè)1 473 名受試者血清樣本中的結(jié)核分枝桿菌抗原CFP-10，達(dá)到早期結(jié)核大規(guī)模篩查的目的［43］。

簡單、重復(fù)的結(jié)構(gòu)單元以共價(jià)鍵連接形成的高分子化合物，通過自組裝可構(gòu)建尺寸和比表面積可調(diào)的聚合物納米探針，具有高比表面積、高導(dǎo)電率、易于修飾等特點(diǎn)［44］。單鏈DNA通過氧化還原共價(jià)結(jié)合到聚吡咯納米線上構(gòu)建而成的電化學(xué)傳感器，可用于檢測(cè)結(jié)核病患者的利福平耐藥突變基因ropB。該體系比表面積高，允許表面結(jié)合大量DNA，具有良好的親水性，可避免非特異性結(jié)合，與樣本中的目標(biāo)ropBDNA雜交后，可以通過檢測(cè)電流微弱變化檢測(cè)到低至3.6×10-4fmol/L 的ropB［45］。樹枝狀分子修飾的聚吡咯/四氧化三鐵復(fù)合納米顆粒與氧化還原劑萘醌作為DNA 探針的支架，可用于結(jié)核利福平耐藥基因ropB選擇性檢測(cè)，利用分子雜交技術(shù)結(jié)合目標(biāo)基因ropB，通過氧化還原反應(yīng)引起電流極大下降，無需核酸擴(kuò)增即可檢測(cè)到4 fmol/LropB，有效鑒定野生型和利福平耐藥突變基因［46］。

綜上所述，與現(xiàn)有的臨床結(jié)核診斷技術(shù)相比較，納米診斷技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)快速等特點(diǎn)。而且，納米診斷設(shè)備具有體積小、操作簡便和結(jié)果及時(shí)等優(yōu)勢(shì)。因此，納米診斷體系能夠滿足臨床治療或家用監(jiān)護(hù)的診斷需求，在結(jié)核的早期篩查、快速診斷和及時(shí)檢測(cè)等方面均具有巨大的應(yīng)用潛力。

3 結(jié)核病治療與預(yù)防面臨的挑戰(zhàn)

結(jié)核病臨床治療多采用異煙肼（INH）、利福平及其衍生物、吡嗪酰胺（PZA）和乙胺丁醇（ETB）4種一線藥物聯(lián)合用藥，周期至少6個(gè)月以上，然而，由于藥物供應(yīng)不規(guī)律、患者治療依從性差、用藥方案不當(dāng)?shù)纫蛩?，往往?dǎo)致耐藥菌株的出現(xiàn)［47-48］。而且，耐藥結(jié)核病的治療時(shí)間長達(dá)18 個(gè)月以上，二線抗耐藥結(jié)核藥物價(jià)格昂貴（如貝達(dá)喹啉，單一療程需2.4萬），且毒副作用更大導(dǎo)致死亡風(fēng)險(xiǎn)增加［49-50］。因此，開發(fā)經(jīng)濟(jì)有效、安全無毒且可縮短療程的治療方案，對(duì)于耐藥結(jié)核病臨床治療尤為重要。

另一方面，藥物本身遞送效率低和結(jié)核生物膜、肺部肉芽腫組織和巨噬細(xì)胞等生理屏障對(duì)結(jié)核分枝桿菌的保護(hù)作用，也是導(dǎo)致抗結(jié)核藥物療效差的重要原因。臨床抗結(jié)核藥物多采用口服給藥方式進(jìn)行抗結(jié)核治療，但口服給藥生物利用度較低，而患者體內(nèi)生理屏障的保護(hù)進(jìn)一步屏蔽抗結(jié)核藥物，導(dǎo)致抗結(jié)核藥物的生物利用度極低［51-52］。此外，在宿主抵抗力下降時(shí)，潛伏結(jié)核感染可進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核病的現(xiàn)象也需重點(diǎn)關(guān)注［53］。因此，提高抗結(jié)核藥物的靶向遞送效率和開發(fā)結(jié)核預(yù)防性治療策略，對(duì)于終止結(jié)核病流行至關(guān)重要。

4 納米藥物在結(jié)核治療與預(yù)防中的應(yīng)用

納米藥物基于環(huán)境響應(yīng)、生物靶向、循環(huán)穩(wěn)定等可控設(shè)計(jì)，通過口服、靜脈注射、局部給藥等不同給藥途徑，提高藥物生物利用度和避免藥物失活，同時(shí)，減少給藥劑量、降低毒副作用，為克服當(dāng)前結(jié)核病治療的局限性提供有效策略［54］（圖3a）。

Fig. 3 Body and intracellular delivery route of nanomedicines for tuberculosis therapy圖3 結(jié)核治療納米藥物的機(jī)體遞送途徑及其胞內(nèi)輸送路徑

4.1 克服結(jié)核耐藥

納米藥物基于材料的天然抗菌活性，通過誘導(dǎo)活性氧（ROS）基團(tuán)釋放、破壞結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁、促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡等策略抵抗結(jié)核耐藥，通過聯(lián)合二線抗耐藥結(jié)核藥物，改善其毒副作用，是安全高效的耐藥結(jié)核病治療策略。金屬及其氧化物具有廣譜抗菌活性，并且?guī)缀醪划a(chǎn)生耐藥。微量銀納米顆粒和氧化鋅納米顆粒構(gòu)成的納米體系通過釋放大量活性氧誘導(dǎo)細(xì)菌膜脂質(zhì)過氧化作用，破壞細(xì)菌壁的完整性，同時(shí)，釋放的銀離子（Ag+）和鋅離子（Zn2+）可導(dǎo)致細(xì)菌蛋白質(zhì)變性，對(duì)耐多藥結(jié)核分枝桿菌的最低抑菌濃度（MIC）僅為1 mg/L，與抗耐藥結(jié)核藥物貝達(dá)喹啉一致［55］。海藻酸鹽修飾的聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米顆粒作為納米遞送系統(tǒng)包封兩種抗耐藥結(jié)核藥物阿米卡星和莫西沙星，通過抑制結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)的合成，靶向殺傷巨噬細(xì)胞內(nèi)的耐藥結(jié)核分枝桿菌。對(duì)比阿米卡星6.49%或莫西沙星3.27%的抑菌率，納米遞送體系能夠更徹底地抑制胞內(nèi)寄生結(jié)核菌（抑菌率為99.4%）［56］。

4.2 靶向遞送藥物

抗結(jié)核納米藥物采用被動(dòng)積累或主動(dòng)靶向的方式遞送到宿主細(xì)胞內(nèi)，改善用藥時(shí)間長、藥物生物利用度低、生理屏障滲透性差等不足，可以達(dá)到緩釋藥物，減少用藥周期、根除結(jié)核分枝桿菌的目的。常見的抗結(jié)核納米載藥體系主要包括聚合物納米顆粒、氧化石墨烯、納米膠束、β環(huán)糊精、凝膠多糖納米顆粒、硒納米顆粒和脂質(zhì)納米顆粒等。治療藥物可通過物理包封、吸附或化學(xué)偶聯(lián)等方式被裝載到納米載體中。

4.2.1被動(dòng)靶向治療藥物

被動(dòng)靶向治療策略可通過改變納米材料自身特性（尺寸、電荷、剛度、形狀等）來增強(qiáng)巨噬細(xì)胞內(nèi)吞作用，或利用增強(qiáng)滲透與駐留效應(yīng)，促進(jìn)納米藥物在肉芽腫等炎癥部位的積累，改善藥物滲透性差、生物利用度低、組織毒副作用高等瓶頸難題。以聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米顆粒為載體負(fù)載利福噴?。≧PT），可以有效延長藥物釋放時(shí)間（藥物緩釋時(shí)間從3 d延長至10 d），大幅度減少用藥次數(shù)，納米顆粒被巨噬細(xì)胞吞噬后，釋放利福噴丁到胞內(nèi)，以發(fā)揮抑制結(jié)核分枝桿菌核糖核酸（RNA）合成的作用，殺傷胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌［57］?；诹己玫姆尾堪邢蛐阅埽趸┩ㄟ^靜脈注射給藥能夠?qū)⒗芜虬犯咝нf送到肺部病灶部位，從而抑制結(jié)核分枝桿菌23S核糖體亞單位的合成，同時(shí)能夠誘捕結(jié)核分枝桿菌并釋放大量活性氧，有效殺傷胞內(nèi)和胞外結(jié)核分枝桿菌。單用利奈唑胺通常無法抑制結(jié)核菌復(fù)制和增殖，聯(lián)合用藥能夠顯著改善利奈唑胺的抗結(jié)核療效，減少治療周期和不良反應(yīng)［58］。利用兩親性的納米膠束（DSPE-PEG2000）負(fù)載新型聚集發(fā)光（aggregation-induced emission，AIE）材料和利福平構(gòu)建的納米藥物，能夠通過增強(qiáng)滲透與滯留 （enhanced permeability and retention，EPR）效應(yīng)聚集到肉芽腫內(nèi)，傳遞到病灶部位的AIE分子通過光動(dòng)力治療聯(lián)合利福平協(xié)同殺菌，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)核病的精準(zhǔn)診療（圖4）［59］。以透明質(zhì)酸為載體負(fù)載利福平和顯影劑花青素5.5（Cy5.5）開發(fā)谷胱甘肽響應(yīng)的納米診療系統(tǒng)，通過EPR 效應(yīng)實(shí)現(xiàn)納米藥物在結(jié)核肉芽腫部位的富集，并在肉芽腫組織高濃度谷胱甘肽的觸發(fā)下釋放出利福平，改善藥物半衰期短和機(jī)體代謝清除速率高的問題，能夠可視化肉芽腫治療效果，實(shí)現(xiàn)結(jié)核肉芽腫的診療一體化［60］。

4.2.2主動(dòng)靶向治療藥物

采用可識(shí)別吞噬細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體的特定配體（凝膠多糖、甘露糖、促吞噬素等）修飾納米藥物，顯著提高其對(duì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的主動(dòng)靶向性，提升巨噬細(xì)胞內(nèi)的抗結(jié)核藥物濃度，促進(jìn)藥物的抗結(jié)核效果（圖3b）。β 環(huán)糊精偶聯(lián)的凝膠多糖納米顆粒搭載利福平和左氧氟沙星，能夠應(yīng)用于胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的靶向清除，一方面凝膠多糖可主動(dòng)靶向巨噬細(xì)胞表面的樹突狀細(xì)胞相關(guān)性C型植物凝集素l（dectin-1）受體激活機(jī)體免疫，另一方面利福平、左氧氟沙星在70 h內(nèi)緩慢釋放，通過分別抑制結(jié)核分枝桿菌RNA和DNA的合成，對(duì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行持續(xù)有效的治療［61］。甘露糖可作為配體靶向巨噬細(xì)胞和結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁的甘露糖受體，甘露糖基化的硒納米顆粒搭載異煙肼構(gòu)建的肺部給藥體系，主動(dòng)遞送異煙肼至巨噬細(xì)胞內(nèi)后，通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬，協(xié)同抗結(jié)核藥物治療胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌［62］。促吞噬素修飾的脂質(zhì)納米載體可特異性識(shí)別感染結(jié)核的肺泡巨噬細(xì)胞表面受體，促進(jìn)包裹的藥物利福平內(nèi)吞入巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)胞內(nèi)藥物濃度，靶向清除胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌［63］。

4.3 預(yù)防性治療藥物

BCG 是采用無毒牛型結(jié)核桿菌懸浮液制成的減毒活疫苗，自1929 年應(yīng)用于臨床接種以來，BCG 仍然是目前全球臨床唯一獲批的結(jié)核疫苗。BCG 主要通過調(diào)動(dòng)機(jī)體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答（包括細(xì)胞免疫和體液免疫）來發(fā)揮抗結(jié)核保護(hù)作用，然而由于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制作用和記憶性T細(xì)胞產(chǎn)生不足，導(dǎo)致接種卡介苗不能長期抵抗結(jié)核感染。因此，BCG 在人群中的保護(hù)效率僅為0~80%，甚至在免疫缺陷的人群中無法發(fā)揮效力。增強(qiáng)疫苗的免疫原性和免疫記憶的持久性將是開發(fā)新型疫苗的關(guān)鍵問題［10］。

疫苗載體和納米佐劑利用其在淋巴結(jié)蓄積、抗原組裝、抗原提呈、免疫調(diào)節(jié)等方面的顯著優(yōu)勢(shì)［64-65］，相比于傳統(tǒng)疫苗、佐劑具有更強(qiáng)的免疫激活效率，將成為安全穩(wěn)定、長效廣譜的結(jié)核防護(hù)策略。采用結(jié)核分枝桿菌抗原Ag85B 和6kD 早期分泌靶抗原（ESAT-6）為靶向抗原，以脂質(zhì)體為載體構(gòu)建的DNA 納米疫苗，用于結(jié)核分枝桿菌預(yù)防性治療。脂質(zhì)體不僅是有潛力的DNA 疫苗輸送載體，同時(shí)能夠?qū)⒖乖岢式o抗原提呈細(xì)胞，聯(lián)合聚肌苷酸胞苷酸（Poly I∶C） 佐劑誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)Ag85B產(chǎn)生輔助性T淋巴細(xì)胞（Th1/Th17-Th2）免疫反應(yīng)，有效增強(qiáng)BCG 的免疫應(yīng)答和保護(hù)效力，促進(jìn)記憶T 細(xì)胞在肺部的積累，相比于單用卡介苗，顯著減少了肺部結(jié)核分枝桿菌的載量［66］。葛蘭素史克公司研發(fā)的新型抗結(jié)核疫苗M72/AS01E，其脂質(zhì)體佐劑系統(tǒng)AS01E包含皂樹皂苷（QS-21）和-O-去?；?4'-單磷酰脂A（MPL）兩種免疫刺激佐劑，與兩種結(jié)核分枝桿菌抗原（MTB32A 和MTB39A） 協(xié)同治療后的IIb 期臨床試驗(yàn)表明，M72/AS01E能夠誘導(dǎo)快速的天然免疫響應(yīng)，可在至少3 年內(nèi)預(yù)防肺結(jié)核病的發(fā)展［67］。美國傳染病研究中心（IDRI） 聯(lián)合4 種結(jié)核分枝桿菌抗原（Rv2608、Rv3619、Rv3620、Rv1831）和微乳佐劑系統(tǒng)GLA-SE 設(shè)計(jì)了新型抗結(jié)核疫苗ID93/GLA-SE，該佐劑系統(tǒng)由Toll 樣受體4（TLR4）激動(dòng)劑吡喃葡萄糖基脂質(zhì)通過水包油納米乳劑配制而成，該體系增強(qiáng)了特異性CD4+T 細(xì)胞的數(shù)量和多功能性，I 期臨床研究表明ID93/GLA-SE 納米乳劑在56 名受試者中的安全性高，并且能夠誘導(dǎo)強(qiáng)大的體液免疫反應(yīng)和Th1 細(xì)胞反應(yīng)［68］（圖5）。單磷酸酰脂質(zhì)A（MPLA）佐劑是沙門氏菌脂多糖的改性衍生物，作為TLR 激動(dòng)劑可有效刺激細(xì)胞免疫反應(yīng)。聚乙交酯丙交酯（PLGA）-雙十八烷基二甲基溴化銨（DDA）雜合納米顆粒包裹HspX/EsxS融合蛋白和MPLA佐劑后，采用皮下注射方式遞送結(jié)核疫苗，在PLGA-DDA 雜合納米顆粒和MPLA佐劑協(xié)同作用下，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量的IFN-γ和免疫球蛋白G2a （IgG2a），提高機(jī)體白介素-4（IL-4）和IgG1 水平，顯著增強(qiáng)疫苗免疫原性［69］。ISCOMATRIX 佐劑是由皂角苷、膽固醇、磷脂分子通過疏水相互作用形成的籠型結(jié)構(gòu)，能夠有效誘導(dǎo)抗體應(yīng)答以及CD4+和CD8+T 細(xì)胞應(yīng)答；PLUSCOM 佐劑和ISCOMATRIX 佐劑相似，區(qū)別在于由陽離子衍生物替代膽固醇，能更好地與帶負(fù)電的抗原相互作用。皮下分別注射ISCOMATRIX/MPLA、PLUSCOM/MPLA 納米復(fù)合佐劑，協(xié)助Mtb 融合蛋白（HspX/EsxS）誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生更高水平的Th1和IgG2a免疫反應(yīng)，顯著增強(qiáng)重組疫苗免疫原性［70］。因此，納米佐劑通過誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生高效的特異性免疫反應(yīng)和長期免疫記憶，對(duì)于成人、老年人或者免疫受損者的免疫抗結(jié)核能力具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

Fig. 5 Specific T cell response of the anti-tuberculosis vaccine（ID93/GLA-SE）combining Mycobacterium tuberculosis antigens and the nano adjuvant system［68］圖5 結(jié)核分枝桿菌抗原和納米佐劑系統(tǒng)構(gòu)建的抗結(jié)核疫苗（ID93/GLA-SE）誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞反應(yīng)［68］

5 總結(jié)與展望

結(jié)核病是威脅人類生存的一種嚴(yán)重傳染性疾病，位列人類全球十大死因之一。對(duì)結(jié)核病及時(shí)準(zhǔn)確的診斷，是消除傳染源、控制結(jié)核病流行的重要環(huán)節(jié)。潛伏結(jié)核感染無明顯的活動(dòng)性結(jié)核病表現(xiàn)，常規(guī)檢測(cè)方法難以檢出，缺乏診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”，仍需深入研究和開發(fā)更多適合大規(guī)模篩查的檢測(cè)方法。同時(shí)，能否提供高質(zhì)量、可信賴的診斷結(jié)果，也是解決POC 診斷臨床應(yīng)用受限的關(guān)鍵問題，因此，亟需篩選驗(yàn)證特異性好、敏感性高的結(jié)核診斷標(biāo)記物，結(jié)合納米技術(shù)的發(fā)展聯(lián)合應(yīng)用多種檢測(cè)方法，達(dá)到既能對(duì)涂片檢測(cè)陰性的結(jié)核病實(shí)現(xiàn)有效診斷，又能快速篩查結(jié)核病耐藥基因的目的。納米診斷面臨著規(guī)模放大、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、專業(yè)人才等瓶頸難題，需要開發(fā)建立成熟的可重復(fù)流程，確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性、靈敏度、特異性。隨著醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)和納米技術(shù)的發(fā)展以及配套產(chǎn)業(yè)的興起，未來納米診斷產(chǎn)品將不斷進(jìn)入臨床應(yīng)用，滿足不同臨床診斷場(chǎng)景和診斷需求，服務(wù)于臨床醫(yī)學(xué)。

結(jié)核分枝桿菌易受到生物膜、巨噬細(xì)胞、肉芽腫等生理屏障的保護(hù)、傳統(tǒng)診斷方法存在廣泛的局限性、耐多藥和廣泛耐藥結(jié)核病的快速傳播，為結(jié)核病的早期治療帶來巨大挑戰(zhàn)。此外，針對(duì)結(jié)核預(yù)防性治療的方案不統(tǒng)一，適用群體和安全性還需要臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證。然而，實(shí)現(xiàn)納米藥物的臨床耐藥結(jié)核治療應(yīng)用仍存在諸多阻礙亟待克服。一方面，亟需開展充分的臨床前和臨床研究，嚴(yán)格評(píng)估生產(chǎn)質(zhì)量控制及系統(tǒng)參數(shù)，如開展系統(tǒng)性的靈長類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)，驗(yàn)證納米遞送系統(tǒng)的藥物毒理學(xué)、藥物代謝動(dòng)力學(xué)、診療效果驗(yàn)證、體內(nèi)組織生物分布、生物安全性和適用場(chǎng)景等，快速促進(jìn)其臨床耐藥結(jié)核病治療應(yīng)用。另一方面，納米藥物在大規(guī)模生產(chǎn)、生物相容性、效益成本、可重復(fù)性等方面的局限性使其在短期內(nèi)難以廣泛應(yīng)用于臨床?？傊?，為了實(shí)現(xiàn)突破性的發(fā)展，確保納米材料安全、有效，需要多學(xué)科交叉融合，完善納米技術(shù)與醫(yī)學(xué)、工程等領(lǐng)域的密切合作是未來結(jié)核病診療的重點(diǎn)發(fā)展方向。