陳 思 林昱坤 宋春燕 只 帥 李 毅 楊丹婷*

（1）寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院，浙江省病理生理學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧波 315211；2）ARC Centre of Excellence in Nanoscale Biophotonics, University of New South Wales, Sydney 2052, Australia）

CRISPR/Cas 系 統(tǒng) （clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPRassociated proteins）是由成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）和CRISPR 關(guān)聯(lián)蛋白（Cas）組成的原核適應(yīng)性免統(tǒng)系統(tǒng)，存在于大多數(shù)古菌和許多細(xì)菌中，于1987 年由Ishino 等［1］在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，2002 年被Jansen 等［2］正式命名。CRISPR/Cas系統(tǒng)作為基因編輯工具被廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域［3-4］。隨著研究者對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)特異性識(shí)別靶標(biāo)功能的深入研究，CRISPR/Cas系統(tǒng)在核酸檢測(cè)領(lǐng)域開啟了新的應(yīng)用大門。目前已發(fā)表的基于CRISPR/Cas系統(tǒng)核酸檢測(cè)的綜述［5-10］，主要圍繞其與基于熒光、電化學(xué)和比色法結(jié)合的傳感器進(jìn)行介紹，少有結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)的進(jìn)展綜述，同時(shí)缺乏針對(duì)核酸檢測(cè)系統(tǒng)中提高檢測(cè)靈敏度策略的分類、歸納和對(duì)比。基于此，本文從提高CRISPR/Cas 系統(tǒng)核酸檢測(cè)靈敏度的3 種策略（利用增加檢測(cè)靶標(biāo)量的核酸擴(kuò)增技術(shù)；利用高靈敏信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的電化學(xué)和表面增強(qiáng)拉曼光譜方法；利用傳感器的特殊結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)）入手，對(duì)基于這3種方式的CRISPR/Cas 系統(tǒng)核酸檢測(cè)生物傳感器的最新研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述、總結(jié)和評(píng)論，以期為針對(duì)核酸檢測(cè)的新一代CRISPR/Cas 生物傳感器檢測(cè)新方法的開發(fā)提供參考。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類

CRISPR/Cas系統(tǒng)可分為1類系統(tǒng)和2類系統(tǒng)兩大類群（表1）。1類系統(tǒng)包括I（Cas3）、III（Cas10）和IV（Csf1）型，由多個(gè)效應(yīng)蛋白發(fā)揮作用；2類系統(tǒng)包括II（Cas9）、V（Cas12）和VI（Cas13）型，僅需依靠單個(gè)蛋白質(zhì)發(fā)揮作用，操作簡(jiǎn)單高效，可被廣泛用于核酸檢測(cè)的生物傳感器研究［11-12］。這里對(duì)廣泛使用的3種用于核酸檢測(cè)的蛋白質(zhì)Cas9、Cas12和Cas13進(jìn)行介紹。

Cas9 蛋白是目前被研究最為廣泛的效應(yīng)蛋白（圖1a），能夠?qū)﹄p鏈DNA（double-strand DNA，dsDNA） 進(jìn)行定點(diǎn)編輯。其crRNA （CRISPR RNA） 和反式作用 crRNA （trans-activating CRISPR RNA，tracrRNA）中的重復(fù)序列雜交構(gòu)成單向?qū)NA （single guide RNA，sgRNA），與Cas9蛋白形成sgRNA-Cas9復(fù)合體。在靶標(biāo)核酸出現(xiàn)后，sgRNA-Cas9 復(fù)合體可定位到靶序列的前間隔序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）位點(diǎn)，使靶標(biāo)序列dsDNA 被部分打開，crRNA 與互補(bǔ)鏈雜交，Cas9 蛋白中的HNH（His-Asn-His）結(jié)構(gòu)域切割雜交DNA 鏈，RuvC 結(jié)構(gòu)域切割游離鏈，造成目標(biāo)DNA 的斷裂。此外，Cas9蛋白的另一種形式， 核酸酶缺陷型Cas9（deactivated Cas9，dCas9）在酶切活性失活后也具備特異性的序列結(jié)合能力［19］。兩種類型Cas9 蛋白均可用于核酸檢測(cè)的生物傳感器開發(fā)。

Fig. 1 Fundamental components of CRISPR/Cas9，CRISPR/Cas12a，CRISPR/Cas12f and CRISPR/Cas13圖1 CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a、CRISPR/Cas12f和CRISPR/Cas13結(jié)構(gòu)示意圖

Cas12蛋白包括Cas12a、Cas12b和Cas12f等10個(gè)亞型［13］。Cas12 由crRNA 和Cas12 核酸酶組成，與Cas9 不同，它只包含一個(gè)RuvC 結(jié)構(gòu)域。在crRNA 的引導(dǎo)下，Cas12a 蛋白可以利用RuvC結(jié)構(gòu)域識(shí)別PAM序列，特異性切割dsDNA或單鏈DNA（single-stranded DNA，ssDNA），同時(shí)激活非特異性的ssDNA 反式切割功能［5］（圖1b）。Cas12f（Cas14）蛋白的大小僅為目前已知的2 類Cas 蛋白的一半［20］，和Cas12a 類似，Cas12f 識(shí)別靶標(biāo)也可觸發(fā)非特異性ssDNA 反式切割活性，但其不需要PAM 激活就能夠?qū)崿F(xiàn)靶向ssDNA 的切割［12］（圖1c）。Cas12f 與ssDNA 靶標(biāo)結(jié)合的特異性比Cas12a 更高，因而更適用于開發(fā)需達(dá)到單堿基分辨率的檢測(cè)方法。例如，基于Cas12f 開發(fā)的一種單核苷酸多態(tài)性基因分型系統(tǒng)（Cas14-DETECTR），可實(shí)現(xiàn)藍(lán)眼和褐眼兩種基因的鑒別［21］。

Cas13 蛋白是一種獨(dú)特的蛋白質(zhì)，與Cas9 和Cas12 靶向DNA 不同，Cas13 僅靶向切割單鏈RNA （single strand RNA，ssRNA）［22］（圖1d）。另外，Cas13識(shí)別目標(biāo)RNA依賴的不是PAM序列，而是前間隔序列側(cè)翼位點(diǎn)（protospacer flanking site，PFS）。Cas13 有兩個(gè)通過(guò)構(gòu)象變化結(jié)合在一起的HEPN （higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide-binding）結(jié)構(gòu)域［23］，當(dāng)與Cas13 crRNA間隔區(qū)互補(bǔ)的ssRNA 序列存在時(shí)［24］，Cas13 的HEPN 結(jié)構(gòu)域則會(huì)啟動(dòng)Cas13 的順式和反式切割活性，實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)序列ssRNA 以及附近任意非特異性ssRNA 的切割［25］。Cas13a 蛋白的應(yīng)用最廣，其混雜切割RNA的能力［26］，已被開發(fā)為體外高度靈敏的核酸檢測(cè)工具。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)所具備的特異性序列識(shí)別能力，以及非特異性切割的信號(hào)擴(kuò)增特性，使其可根據(jù)不同核酸檢測(cè)需求進(jìn)行設(shè)計(jì)和選擇，在開發(fā)下一代新型生物傳感器方面具有顯著的潛力。

2 基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸檢測(cè)生物傳感器

第一個(gè)基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)的生物傳感方法是Gootenberg 課題組2017 年基于Cas13a 蛋白設(shè)計(jì)的SHERLOCK （specific high sensitivity enzymatic reporter UnLOCKing） 方法［27］，該方法利用了Cas13a 蛋白的靶向和非靶向的ssRNA 切割活性，非靶向的ssRNA 反式切割產(chǎn)生信號(hào)放大效應(yīng)［28］，可用于檢測(cè)特定的寨卡病毒和登革病毒株，區(qū)分病原菌，對(duì)人類DNA 進(jìn)行基因分型以及鑒定腫瘤DNA 突變［27］。隨著DNA 靶向效應(yīng)蛋白Cas12a 反式切割活性的發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)DNA的檢測(cè)得到了發(fā)展［29］。這一節(jié)將根據(jù)基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸檢測(cè)生物傳感器提高檢測(cè)靈敏度的3種不同策略（與增加檢測(cè)靶標(biāo)量的核酸擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)用；與電化學(xué)、表面增強(qiáng)拉曼光譜等高靈敏信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方式聯(lián)用；與特殊結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的傳感器聯(lián)用），對(duì)CRISPR/Cas 核酸檢測(cè)生物傳感器的應(yīng)用進(jìn)行分類討論。

2.1 與核酸擴(kuò)增策略聯(lián)用實(shí)現(xiàn)高靈敏度核酸檢測(cè)

常用的核酸擴(kuò)增策略諸如聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、滾動(dòng)循環(huán)擴(kuò)增（rolling circular amplification，RCA）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò) 增 （loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)（exponential amplification reaction， EXPAR） 和重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA） 等（表2）常與CRISPR/Cas系統(tǒng)結(jié)合［30］，以實(shí)現(xiàn)信號(hào)增強(qiáng)，提高檢測(cè)靈敏度。

Table 2 Nucleic acid amplification techniques-CRISPR methods表2 核酸擴(kuò)增-CRISPR方法

PCR是以母鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的催化下，以特定引物為延伸點(diǎn)，通過(guò)變性、退火、延伸等步驟復(fù)制出與母鏈DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程［31］。作為最常用的核酸擴(kuò)增方法，PCR 已被用于多種病毒和細(xì)菌的檢測(cè)。Tsou等［46］證明，將CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)與PCR 結(jié)合，可在不到3 h 的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)H1975 癌細(xì)胞基因組DNA 中兩個(gè)EGFR 雜合突變（L858R 和T790M）的檢測(cè)，用時(shí)是液滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR）的一半，可檢出的突變等位基因頻率最小值為0.005%，ddPCR 檢測(cè)限的1/10（圖2a）。Liang 等［47］通過(guò)設(shè)計(jì)PCR 引物，在靶標(biāo)突變位點(diǎn)附近引入CRISPR/Cas12a的PAM序列，可以在沒(méi)有PAM序列的情況下檢測(cè)到嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus2， SARSCoV-2）的標(biāo)志性尖峰蛋白突變。Wu等［48］開發(fā)了一種結(jié)合PCR 和Cas12a 的橫向流動(dòng)試紙條生物傳感器（lateral flow biosensor，LFB），可實(shí)現(xiàn)裸眼觀測(cè)的7 種類型非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）的同步檢測(cè)。他們首先用PCR對(duì)含有ASFV的樣品進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，然后通過(guò)crRNA的靶標(biāo)識(shí)別觸發(fā)Cas12a對(duì)ssDNA報(bào)告基團(tuán)的反式切割，導(dǎo)致報(bào)告基團(tuán)不能與LFB 檢測(cè)線上的互補(bǔ)DNA 雜交，這種效應(yīng)可通過(guò)LFB 用肉眼觀察到，方法簡(jiǎn)單。Peng 等［49］利用CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)的可編程性、序列特異性識(shí)別和高堿基分辨優(yōu)勢(shì)構(gòu)造了3個(gè)雙輸入的基本AND、OR、INHIBIT 邏輯門，利用CRISPR/Cas12a 的序列可尋址能力使該AND 邏輯門能夠準(zhǔn)確地追溯和區(qū)分輸入基因，在利用PCR進(jìn)行靶擴(kuò)增后可實(shí)現(xiàn)對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)，動(dòng)態(tài)范圍為103~107CFU/ml。Zhang等［50］利用微型熱循環(huán)儀，結(jié)合PCR 與CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)，開發(fā)出一種用于副溶血弧菌檢測(cè)的方法，該方法可達(dá)到102 拷貝/μl 的檢測(cè)靈敏度。為了減少PCR 擴(kuò)增和CRISPR/Cas 檢測(cè)兩步反應(yīng)過(guò)程中可能造成的試劑污染，Wang等［19］提出了一種使用毛細(xì)管一鍋法快速實(shí)現(xiàn)PCR 和Cas12a 酶切結(jié)合的方法，檢測(cè)可在10 min內(nèi)對(duì)最低1.28拷貝的目標(biāo)序列產(chǎn)生明亮的熒光，并可通過(guò)比色反應(yīng)實(shí)現(xiàn)裸眼檢測(cè)。盡管PCR法能夠大大提高CRISPR/Cas 系統(tǒng)的靈敏度，但利用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增需要專門的設(shè)備，昂貴的試劑、訓(xùn)練有素的人員以及較長(zhǎng)的周轉(zhuǎn)時(shí)間［31-32，51］，不利于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的應(yīng)用。為了克服以上困難，無(wú)需特殊溫度調(diào)節(jié)的等溫?cái)U(kuò)增方法諸如RCA、LAMP、RPA 等，更適用于即時(shí)檢測(cè)（point-of-care-testing，POCT）技術(shù)的開發(fā)。

Fig. 2 CRISPR/Cas combined with nucleic acid amplification technology for super sensitive nucleic acid detection圖2 CRISPR/Cas系統(tǒng)與核酸擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)用用于核酸的超靈敏檢測(cè)

RCA 是以環(huán)狀ssDNA 為模板通過(guò)一個(gè)短的DNA 引物（與部分環(huán)狀模板互補(bǔ)），在DNA 聚合酶催化下將脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphates，dNTPs）轉(zhuǎn)變成包含成百上千個(gè)重復(fù)模板互補(bǔ)片段ssDNA 的過(guò)程［44］。Wang 等［52］構(gòu)建的RCA 輔助CRISPR/Cas9 平臺(tái)能夠特異性識(shí)別RCA 擴(kuò)增長(zhǎng)鏈ssDNA，激活CRISPR/Cas9對(duì)探針信號(hào)分子的切割活性，通過(guò)記錄熒光變化實(shí)現(xiàn)恒溫下細(xì)胞外小泡（extracellular vesicle， EV） 來(lái)源的微小RNA （microRNA，miRNA）高特異性檢測(cè)（圖2b）。Xu等［37］研究出一種將雙適配體與RCA 輔助CRISPR/Cas12a 技術(shù)相結(jié)合檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的方法，兩種適配體分別用于捕獲細(xì)菌和進(jìn)行RCA 擴(kuò)增。研究表明，此方法不僅可以特異性識(shí)別細(xì)菌表面上的蛋白質(zhì)靶標(biāo)，還可以將蛋白質(zhì)識(shí)別轉(zhuǎn)化為核酸信號(hào)，獲得雙倍的核酸信號(hào)擴(kuò)增。Zhang 等［53］利用RCA 和PCR 擴(kuò)增目的基因，并通過(guò)CRISPR/Cas13a 輔助熒光讀出系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，可檢測(cè)到1 拷貝/μl 的乙肝病毒共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（hepatitis B virus covalently closed circular DNA，HBVcccDNA）。然而，與定量PCR 和液滴數(shù)字PCR方法相比，該方法對(duì)于cccDNA的定量是非線性的，需要進(jìn)一步優(yōu)化。

LAMP 使用4~6 個(gè)引物互補(bǔ)于6~8 個(gè)不同的目標(biāo)序列，可實(shí)現(xiàn)高度的靶向特異性［42］。LAMP 與CRISPR/Cas 的聯(lián)合應(yīng)用涉及多種Cas 蛋白。比如Song 等［54］開發(fā)了一種結(jié)合LAMP、CRISPR/Cas9和比色反應(yīng)的方法，Cas9 的應(yīng)用可以消除LAMP產(chǎn)物的假陽(yáng)性信號(hào)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)SARS-CoV-2及其變異基因的1 h 內(nèi)檢測(cè)，并且在136 個(gè)臨床樣本檢測(cè)的盲法實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)敏感度和特異性都能達(dá)到100%，該實(shí)驗(yàn)使用比色法，使結(jié)果可直接用裸眼觀察到，方便直觀。Wu等［55］以含有CaMV35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因大豆粉為檢測(cè)對(duì)象，將CRISPR/Cas體系直接與LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物在37℃下混合5 min，在紫外光下肉眼可清楚地識(shí)別檢測(cè)結(jié)果。同年該課題組［56］還提出了一種基于CRISPR/Cas12a 的便攜式生物傳感器（Cas12a-PB），該裝置具有3個(gè)通道和3個(gè)檢測(cè)室，將其與LAMP結(jié)合可實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆粉中CaMV35S 啟動(dòng)子和凝集素基因的熒光檢測(cè)與裸眼的雙重檢測(cè)，方便攜帶（圖2c）。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)RNA 的檢測(cè)，Wang 等［57］提出了一種結(jié)合反轉(zhuǎn)錄（reverse transcription，RT）-LAMP 和Cas12a 的SARS-CoV-2 一鍋法可視化檢測(cè)方法，可在45 min內(nèi)完成對(duì)SARS-CoV-2的檢測(cè)，并達(dá)到接近單分子水平的檢測(cè)靈敏度。Ali 等［44］開發(fā)的一種名為iSCAN的高靈敏SARS-CoV-2核酸檢測(cè)平臺(tái)，同樣可以在45 min 獲取可靠的SARS-CoV-2 陽(yáng)性信號(hào)。Mahas 等［58］識(shí)別出一種新的Cas13 變體，并將其命名為微型Cas13（miniature Cas13，mCas13），通過(guò)mCas13 與RT-LAMP 的結(jié)合，使用STOPCovid策略中的引物設(shè)計(jì)方法，可在1 h 內(nèi)檢測(cè)到低至4拷貝/μl的SARS-CoV-2。

RPA 是一種依賴于重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶實(shí)現(xiàn)的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)［33］。RPA和Cas12a 也可用來(lái)開發(fā)一鍋法檢測(cè)，與上述基于RT-LAMP 的一鍋法檢測(cè)相比，該方法用時(shí)更短，僅需5~30 min［59-60］。例如Feng 等［59］將RT、RPA和Cas12a 介導(dǎo)的檢測(cè)集成在一個(gè)試管中，實(shí)現(xiàn)了單一溫度（40°C）下的快速靈敏RNA 檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果可在紫外光下直接可視化，或通過(guò)便攜式熒光讀取器進(jìn)行半定量讀數(shù)檢測(cè)。Tsou等［31］開發(fā)了一種結(jié)合RPA、CRISPR/Cas12a 與LFB 的檢測(cè)方法，直接靶向血漿進(jìn)行循環(huán)人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）DNA 檢測(cè)，并可以通過(guò)肉眼立即讀取結(jié)果，檢測(cè)限與PCR 相同，達(dá)到0.24 fmol/L，但所需時(shí)間更短，在3 h內(nèi)就可完成。這種方法還可用于監(jiān)測(cè)和追蹤其他核酸的感染性和非感染性體液疾?。▓D2d）。RPA除去可輔助Cas12蛋白實(shí)現(xiàn)DNA檢測(cè)，還可輔助基于CRISPR/Cas13系統(tǒng)的檢測(cè)，Khan等［61］先利用RPA法對(duì)犬細(xì)小病毒2型（Canine parvovirus type 2，CPV-2）DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄與擴(kuò)增，再利用Cas13a進(jìn)行檢測(cè)，可在30 min內(nèi)達(dá)到100 amol/L的檢測(cè)靈敏度。Cao 等［62］開發(fā)了一種結(jié)合RPA、CRISPR/Cas13a 與LFB 的SARS-CoV-2檢測(cè)方法，此外，還設(shè)計(jì)了一種帶有微流控芯片的熒光分析儀，一塊芯片可同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)樣品，以實(shí)現(xiàn)高通量和快速檢測(cè)。

EXPAR 以含兩段重復(fù)序列的對(duì)稱DNA 為模板，目標(biāo)序列與模板的3'端互補(bǔ)雜交后，在聚合酶的作用下沿模板延伸；延伸出的dsDNA 被切口酶識(shí)別并切割后，在DNA 聚合酶的鏈置換作用下被釋放出來(lái)，進(jìn)一步與另一條模板的3'端進(jìn)行雜交和擴(kuò)增，形成指數(shù)形式的擴(kuò)增［63］。與其他等溫?cái)U(kuò)增方法相比，EXPAR 具有明顯的擴(kuò)增效率高、速度快的優(yōu)點(diǎn)。Huang 等［64］建立了一種CRISPR/Cas9觸發(fā)等溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)（CAS-EXPAR）新方法。該方法以CRISPR/Cas9 剪切產(chǎn)生的目的DNA 片段為引物進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生大量DNA 復(fù)制產(chǎn)物，并采用實(shí)時(shí)熒光法進(jìn)行監(jiān)測(cè)，適用于DNA、RNA 和甲基化DNA 等多種核酸檢測(cè)。Wang 等［65］建立了一種PAMmer輔助CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的G4-EXPAR （Cas-G4EX） 策略，用于ssRNA 和ssDNA的位點(diǎn)特異性檢測(cè)。CRISPR/Cas9切割目標(biāo)ssRNA 或ssDNA 產(chǎn)生的產(chǎn)物片段作為引物激活EXPAR反應(yīng)，富含G的EXPAR產(chǎn)物與氯化血紅素組裝形成G-四鏈（G4/氯化血紅素），G4/氯化血紅素催化2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）-H2O2體系產(chǎn)生鮮艷綠色，可實(shí)現(xiàn)肉眼分析（圖2e）。Hang 等［66］將無(wú)逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription-free，RTF）-EXPAR 與CRISPR/Cas12a聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)SARS-CoV-2 RNA 的超靈敏檢測(cè)，終點(diǎn)熒光讀出方式的檢測(cè)下限為3.77 amol/L（~2 拷貝/μl），智能手機(jī)輔助分析系統(tǒng)的檢測(cè)下限為4.81 amol/L（~3 拷貝/μl）。與上述結(jié)合RT-RPA和RT-LAMP 的SARS-CoV-2 檢測(cè)方法相比，該方法擁有更高的檢測(cè)靈敏度［44，59］。

2.2 結(jié)合高靈敏信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)的核酸檢測(cè)生物傳感器

2.2.1結(jié)合電化學(xué)技術(shù)的核酸檢測(cè)生物傳感器

CRISPR/Cas 體系增強(qiáng)的電化學(xué)方法被認(rèn)為是一類新型的分析生物傳感器，由于對(duì)各種生物靶標(biāo)具有基于高選擇性親和力的相互作用，因而得到廣泛應(yīng)用。CRISPR/Cas 體系與電化學(xué)的結(jié)合通常是將具有電化學(xué)活性的底物通過(guò)ssDNA 連接到電極上，CRISPR/Cas 工具切割單鏈DNA，在電化學(xué)信號(hào)中產(chǎn)生可測(cè)量的變化［67］。Xu 等［68］開發(fā)了一種CRISPR 增強(qiáng)型電化學(xué)DNA （electrochemical DNA，E-DNA）傳感器，在不需要核酸擴(kuò)增的情況下，可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)小病毒fmol/L的檢測(cè)限，創(chuàng)新性地推動(dòng)了CRISPR 生物傳感器的發(fā)展（圖3a）。Hajian 等［69］發(fā)明了一種CRISPR 增強(qiáng)型石墨烯基場(chǎng)效應(yīng)晶體管 （graphene-based field-effect transistor， gFET）， 稱為CRISPR-Chip。 這種CRISPR-Chip結(jié)合了CRISPR/Cas9的基因靶向能力和gFET 的靈敏檢測(cè)能力，可在無(wú)需核酸擴(kuò)增的情況下，達(dá)到1.7 fmol/L 的檢測(cè)靈敏度，輸出信號(hào)可以用手持閱讀器測(cè)量。Uygun 等［70］利用dCas9-sgRNA 修飾的氧化石墨烯絲網(wǎng)印刷電極（GPHOXE）作為生物識(shí)別受體，實(shí)現(xiàn)了循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）的免標(biāo)記檢測(cè)。在40 s內(nèi)，dCas9-sgRNA修飾的生物傳感器對(duì)120 bp 的ctDNA 呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，檢出范圍為2~20 nmol/L，定量限為1.92 nmol/L。對(duì)實(shí)際血樣進(jìn)行選擇性和重復(fù)性研究，回收率大于96%（圖3c）。Zamani 等［71］利用CRISPR/Cas12a 與電化學(xué)傳感器的結(jié)合，并通過(guò)LAMP 技術(shù)擴(kuò)增病毒基因， 實(shí)現(xiàn)了對(duì)人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、HPV-16、HPV-18的檢測(cè)，對(duì)于HPV-16 和HPV-18 可達(dá)到1.2×104拷貝/μl的檢測(cè)靈敏度。Liu等［72］針對(duì)無(wú)擴(kuò)增的HPV-16 DNA 設(shè)計(jì)了一種基于Cas12a 的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器，利用Cas12a 的特異性識(shí)別和反式切割能力實(shí)現(xiàn)特異性增強(qiáng)和信號(hào)放大，利用l-甲硫氨酸穩(wěn)定金納米團(tuán)簇（Met-AuNCs）作為高效電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL） 元件實(shí)現(xiàn)ECL信號(hào)轉(zhuǎn)換。這種基于Cas12a 的ECL 生物傳感器具有較高的選擇性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)未稀釋人體血液樣品HPV-16 的檢測(cè)。電化學(xué)傳感器結(jié)合靶向RNA 的Cas 酶，可實(shí)現(xiàn)對(duì)RNA 的高靈敏度檢測(cè)。Bruch等［73］介紹了一種用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的CRISPR/Cas13a驅(qū)動(dòng)微流控集成電化學(xué)生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)潛在的腫瘤標(biāo)志物miRNA-19b 和miRNA-20a 的量化。Cui 等［74］將CRISPR/Cas13a 系統(tǒng)與催化發(fā)夾組裝（catalytic hairpin assembly，CHA）相結(jié)合，開發(fā)了一種適用于miRNA-21檢測(cè)的超靈敏電化學(xué)分析方法。在miRNA-21 存在的情況下，它會(huì)與Cas13a/crRNA 雙鏈的間隔區(qū)雜交，激活CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的切割活性，導(dǎo)致CHA引發(fā)劑的釋放，兩個(gè)發(fā)夾相互雜交形成雙鏈結(jié)構(gòu)，從而使觸發(fā)器循環(huán)，使電化學(xué)信號(hào)放大百倍。此外，與適配體的聯(lián)用擴(kuò)大了基于CRISPR/Cas12a電化學(xué)傳感器的應(yīng)用范圍，可實(shí)現(xiàn)對(duì)非核酸的檢測(cè)［75-77］。

Fig. 3 CRISPR/Cas combined with signal transduction techonology biosensors for nucleic acid detection圖3 CRISPR/Cas系統(tǒng)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)聯(lián)用的核酸檢測(cè)生物傳感器

2.2.2結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)的核酸檢測(cè)生物傳感器

表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface-enhanced Raman scattering，SERS）是指當(dāng)一些分子被吸附到某些粗糙的金屬（如金、銀、銅等）表面上時(shí)，它們的拉曼散射強(qiáng)度會(huì)增加104~106倍［78］?；赟ERS 的生物傳感器可以對(duì)極少的樣品（低至幾微升）進(jìn)行檢測(cè)并展現(xiàn)出極高的靈敏度（可至單分子），目前文獻(xiàn)報(bào)道的SERS 與CRISPR/Cas 系統(tǒng)的結(jié)合主要是針對(duì)病毒及細(xì)菌的檢測(cè)。Kim 等［79］將CRISPR/dCas9 系統(tǒng)與具有SERS 活性的金包磁性納米粒子（Au coated magnetic nanoparticles，AuMNPs） 結(jié)合，開發(fā)了一種CRISPR/dCas9 介導(dǎo)的超級(jí)細(xì)菌檢測(cè)方法。利用這種方法，可以在不需要擴(kuò)增和純化核酸的條件下檢測(cè)多藥耐藥金黃色葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和肺炎克雷伯菌的基因，并可達(dá)到fmol/L級(jí)別的檢測(cè)限。該方法也提示可以通過(guò)選擇不同的CRISPR/Cas 蛋白和gRNA 實(shí)現(xiàn)其他細(xì)菌、病毒、癌癥和遺傳疾病的檢測(cè)（圖3b）。Liang等［80］開發(fā)了一種CRISPR/Cas12a結(jié)合拉曼換能器的免擴(kuò)增診斷平臺(tái)，稱為SERS-CRISPR（S-CRISPR）。使用該平臺(tái)檢測(cè)從鼻咽拭子標(biāo)本（n=112）中提取的RNA 提取液中的SARS-CoV-2 衍生核酸，可在30~40 min 內(nèi)完成。S-CRISPR 的靈敏度和特異性分別達(dá)到RT-qPCR 的87.50%和100%。Pang 等［81］結(jié)合側(cè)向流動(dòng)分析（lateral flow assay，LFA）、SERS與CRISPR/Cas12a 可直接無(wú)擴(kuò)增定量檢測(cè)HIV-1 dsDNA，檢測(cè)限為0.3 fmol/L，比傳統(tǒng)的比色LFA方法低近4個(gè)數(shù)量級(jí)。而且，基于Cas12a的靶點(diǎn)特異性，HIV-1單基因耐藥突變（M184V）的識(shí)別率最低可達(dá)0.01%。Yin 等［82］設(shè)計(jì)了一種DNA/RNA嵌合發(fā)夾探針，并將其引入CRISPR/Cas12a/SERS集成系統(tǒng)中，該系統(tǒng)的SERS探針用AuNPs作為核心，包裹著4-巰基苯甲酸的AuNPs 通過(guò)部分互補(bǔ)的DNA 對(duì)（DNA1/DNA2）連接在其周圍。在靶DNA 存在的情況下，CRISPR/Cas12a 被激活，立即切割發(fā)夾探針釋放大量RNA，釋放的RNA 與DNA1完全互補(bǔ)，導(dǎo)致連接DNA2的周圍AuNPs從核心AuNPs表面分離出來(lái)，以產(chǎn)生SERS信號(hào)的變化，用于超靈敏、高選擇性和無(wú)擴(kuò)增的核酸檢測(cè)。

此外，將SERS的高靈敏度檢測(cè)能力與核酸擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，可達(dá)到更低檢測(cè)限。比如Liu等［83］提出了一種將CRISPR/Cas12a、LAMP 與SERS 相結(jié)合的核酸檢測(cè)策略，該策略利用CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的反式切割活性來(lái)捕獲負(fù)載4-硝基硫苯酚（4-nitrothiophenol，4-NTP）和半胱氨酸兩種信號(hào)分子的脂質(zhì)體，可以實(shí)現(xiàn)SERS 和肉眼對(duì)靶DNA的雙重檢測(cè)，并分別檢測(cè)到低至100 amol/L 和10 pmol/L 的SERS 和可視化信號(hào)（圖3d）。Pan等［84］將普魯士藍(lán)納米顆粒（prussian blue nanoparticles，PB NPs）修飾的ssDNA 探針固定在微孔板上，LAMP擴(kuò)增后靶標(biāo)識(shí)別激活的CRISPR/Cas12a 反式切割能夠移除部分PB NPs，對(duì)剩余的PB NPs 進(jìn)行堿處理可生成能產(chǎn)生特征拉曼峰的鐵氰化物陰離子（Fe（CN）64-）。通過(guò)這種方法，能夠達(dá)到對(duì)牛奶DNA 的224 amol/L 檢測(cè)限。Zhuang等［85］結(jié)合CRISPR/Cas12a、SERS 與RPA 擴(kuò)增技術(shù)，設(shè)計(jì)了一種微流控紙質(zhì)分析儀（μPAD），簡(jiǎn)稱RPA-Cas12a-μPAD。這種分析儀可實(shí)現(xiàn)對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的高靈敏度檢測(cè)，能夠在45 min 內(nèi)達(dá)到3~4 CFU/ml的檢測(cè)限。

2.3 利用傳感器特殊結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)提高核酸檢測(cè)靈敏度

除了上述兩種方法，還有一部分研究是通過(guò)結(jié)合特殊設(shè)計(jì)的傳感器（包括利用信號(hào)轉(zhuǎn)化中的特殊結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和結(jié)合一些非常規(guī)的輔助檢測(cè)設(shè)備）以達(dá)到很高的檢測(cè)靈敏度。信號(hào)轉(zhuǎn)化中的特殊設(shè)計(jì)包括利用毛細(xì)管、微流控、微陣列等結(jié)構(gòu)放大反應(yīng)產(chǎn)生的效應(yīng)，從而增大檢測(cè)的靈敏度。比如Hass 等［86］設(shè)計(jì)的全集成微柱聚二甲基硅氧烷CRISPR 檢測(cè)（IMPACT） 系統(tǒng)用于ASFV DNA 的檢測(cè)。將CRISPR/Cas12a-crRNA 復(fù)合物注入經(jīng)過(guò)表面修飾和探針固定化的全封閉高縱橫比微柱通道，這種微柱通道對(duì)ssDNA 報(bào)告基團(tuán)具有強(qiáng)結(jié)合力，當(dāng)靶標(biāo)存在時(shí)，Cas12a 酶被激活并切割微柱上的ssDNA報(bào)告基團(tuán)，產(chǎn)生熒光信號(hào)的變化，其強(qiáng)度與靶標(biāo)濃度成線性比例。該系統(tǒng)能夠在120 min 內(nèi)靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)DNA。對(duì)于輔助檢測(cè)設(shè)備的應(yīng)用，Hu等［87］開發(fā)了一種基于DNA 模板化銅納米粒子（copper nanoparticles，Cu NPs）和CRISPR/Cas9 的免標(biāo)記檢測(cè)方法，該方法使用電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICPMS）識(shí)別靶標(biāo)poly（AT-TA）處合成的Cu NPs并進(jìn)行分析。ICPMS具有萬(wàn)億分之一級(jí)的靈敏度、9個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)范圍以及可追溯到初級(jí)SI單位的準(zhǔn)確定量能力，可實(shí)現(xiàn)單堿基突變的快速靈敏檢測(cè)（圖4a）。Katzmeier 等［26］設(shè)計(jì)了一種基于Cas13a的體外轉(zhuǎn)錄和核酸檢測(cè)低成本微型熒光閱讀器，該傳感器使用扁平墨盒來(lái)最大限度地收集發(fā)射光，使用經(jīng)濟(jì)高效的硫化鎘光敏電阻作為光傳感器，并建立了一套校準(zhǔn)程序，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)RNA 的序列特異性檢測(cè)，檢測(cè)限為3.7 nmol/L（圖4b）。利用DNA探針與納米粒子的特殊交聯(lián)，并將其與CRISPR/Cas系統(tǒng)的反式切割活性結(jié)合，也可以得到令人驚喜的效果，比如Yu等［88］和Choi等［89］用這種模式設(shè)計(jì)的傳感器可分別達(dá)到0.34 fmol/L和3.1×10-5U/ml的檢測(cè)靈敏度。

Fig. 4 CRISPR/Cas combined with specially designed sensors for super sensitive nucleic acid detection圖4 CRISPR/Cas系統(tǒng)與特殊設(shè)計(jì)傳感器聯(lián)用以實(shí)現(xiàn)超靈敏核酸檢測(cè)

表3列出了本文中提到的核酸檢測(cè)生物傳感器的具體信息（包括提高靈敏度最主要方式、效應(yīng)蛋白、檢測(cè)限、核酸擴(kuò)增時(shí)間、信號(hào)輸出時(shí)間、傳感器類型與信號(hào)讀出系統(tǒng)、靶標(biāo)類型以及檢測(cè)樣品等）。

Table 3 CRISPR/Cas biosensors based on different technologies表3 結(jié)合不同策略的CRISPR/Cas核酸檢測(cè)生物傳感器

3 總結(jié)與展望

作為當(dāng)下最常用的基因編輯工具，CRISPR/Cas系統(tǒng)因其可編程性和高度的特異性被廣泛用于新品種培育、基因通路研究、基因藥物研制以及核酸檢測(cè)等領(lǐng)域，并取得了巨大的成功［90］。基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)的核酸檢測(cè)生物傳感器具有高靈敏度、高選擇性、低成本、快速及操作簡(jiǎn)單等顯著優(yōu)勢(shì)，在感染性病原體的核酸檢測(cè)［44，47，57，80］和蛋白質(zhì)小分子等非核酸檢測(cè)［91-93］顯示出其巨大潛力。除了本文重點(diǎn)介紹的Cas9、Cas12 和Cas13 蛋白，基于Cas10 的研究也取得了一定的進(jìn)展。與前3 種系統(tǒng)不同的是，CRISPR/Cas10 的結(jié)構(gòu)是由多個(gè)蛋白質(zhì)亞基結(jié)合在crRNA上形成的核酸蛋白復(fù)合物，既能降解RNA 又能降解DNA［94］。Santiago-Frangos 等［95］結(jié)合RT-LAMP、T7 轉(zhuǎn)錄與CRISPR/Cas10，建立了一種靶向SARS-CoV-2 的高靈敏度檢測(cè)方法，可通過(guò)熒光法、比色反應(yīng)和裸眼檢測(cè)3種方法觀察到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。目前基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)的綜述多集中在對(duì)CRISPR-Cas9、-Cas12、-Cas13 的介紹與應(yīng)用，但相信隨著CRISPR/Cas10優(yōu)勢(shì)的不斷發(fā)掘，會(huì)有更多基于其的應(yīng)用得到發(fā)展。

所有的CRISPR/Cas 系統(tǒng)都可以在溫和的條件下，在短時(shí)間內(nèi)被編程并用于核酸的高特異性CRISPR/Cas檢測(cè)，這是基于CRISPR/Cas的核酸檢測(cè)工具最突出的優(yōu)勢(shì)［90］。核酸擴(kuò)增是核酸檢測(cè)的首要步驟，在核酸擴(kuò)增后引入CRISPR/Cas 系統(tǒng)，可以提高檢測(cè)的特異性［23］。然而在大部分核酸擴(kuò)增的溫度下，CRISPR/Cas系統(tǒng)的活性會(huì)大大降低，因而需要分步反應(yīng)，從而增加了檢測(cè)的時(shí)間和工作量。而CRISPR/Cas 系統(tǒng)與電化學(xué)和表面增強(qiáng)拉曼光譜等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)策略或與靈敏的檢測(cè)儀器結(jié)合可以省去繁瑣的擴(kuò)增步驟，對(duì)核酸進(jìn)行直接檢測(cè)，具有快速、高靈敏度、高特異性和低成本等優(yōu)點(diǎn)。除此之外，基于CRISPR/Cas 的診斷工具還存在一系列挑戰(zhàn)：Cas蛋白切割的脫靶效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致非靶標(biāo)序列切割從而產(chǎn)生錯(cuò)誤的信號(hào)；依賴于PAM 序列的識(shí)別導(dǎo)致潛在靶標(biāo)序列有限，雖通過(guò)使用特定設(shè)計(jì)的引物來(lái)引入PAM，可以消除序列限制，但不能用于無(wú)擴(kuò)增檢測(cè)［29，96］；基于CRISPR/Cas的核酸定量檢測(cè)依賴于復(fù)雜的儀器設(shè)備從而限制了其廣泛應(yīng)用；Cas蛋白的反式切割導(dǎo)致多路復(fù)用困難［97］，等等。因此，著重解決以上問(wèn)題，并與可視化的信號(hào)讀取方法相結(jié)合實(shí)現(xiàn)定量及多重檢測(cè)，CRISPR/Cas系統(tǒng)必將作為核酸檢測(cè)的有力工具，為人類疾病的診斷事業(yè)做出貢獻(xiàn)。