李 卓 周 建 王 馨 徐 璞

（西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 710077）

分子診斷技術(shù)已廣泛應(yīng)用到了生命科學(xué)、食品安全、環(huán)境監(jiān)測以及臨床診斷等各個(gè)方面［1］。尤其是在新型冠狀病毒感染疫情全球蔓延的大背景下，以CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associate）系統(tǒng)為代表的新興技術(shù)在分子診斷領(lǐng)域迎來了快速發(fā)展，凸顯出獨(dú)特的優(yōu)勢。傳統(tǒng)的PCR 方法建立的核酸分子診斷技術(shù)，需要配備專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室、特定的檢測設(shè)備，以及經(jīng)過嚴(yán)格培訓(xùn)的專業(yè)技術(shù)人員等，往往受到諸多限制［2］，相比之下，基于CRISPR/Cas的分子診斷傳感器系統(tǒng)具有檢測時(shí)間短、無需特殊設(shè)備等優(yōu)勢，因此更適合床旁快速檢測（point-ofcare testing，POCT）［1］。CRISPR/Cas 技術(shù)最初主要應(yīng)用于核酸檢測，隨著研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)它也可以應(yīng)用于非核酸分子診斷，目前基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)已陸續(xù)建立了一系列非核酸分子檢測技術(shù)［2］，然而尚未見系統(tǒng)性分析其原理、特點(diǎn)等相關(guān)報(bào)道。本文系統(tǒng)綜述并全面分析了基于CRISPR/Cas 分子診斷傳感器系統(tǒng)在非核酸分子診斷中的應(yīng)用和最新進(jìn)展，期望能為其在體外診斷中的應(yīng)用提供參考。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)

1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的主要分類及特點(diǎn)

CRISPR/Cas 系統(tǒng)是細(xì)菌和古生菌抵御病毒等外源核酸入侵的“獲得性免疫系統(tǒng)”，研究表明其具有強(qiáng)大的基因編輯功能，CRISPR/Cas 作為基因編輯系統(tǒng)獲得了2020 年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。隨著對CRISPR/Cas 研究的深入，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一系列的CRISPR/Cas 系統(tǒng)。CRISPR/Cas 系統(tǒng)依據(jù)效應(yīng)蛋白的種類可分為Class-I 型和Class-II 型，包含6 個(gè)亞型，分別為：I、II、III、IV、V、VI 亞型［3］。Class-I型的Cas效應(yīng)蛋白為多亞基蛋白組成的復(fù)合體，包含I、III、IV亞型；Class-II型的Cas效應(yīng)蛋白是由單個(gè)亞基組成，包括II類的Cas9蛋白、V類的Cas12 蛋白、VI 類的Cas13 等［4］。Class-II 型的Cas 效應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)單一，更適合基因工程的應(yīng)用。隨著對CRISPR/Cas 系統(tǒng)應(yīng)用研究的不斷深入，其應(yīng)用領(lǐng)域也在逐漸豐富。CRISPR/Cas 系統(tǒng)已經(jīng)開始應(yīng)用于分子診斷系統(tǒng)，目前用于分子診斷的CRISPR/Cas 系統(tǒng)主要包括Class-II 型的II 類CRISPR/Cas9、Class-II 型的V 類CRISPR/Cas12、Class-II 型的VI 類CRISPR/Cas13、Class-II 型的V類CRISPR/Cas14，以及Class-I 型的I 類CRISPR/Cas3等［5］，各自的特點(diǎn)分別如下：a. CRISPR/Cas9系統(tǒng)的Cas 蛋白含有HNH 和RuvC 酶活性區(qū)域，CRISPR/Cas9 在指導(dǎo)RNA （guide RNA，gRNA）的引導(dǎo)下識別靶向序列，同時(shí)識別靶向序列上游含有5'-NGG-3'的前間區(qū)序列鄰近基序（proto-spacer adjacent motif，PAM）序列，gRNA引導(dǎo)Cas9蛋白識別靶向序列后激活HNH和RuvC酶對靶向核酸序列的切割，產(chǎn)生DNA 雙鏈斷裂（double strand break，DSB），CRISPR/Cas9切割DNA主要產(chǎn)物雙鏈的平末端［6］；b. Class-II 型V 類的主要代表為CRISPR/Cas12 系統(tǒng)，Cas12 蛋白含有RuvC 酶活性區(qū)域，CRISPR/Cas12 在gRNA 的引導(dǎo)下識別靶向核酸序列，CRISPR/Cas12 識別DNA 靶標(biāo)序列和PAM 序列，激活CRISPR/Cas12 對靶向雙鏈DNA切割，同時(shí)激活了CRISPR/Cas12的非靶向切割［7］；c. Class-II 型VI 類的CRISPR/Cas13 為針對RNA 的一種核酸識別系統(tǒng)，在gRNA 的引導(dǎo)下CRISPR/Cas13與crRNA序列形成復(fù)合物，識別間隔區(qū)側(cè)翼（protospacer flanking，PFS）序列和靶向RNA 序列后，激活了Cas13 針對靶向RNA 序列特異性的剪切，同時(shí)也激活了非特異性切割活性［8］；d. CRISPR/Cas14 是基于Class-II 型的V 類CRISPR/Cas 系統(tǒng)，在gRNA 的引導(dǎo)下識別靶向核酸ssDNA序列，激活其靶向切割活性，隨后激活了CRISPR/Cas14 對ssDNA 的靶向切割［9］；e. CRISPR/Cas3 屬于Class-I 的I-E 型CRISPR/Cas 系統(tǒng)，Cas3 靶向識別過程中需要一個(gè)crRNA，在gRNA 引導(dǎo)Cas3 下識別dsDNA 靶向序列后激活Cas3 蛋白對靶向dsDNA的解旋并進(jìn)行切割，gRNA非互補(bǔ)鏈的切割產(chǎn)生缺口，也激活了Cas3 蛋白的非靶向切割ssDNA［10］。正是基于CRISPR/Cas蛋白對靶向核酸序列識別的優(yōu)良特性，以及對靶向DNA或者RNA的切割特點(diǎn)，其在基因功能研究、重組疫苗研發(fā)、基因治療、分子檢測等方面得到越來越廣泛的應(yīng)用。

1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的主要應(yīng)用

CRISPR/Cas 系統(tǒng)最早被發(fā)現(xiàn)具有基因編輯功能并進(jìn)行了較為深入的研究，目前已有一系列的相關(guān)研究報(bào)道和文獻(xiàn)綜述［11］。隨著對Cas 蛋白結(jié)構(gòu)的研究，人們發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas 除了應(yīng)用于基因編輯外，還可以用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因突變以及單堿基突變疾病的治療等方面［8］。CRISPR/Cas 系統(tǒng)另外一個(gè)重要的應(yīng)用便是分子檢測功能，具有簡單快捷等優(yōu)勢?，F(xiàn)已應(yīng)用CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13和CRISPR/Cas14系統(tǒng)構(gòu)建了一系列分子診斷平臺，其中核酸分子診斷系統(tǒng)的典型代表有SHERLOCK （specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking） 、 DETECTR（DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter）等［12］。除此之外，近年來研究者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)利用CRISPR/Cas 系統(tǒng)構(gòu)建生物傳感器系統(tǒng)，可以用于非核酸（DNA 或RNA）分子的檢測，并建立了一系列分子診斷平臺，但目前尚缺乏全面深入的報(bào)道。本文重點(diǎn)針對基于CRISPR/Cas 生物傳感器系統(tǒng)在外泌體（exosome，Exo）、小分子化合物等非核酸分子診斷中的應(yīng)用和最新進(jìn)展做以下介紹。

2 基于CRISPR/Cas12a的分子診斷傳感器在非核酸分子診斷中的應(yīng)用

2.1 基于CRISPR/Cas12a的分子診斷傳感器系統(tǒng)在Exo檢測中的應(yīng)用

Exo是由多種活細(xì)胞分泌的囊泡小體，研究認(rèn)為Exo參與細(xì)胞間重要的信息交換，在多種病理和生理過程中發(fā)揮重要作用。Exo在不同體液中豐度不一，不同組織來源的Exo在組成和功能方面存在差異，并受到細(xì)胞外基質(zhì)和微環(huán)境的動(dòng)態(tài)調(diào)控，因此外泌體檢測可能成為疾病病理變化的重要診斷手段［11］。目前有研究人員應(yīng)用CRISPR/Cas12a 技術(shù)建立了一種快速檢測外泌體的方法（CRISPR/Cas12a/exosome）［11］。CRISPR/Cas12a/exosome 系統(tǒng)基于Cas12a 構(gòu)建生物傳感器，首先采用生物素標(biāo)記一段含有外泌體標(biāo)志物CD63 適配體的DNA序列（CD63 aptamer），其中CD63 aptamer 互補(bǔ)序列為Cas12a 的靶向序列即阻斷子序列（blocker）。CRISPR/Cas12a/exosome 生物傳感器系統(tǒng)檢測的基本過程如下：首先將生物素（biotin） 標(biāo)記的CD63 aptamer與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，當(dāng)檢測體系中有Exo 存在時(shí)，CD63 適配體序列與Exo上的CD63結(jié)合并且吸附于磁珠表面，導(dǎo)致blocker釋放至反應(yīng)體系，通過磁鐵將磁珠、CD63 aptamer/Exo/磁珠的復(fù)合體與blocker 分離，Cas12a在gRNA 的引導(dǎo)下識別靶向Blocker 序列后激活其靶向切割，同時(shí)也激活Cas12a 非特異性切割熒光素標(biāo)記的非靶向核苷酸序列產(chǎn)生熒光信號。當(dāng)檢測系統(tǒng)不存在Exo時(shí)，CD63適配體序列與磁珠結(jié)合，不能釋放Blocker 序列，在磁珠分離過程中blocker序列一起被磁珠吸附分離，因此Cas12a 未識別到blocker 序列的存在，不能激活Cas12a 切割活性，因而未有熒光信號產(chǎn)生。此技術(shù)目前已經(jīng)成功應(yīng)用于臨床樣本的外泌體檢測過程中，其檢測范圍為3×109~6×1013particles/L，并在肝癌患者和健康患者的臨床樣本中進(jìn)行了系統(tǒng)驗(yàn)證（圖1，表1）。

Table 1 Application characteristics of CRISPR/Cas biosensor system in non-nucleic acid molecular detection表1 CRISPR/Cas生物傳感器系統(tǒng)在非核酸分子檢測中的應(yīng)用特點(diǎn)

Fig. 1 Principle diagram of exosome detection by CRISPR/Cas12a biosensor［11］圖1 CRISPR/Cas12a生物傳感器外泌體檢測原理示意圖［11］

2.2 基于CRISPR/Cas12a建立的CaT-SMelor小分子化合物檢測系統(tǒng)

CaT-SMelor （CRISPR-Cas12a and aTFmediated small molecule detector）小分子檢測平臺（圖2a）［12］是基于LbCas12a 聯(lián)合變構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子（allosteric transcription factor，αTF）構(gòu)建的小分子檢測系統(tǒng)：αTF 通過纖維素結(jié)合域（cellulosebinding domain，CBD）固定在微晶纖維素上，含有能被纖維素結(jié)合域變構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子（CBD-αTF）復(fù)合體識別的dsDNA 序列，作為Cas12a 識別的靶向序列。CaT-Smelor 系統(tǒng)檢測基本流程如下：dsDNA 與CBD-αTF 形成復(fù)合體，當(dāng)被檢測目標(biāo)小分子與CBD-αTF 結(jié)合時(shí)，引起復(fù)合體構(gòu)象改變，復(fù)合體解聚釋放dsDNA，gRNA 引導(dǎo)Cas12a 識別靶向dsDNA序列，Cas12a、gRNA和靶向序列形成三元復(fù)合體后激活Cas12a 特異性切割和非特異性切割熒光標(biāo)記的非靶向ssDNA序列產(chǎn)生熒光信號，其強(qiáng)弱與反應(yīng)體系中小分子化合物成正比，通過熒光信號強(qiáng)弱定性和定量分析小分子化合物含量。目前構(gòu)建的CaT-SMelor 小分子檢測系統(tǒng)，已經(jīng)可以檢測人類血清樣本中的尿酸，檢測時(shí)間大約1 h，檢測限（LOT）為1 nmol/L，一次檢測可應(yīng)用96孔板進(jìn)行高通量檢測（圖2a，表1）。

Fig. 2 Schematic diagram of small molecule detection based on CRISPR/Cas12a molecular diagnostic sensor圖2 基于CRISPR/Cas12a分子診斷傳感器的小分子檢測原理示意圖

2.3 基于CRISPR/Cas12a建立的無細(xì)胞物傳感器小分子化合物檢測系統(tǒng)

基于Cas12a 構(gòu)建的Cas12a-依賴的無細(xì)胞小分子檢測傳感器（cell-free biosensors）檢測平臺（圖2b），其基本檢測流程為：構(gòu)建一段含有T7 啟動(dòng)子、操縱子、T7啟動(dòng)子的終止密碼子序列和gRNA和Cas12a 識別的dsDNA 靶向序列。αTF 可以與T7啟動(dòng)子下游的操縱子序列結(jié)合抑制T7 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄下游的dsDNA 轉(zhuǎn)錄為前crRNA（pre-crRNA）。當(dāng)反應(yīng)體系中有小分子存在時(shí)，其可以與αTF結(jié)合引起αTF 構(gòu)象改變后與操縱子區(qū)域分離，激活T7啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，轉(zhuǎn)錄為pre-crRNA后經(jīng)過酶切產(chǎn)生成熟的crRNA，與Cas12a 形成復(fù)合體識別靶向序列，激活雙熒光標(biāo)記的非特異切割產(chǎn)生熒光信號，以檢測小分子化合物的含量。無細(xì)胞生物傳感器檢測系統(tǒng)具有高靈敏度和高特異性等特點(diǎn)，目前已經(jīng)用于快速檢測環(huán)境中的四環(huán)素等抗生素，檢測時(shí)間約2 h［13］（圖2b，表1）。

2.4 基于CRISPR/Cas12a聯(lián)合功能DNA建立的小分子化合物檢測系統(tǒng)

基于Cas12a 和功能DNA （functional DNA，fDNA）構(gòu)建的小分子化合生物傳感器檢測平臺（圖2c），是fDNA 調(diào)節(jié)的CRISPR/as12a 小分子檢測系統(tǒng)（fDNA-Cas12a）。fDNA-Cas12a 檢測系統(tǒng)基本流程如下：當(dāng)系統(tǒng)不存在檢測的靶標(biāo)小分子化合物時(shí)，fDNA與CRISPR/as12a識別的靶向序列結(jié)合，抑制CRISPR/as12a系統(tǒng)與靶向識別DNA序列的結(jié)合，系統(tǒng)不產(chǎn)生熒光信號；當(dāng)反應(yīng)體系中有檢測的靶向檢測小分子化合物時(shí)，fDNA 釋放CRISPR/as12a 系統(tǒng)可識別DNA 序列結(jié)合，激活CRISPR/as12a 切割熒光標(biāo)記的非靶向ssDNA 序列產(chǎn)生熒光信號。fDNA-Cas12a系統(tǒng)目前已經(jīng)應(yīng)用于三磷酸腺苷（ATP）和鈉離子（Na+）的檢測，該系統(tǒng)的檢測時(shí)間短，且室溫條件下即可完成反應(yīng)［14］（圖2c，表1）。

2.5 基于CRISPR/Cas12a建立的三聚氰胺檢測系統(tǒng)

基于CRISPR/Cas12a建立的三聚氰胺檢測系統(tǒng)（aptamer-blocker）（圖2d）：首先通過構(gòu)建適配體（aptamer）和阻斷子（blocker），在有三聚氰胺存在的情況下Aptamer 形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，解離釋放blocker 序列，其中blocker 為Cas12a 識別的靶向序列，二者識別后形成復(fù)合體后激活靶向切割和非靶向切割熒光標(biāo)記的非特異性ssDNA 序列產(chǎn)生熒光信號，通過檢測熒光信號即可反映三聚氰胺的含量［15］。目前該技術(shù)已應(yīng)用于牛奶中三聚氰胺的檢測，其檢測過程大約需要20 min，檢測下限為38 nmol/L，（圖2d，表1）。

2.6 基于CRISPR/Cas12a建立的赭曲毒素A檢測系統(tǒng)

基于鏈霉親和素磁珠熒光信號（magnetic sepation fluorescent signal）和CRISPR/Cas12a 構(gòu)建的赭曲毒素A（ochratoxin A，OTA）生物傳感器檢測系統(tǒng)（圖2e）：首先構(gòu)建OTA 的適配體序列，其互補(bǔ)序列為CRISPR/Cas12a 的靶向識別的序列。當(dāng)反應(yīng)體系中有OTA 存在，適配體序列與OTA 結(jié)合釋放其互補(bǔ)序列（CRISPR/Cas12a的靶向識別的序列），gRNA 引導(dǎo)CRISPR/Cas12a 識別靶向序列（為適配體序列的互補(bǔ)序列），激活Cas12a 的復(fù)合體激活靶向切割和非靶向切割磁珠鏈霉親和素和熒光素標(biāo)記的ssDNA 序列后產(chǎn)生熒光信號，應(yīng)用磁鐵分離未切割磁珠鏈霉親和素和熒光素標(biāo)記分子，檢測切割后熒光信號［16］。該技術(shù)現(xiàn)已應(yīng)用于檢測食品中的OTA，其檢測時(shí)間約為1 h（圖2e，表1）。

3 基于CRISPR/Cas13a的分子診斷傳感器在非核酸分子診斷中的應(yīng)用

3.1 基于CRISPR/Cas13a 建立的堿性磷酸酶（ALP）活性檢測系統(tǒng)

基于Cas13a 構(gòu)建的堿性磷酸酶（ALP）活性測定生物傳感器檢測系統(tǒng)（TITAC-Cas）（圖3a）：首先設(shè)計(jì)一個(gè)含有T7 啟動(dòng)子的DNA 雙鏈（double strand DNA，dsDNA），其中5'端被磷酸化，監(jiān)測反應(yīng)體系中無靶向分子ALP 存在時(shí)，T7 啟動(dòng)子會(huì)被λ 外切酶降解導(dǎo)致T7 無法啟動(dòng)。然而當(dāng)ALP 存在時(shí)，5'端發(fā)生去磷酸化，T7 啟動(dòng)子開啟轉(zhuǎn)錄活性，轉(zhuǎn)錄出能被CRISPR/Cas13a 識別的靶向序列，啟動(dòng)CRISPR/Cas13a/gRNA復(fù)合體的靶向切割和非靶向切割產(chǎn)生熒光信號［17］。目前該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于HepG2 細(xì)胞的ALP 活性測定，其檢出限為6 mU/L，檢測原理和基本特點(diǎn)如圖3a和表1。

Fig. 3 Non-nucleic acid molecular diagnosis sensor detection system based on CRISPR/Cas13a圖3 基于CRISPR/Cas13a建立的非核酸分子診斷傳感器檢測系統(tǒng)

3.2 基于CRISPR/Cas13a建立的病原微生物檢測系統(tǒng)

基于Cas13a 建立的沙門菌生物傳感器檢測系統(tǒng)，即Cas13a 聯(lián)合變構(gòu)探針的沙門菌檢測平臺APC-Cas （allosteric probe-initiated catalysis and CRISPR/Cas13a）（圖3b）：設(shè)計(jì)能夠識別病原體的特異性變構(gòu)探針（allosteric probe，AP），在病原體存在的情況下，AP 能特異性與目標(biāo)病原體結(jié)合，改變構(gòu)象，并在引物和DNA 聚合酶的作用下合成dsDNA，隨后利用T7 啟動(dòng)子，啟動(dòng)適配體序列的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物單鏈RNA （signal strand RNA，ssRNA）為Cas13a識別的靶向序列，激活CRISPR/Cas13a 靶向切割和非靶向切割產(chǎn)生熒光信，通過檢測熒光信號反映病原微生物是否存在。目前已采用APC-Cas 技術(shù)實(shí)現(xiàn)了沙門氏菌的定量檢測［18］，可應(yīng)用于牛奶等樣本的沙門菌檢測，其檢測范圍1~105 CFU，與傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（realtime PCR）法和培養(yǎng)法相比，具有檢測時(shí)間短等優(yōu)勢（圖3b，表1）。

4 CRISPR/Cas分子診斷傳感器在非核酸分子診斷應(yīng)用中的優(yōu)缺點(diǎn)和應(yīng)用前景

隨著新型冠狀病毒疫情的蔓延，分子診斷技術(shù)得到了極大發(fā)展。CRISPR/Cas 系統(tǒng)作為一種新興的分子診斷技術(shù)，對病原菌的快速分子診斷具有很大潛力，現(xiàn)已應(yīng)用于嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）的快速檢測。CRISPR/Cas 分子診斷技術(shù)的檢測靶標(biāo)分子主要為核酸和非核酸兩種類型，其在核酸檢測方面已得到深入研究和廣泛應(yīng)用，前期已有較多的總結(jié)和回顧性文獻(xiàn)報(bào)道，但在非核酸檢測方面的應(yīng)用尚未見系統(tǒng)性的研究報(bào)道。本文重點(diǎn)闡述了CRISPR/Cas 分子診斷傳感器系統(tǒng)在非核酸診斷中的應(yīng)用。

4.1 CRISPR/Cas分子診斷傳感器在非核酸分子診斷中的優(yōu)點(diǎn)

目前應(yīng)用于非核酸分子診斷的CRISPR/Cas 系統(tǒng)主要有Cas12a 和Cas13a 兩種類型，其檢測樣本類型復(fù)雜多樣，涵蓋了人的血液、體液、牛奶、食品、甚至環(huán)境樣本等，檢測過程所需時(shí)間從20~120 min不等，因此部分檢測系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)即時(shí)檢測。CRISPR/Cas 分子診斷傳感器系統(tǒng)具有適應(yīng)復(fù)雜多樣化的樣本、檢測時(shí)間短、操作流程簡單、靈敏度高、特異性高，不需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境等眾多優(yōu)勢。檢測的靶向分子從病原微生物到小分子三聚氰胺化合物均可實(shí)現(xiàn)，凸顯出了CRISPR/Cas 檢測系統(tǒng)的靶標(biāo)分子的廣泛性、樣本類型的普遍性以及檢測操作的便捷性，且不需要復(fù)雜的檢測設(shè)備，更適用于POCT。因此CRISPR/Cas檢測更適于在醫(yī)療水平欠發(fā)達(dá)地區(qū)，以及需要即時(shí)檢測的場景，如：海關(guān)、車站、學(xué)校甚至災(zāi)區(qū)等場所，進(jìn)行推廣應(yīng)用。

4.2 CRISPR/Cas分子診斷傳感器在非核酸分子診斷中的局限性

作為一種新型檢測技術(shù)，CRISPR/Cas 分子診斷傳感器也存在一定的缺陷。a. CRISPR/Cas 系統(tǒng)Cas 蛋白的識別靶向序列過程中具有脫靶（off target）效應(yīng)［9，19-20］，在gRNA的引導(dǎo)下Cas蛋白識別靶向核酸序列過程中，與非靶點(diǎn)核酸序列部分錯(cuò)配形成CRISPR/Cas、gRNA、ssDNA/ssRNA 三元復(fù)合物，產(chǎn)生脫靶切割，引起檢測結(jié)果的假陽性。其解決方法為：通過尋找高保真CRISPR/Cas 系統(tǒng)家族成員，或基因工程的方法設(shè)計(jì)優(yōu)化CRISPR/Cas 蛋白堿基序列獲得高保真CRISPR/Cas突變體，通過優(yōu)化gRNA 的設(shè)計(jì)提高靶向效應(yīng)（on target）并降低脫靶效應(yīng)，提高陽性檢出率?；贑RISPR/Cas的脫靶問題，本課題組前期建立了哺乳動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)化的CRISPR/Cas 系統(tǒng)，并對其特異性進(jìn)行了不斷優(yōu)化，目前正在嘗試基于該系統(tǒng)構(gòu)建疾病臨床診斷模型（數(shù)據(jù)尚未發(fā)表）。b. 序列限制，CRISPR/Cas 系統(tǒng)設(shè)計(jì)時(shí)，gRNA 靶點(diǎn)序列必須依賴于PAM 序列，限制了檢測的靈活性，因此需要尋找更多非嚴(yán)格依賴PAM 的Cas 蛋白，以增加檢測靈活性。c. 大多數(shù)CRISPR/Cas 檢測系統(tǒng)需要進(jìn)行體外核酸擴(kuò)增，因此需要聯(lián)合傳統(tǒng)的PCR 技術(shù)和LAMP 技術(shù)等，尚無法實(shí)現(xiàn)臨床POCT 中的應(yīng)用?；谶@一問題，目前已采用CRISPR/Cas 系統(tǒng)建立了一系列無需依賴于體外核酸擴(kuò)增的核酸檢測技術(shù)，但是仍存在檢測限低等問題。目前研究者正在嘗試通過優(yōu)化體系來改善檢測極限，以提高臨床應(yīng)用。d. CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13系統(tǒng)靶向切割后，CRISPR/Cas、gRNA 和ssDNA/ssRNA 形成的三元復(fù)合物解散失去靶向切割的同時(shí)也失去了非靶向切割（附帶切割）能力，可通過優(yōu)化降低CRISPR/Cas靶向切割活性，提高非靶向切割活性，以提高檢測靈敏度。e. 目前大多數(shù)基于CRISPR/Cas系統(tǒng)建立的分子診斷平臺還無法實(shí)現(xiàn)高通量檢測，欲提高檢測通量就需要開發(fā)高通量的CRISPR/Cas分子診斷系統(tǒng)。伴隨著科技的發(fā)展，未來可將CRISPR/Cas 檢測系統(tǒng)平臺與信息技術(shù)和生物標(biāo)記技術(shù)聯(lián)合以提升檢測效率，提高檢測靈敏度和特異性，實(shí)現(xiàn)可視化檢測，高通量、POCT 等檢測能力。f. 目前基于CRISPR/Cas 建立的非核酸分子診斷系統(tǒng)的種類和數(shù)量還是很有限，很難適應(yīng)復(fù)雜多樣化的樣本類型和分子種類，因此需要進(jìn)一步完善基于CRISPR/Cas建立的非核酸分子診斷系統(tǒng)。

綜上所述，CRISPR/Cas 分子診斷傳感器作為一種新型檢測技術(shù)，無論在核酸分子診斷中還是在非核酸分子診斷中都具有廣闊的應(yīng)用前景。提高CRISPR/Cas 系統(tǒng)的分子診斷能力，將有助于更好地服務(wù)于疫情防控、生物安全監(jiān)測、食品安全檢測、環(huán)境監(jiān)測以及臨床疾病診斷等領(lǐng)域，具有重要意義。