張玉玲,張 超,蔣喚喚,梁峰豪,肖華貴,曾 兵,2*

(1 貴州省農業(yè)科學院 貴州省油料研究所,貴陽 550006;2 貴州金瑞農業(yè)科技有限公司,貴陽 550006)

組蛋白N末端尾部含有乙?；?、泛素化、甲基化、磷酸化、糖基化和羰基化等翻譯后修飾位點[1-2],而組蛋白乙?；茄芯孔钌钊氲姆g后修飾之一,目前主要集中于組蛋白乙?；瘷C制和功能的研究[3-4]。乙?；峭ㄟ^組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferase,HAT)和組蛋白去乙?；?histone deacetylases,HDAC)實現(xiàn)活性轉化[4]。前人基于序列相似性和輔因子依賴性,將真核生物中HDAC基因家族分為RPD3/HDA1(reduced potassium dependency 3/histone deacetylase 1)、HD2(histone deacetylase 2)和SIR2(slent information regulator 2)3個亞家族,其中RPD3/HDA1亞家族需要Zn2+催化活性來發(fā)揮功能[5-7]。

RPD3/HDA1作為HDAC基因家族最大的亞家族,在植物開花及逆境脅迫響應中的功能被廣泛研究[8]。在擬南芥中,AtHDA9基因在短日照條件下通過抑制光周期響應基因AGL19(Agamouslike19)的表達來調控開花時間,而hda9突變體則提高AGL19基因的組蛋白H3K9和H3K27乙?；蕉怪参锉憩F(xiàn)出早花[9]。同樣,AtHDA6基因通過下調DNA去甲基化水平調控開花抑制基因FLC(FLOWERINGLOCUSC)的乙酰化水平,其表達量降低,促進擬南芥開花,而其突變體開花延遲[10]。此外,AtHDA5也可以抑制FLC和MAF1基因的表達,從而促進開花,其hda5-1突變體中FLC和MAF1的組蛋白H3乙酰化水平增加[11]。更重要的是,研究發(fā)現(xiàn)AtHDA6、AtHDA5可能與FLC和FVE形成蛋白復合體,通過多種方式改變組蛋白乙?；?來調控植物開花[11-12]。RPD3/HDA1家族成員除了參與植物開花調控,在逆境脅迫中也具有重要作用。學者發(fā)現(xiàn)AtHDA6基因在低溫脅迫72 h時表達水平顯著上調,推測該基因可能在低溫脅迫中發(fā)揮重要作用[13]。在水稻中,HDA705基因表達能被茉莉酸甲酯(MeJA)誘導,而且水楊酸(SA)和脫落酸(ABA)也能顯著誘導HDA702和HDA704基因表達[14-15]。以上研究結果表明RPD3/HDA1基因家族在植物開花及逆境脅迫反應中具有至關重要的作用。

目前,已在不同植物中鑒定到數(shù)量不同的RPD3/HDA1家族成員,包括番茄(15)[1]、棉花(18)[16]、擬南芥(10)[16]、水稻(14)[16]、玉米(11)[16]、大豆(28)[17]和白菜型油菜(15)[18]。然而,在甘藍型油菜(BrassicanapusL.)中尚未進行系統(tǒng)的研究。甘藍型油菜是主要的油料作物之一,每年為全球提供食用植物油總量的13%～16%[19-20]。長江流域作為冬油菜主產區(qū),種植面積約占中國油菜種植總面積的85%[21],兩季作物輪作是該地區(qū)的主要種植模式,而該模式下兩季作物茬口矛盾顯得尤為突出,為了緩解這一矛盾,早熟性狀成為油菜理論研究和品種選育的關鍵性狀[22]。早熟性狀與開花時間緊密相關,而RPD3/HDA1基因家族被報道參與調控植物開花及逆境脅迫的響應[8,23]。因此,有必要探討RPD3/HDA1基因在甘藍型油菜中的潛在功能。本研究通過生物學信息學方法鑒定BnRPD3/BnHDA1基因家族,并對其蛋白理化特性、系統(tǒng)發(fā)育樹、基因結構、基因復制事件、順式作用元件、不同組織部位表達譜和低溫、ABA脅迫下的表達進行了全面分析,為進一步研究RPD3/HDA1基因在甘藍型油菜生長發(fā)育及脅迫響應中的潛在功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 植物材料及處理

甘藍型油菜‘黔油早2號’由貴州省油料研究所選育,平均生育期為190.07 d,屬于早熟品種?！须p11’平均生育期為233.5 d,為中晚熟品種。研究以‘黔油早2號’和‘中雙11’品種為試驗材料,選取籽粒飽滿的種子置于濕潤的培養(yǎng)皿中,待2片子葉完全展開,移栽于土壤(基質∶土壤=3∶1)中,在室外條件下生長至4葉期,分別對2個品種進行脅迫處理。激素處理:使用100 μmol/L ABA對甘藍型油菜進行噴施,分別于0,1,3,6,12,24 h采集葉片[24]。低溫處理:將4葉期油菜置于4 ℃低溫培養(yǎng)箱(光照/黑暗為16 h/8 h),分別于0,3,6,12,24,48,72 h收集葉片[25]。以上每個樣品均為3個重復。

1.2 方 法

1.2.1 甘藍型油菜RPD3/HDA1家族成員鑒定及理化特性預測為了鑒定BnRPD3/BnHDA1基因,在甘藍型油菜全基因組(Brana_ZS_HZAU_V1.0/)(http://brassicadb.cn/#/Download/)中通過Blastp和HMMER 2種方法搜索可能的該家族成員。首先,下載擬南芥和水稻的RPD3/HDA1蛋白序列,將其比對到甘藍型油菜蛋白數(shù)據(jù)庫,閾值E<1×10-10。接著,從Pfam(https://pfam.xfam.org/)數(shù)據(jù)庫下載Hist_cetyl結構域(PF00850)的隱馬爾可夫模型(HMM)文件,利用HMMER 3.0軟件在甘藍型油菜蛋白數(shù)據(jù)庫中搜索BnRPD3/BnHDA1,閾值為E<1×10-5。最后,整合2種方法得到BnRPD3/BnHDA1候選基因。將候選基因蛋白序列提交至Pfam和NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)網(wǎng)站驗證保守結構域。在ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)數(shù)據(jù)庫中對該家族基因編碼的氨基酸數(shù)目、蛋白分子量、等電點和不穩(wěn)定系數(shù)等物理化學特性進行預測分析。

1.2.2 RPD3/HDA1家族系統(tǒng)進化樹下載擬南芥和甘藍型油菜RPD3/HDA1氨基酸序列全長,利用Clustal X軟件進行多序列比對,隨后使用MEGA7.0軟件構建系統(tǒng)進化樹,Bootstrap值設置為1 000,并通過在線軟件EvolView(https://evolgenius.info//evolview-v2/#mytrees/AS/ASD)對進化樹進行可視化。

1.2.3 甘藍型油菜RPD3/HDA1基因結構、基因復制事件和順式作用元件預測根據(jù)甘藍型油菜基因組的注釋文件(GFF3)提取該家族基因的外顯子和內含子等結構信息,使用TBtools軟件繪制基因結構圖[26]。利用MCScanX(http://chibba.pgml.uga.edu/mcscan2/)軟件獲取BnRPD3/BnHDA1基因家族的片段重復和串聯(lián)重復基因,使用Circos軟件呈現(xiàn)該家族基因復制事件。使用TBtools軟件截取BnRPD3/BnHDA1基因起始密碼子上游2 kb的啟動子序列,將其提交至PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/) 在線網(wǎng)站預測順式作用元件種類及數(shù)目。通過GSDS 2.0(http://gsds.gao-lab.org/)網(wǎng)站中對其順式作用元件進行可視化。

1.2.4 甘藍型油菜RPD3/HDA1基因不同組織部位的表達為了全面了解甘藍型油菜RPD3/HDA1基因在不同組織部位的表達情況,從BnIR(http://yanglab.hzau.edu.cn/BnIR/expression_zs11)數(shù)據(jù)庫下載了該家族基因在根、莖、葉、花、子葉、萼片和蕾中的RNA-seq數(shù)據(jù),使用TBtools軟件繪制熱圖。

1.2.5 RNA提取及qRT-PCR采用SteadyPure Plant RNA Extraction Kit(AG21019,艾科瑞)試劑盒提取低溫和ABA處理前后‘黔油早2號’及‘中雙11’葉片的RNA,使用微量紫外分光光度計檢測RNA的濃度與質量。

利用EvoM-MLV反轉錄預混型試劑盒(AG11728,艾科瑞)將RNA反轉為第一鏈cDNA,保存于-20 ℃。采用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒(Q711-02,諾唯贊)進行qRT-PCR,按照試劑盒說明書配制反應體系,以Bnactin7 為內參基因。qRT-PCR程序如下:95 ℃預變性30 s,95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,循環(huán)數(shù)為40。每個處理設3個生物學重復和3個技術重復,采用2-ΔΔCT方法計算基因相對表達量[27]。通過Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理分析,使用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析(P<0.05)。qRT-PCR中使用的所有引物列于表1中。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

2 結果與分析

2.1 甘藍型油菜RPD3/HDA1基因家族成員鑒定及理化特性預測

在甘藍型油菜全基因組中共篩選到28個具有完整保守結構域的RPD3/HDA1基因,該家族成員的理化特性分析結果見表2。

表2 甘藍型油菜RPD3/HDA1基因家族成員編碼氨基酸數(shù)目、蛋白理化特性及基因位置Table 2 Number of amino acids encoded by RPD3/HDA1 gene family members, physical and chemical characteristics of protein and gene location in Brassica napus

由表2可知,其編碼氨基酸數(shù)目變化幅度較大,在363 aa(BnHDA13)～675 aa(BnHDA5)之間不等,蛋白分子量在40.89 kD(BnHDA13)到74.98 kD(BnHDA5)之間,平均為53.04 kD。等電點范圍為4.94(BnHDA28)至8.71(BnHDA18),小于7(除BnHDA10、BnHDA18),92.85%的BnRPD3/BnHDA1屬于酸性蛋白,說明大部分BnRPD3/BnHDA1蛋白可能在酸性環(huán)境中發(fā)揮作用。不穩(wěn)定系數(shù)系數(shù)介于26.05～43.24之間,為穩(wěn)定型蛋白(除BnHDA6、BnHDA11、BnHDA14、BnHDA19和BnHDA28)。

2.2 RPD3/HDA1家族系統(tǒng)進化樹及基因結構

采用鄰接法構建甘藍型油菜和擬南芥2個物種RPD3/HDA1家族成員(圖1)及單獨的甘藍型油菜該家族成員(圖2,A)的系統(tǒng)發(fā)育樹。依據(jù)ZHANG等[16]的分類方法將甘藍型油菜RPD3/HDA1家族成員分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 4個亞家族,其中13個成員分布于Ⅰ亞家族,11個成員在Ⅱ亞家族,Ⅲ亞家族和Ⅳ亞家族中均含有2個成員。在甘藍型油菜的多倍體化過程中,BnRPD3/BnHDA1不同亞家族基因數(shù)量存在差異,可能經歷了基因擴增和丟失。此外,BnHDA9和BnHDA20與AtHDA3蛋白高度同源,說明它們可能具有相似或相同的功能。

圖1 擬南芥(At)和甘藍型(Bn)油菜RPD3/HDA1家族成員系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of RPD3/HDA1 family members in Arabidopsis (At) and Brassica napus (Bn)

圖2 甘藍型油菜RPD3/HDA1基因結構Fig.2 RPD3/HDA1 gene structures of Brassica napus

基因結構決定基因功能,為了明確甘藍型油菜RPD3/HDA1家族成員的生物學功能,對其基因結構進行分析。結果(圖2,B)表明該家族成員外顯子數(shù)量在3～17之間,不同亞家族成員的外顯子數(shù)量存在差異,其中Ⅳ亞家族基因均含有3個外顯子,外顯子數(shù)量最少,而Ⅱ亞家族的外顯子數(shù)量較多(8～10),這可能與其功能的多樣化有關。但同一亞家族成員具有相似的外顯子/內含子結構模式,推測同一亞家族成員可能是通過基因復制產生。

2.3 甘藍型油菜RPD3/HDA1基因重復事件分析

基因重復是基因組進化和基因家族擴展的主要驅動力之一[28]。全基因組復制、片段復制和串聯(lián)復制是植物基因家族擴張的主要原因[29]?；蚝突蚪M復制使基因數(shù)量增加,從而基因功能冗余和分化,使基因組能夠在進化過程中不斷適應環(huán)境的影響[28-29]。

因此,為了闡明BnRPD3/BnHDA1基因家族擴張的機制及解析基因功能,對其進行復制基因分析(圖3)。在該家族中共檢測到16對復制基因,均為片段復制,表明BnRPD3/BnHDA1基因家族主要通過基因復制實現(xiàn)基因數(shù)量的增加,而片段重復是該家族進化的主要驅動力。

圖3 甘藍型油菜RPD3/HDA1復制基因Fig.3 RPD3/HDA1 replication genes in Brassica napus

2.4 甘藍型油菜RPD3/HDA1基因順式作用元件預測

順式作用元件在啟動基因表達中起關鍵作用。為此,對BnRPD3/BnHDA1家族成員ATG上游2 kb啟動子區(qū)的順式作用元件進行預測統(tǒng)計。結果(圖4)顯示:該家族中共有675個元件與植物激素、環(huán)境脅迫和光響應相關,其中與光響應有關的順式作用元件最多,表明可能參與光有關的植物生長發(fā)育過程;其次含有大量與激素有關的元件,包括MeJA、ABA、生長素(IAA)、赤霉素(GA)和SA等。低溫和干旱等環(huán)境脅迫有關的元件在BnRPD3/BnHDA1基因中也被確定,說明基因家族成員可能參與干旱和低溫有關的信號途徑。以上研究表明BnRPD3/BnHDA1基因可能通過激素信號通路和防御信號通路參與油菜的生長發(fā)育和防御反應的調節(jié)。

圖4 甘藍型油菜RPD3/HDA1基因順式作用元件Fig.4 Cis-acting elements in RPD3/HDA1 genes of Brassica napus

2.5 甘藍型油菜RPD3/HDA1基因不同組織部位表達

為了揭示甘藍型油菜RPD3/HDA1基因在不同組織部位的表達模式,從BnIR網(wǎng)站下載該家族基因的RNA-seq數(shù)據(jù),同時繪制熱圖(圖5)。結果顯示:BnRPD3/BnHDA1基因在不同組織部位的表達存在差異,在葉片中表達量相對較高,其中BnHDA2、BnHDA13和BnHDA17在葉片中呈現(xiàn)高表達,而BnHDA3、BnHDA18和BnHDA25基本不表達;BnHDA2和BnHDA17在根中大量表達,而BnHDA7不表達。特別的是,BnHDA17在蕾中的表達量非常高,暗示可能在蕾中發(fā)揮功能;BnHDA27在花和萼片中大量表達,猜測可能參與植物花發(fā)育。以上研究結果表明BnRPD3/BnHDA1家族基因可能存在基因功能分化。

圖5 甘藍型油菜RPD3/HDA1基因不同組織部位表達模式Fig.5 Expression patterns of RPD3/HDA1 genes in different tissue parts of Brassica napus

2.6 不同品種甘藍型油菜RPD3/HDA1基因表達

為了檢測RPD3/HDA1基因在‘黔油早2號’和‘中雙11’中的表達差異,根據(jù)該家族基因含有的順式作用元件及不同組織部位的RNA-seq數(shù)據(jù)選取8個基因進行試驗。

qRT-PCR結果(圖6)顯示:‘黔油早2號’中BnHDA1、BnHDA2、BnHDA9、BnHDA13、BnHDA19、BnHDA21、BnHDA23、BnHDA28基因的表達量分別是‘中雙11’對應基因的1.31,2.06,3.41,1.88,1.37,2.67,2.44,1.80倍,該家族基因在早熟品種‘黔油早2號’中的表達量均高于在中晚熟品種‘中雙11’中的表達量,推測該家族基因可能參與油菜早熟性狀的調控。

圖中小寫字母表示同一品種中不同基因間在0.05水平上差異顯著。下同。圖6 甘藍型油菜RPD3/HDA1基因在不同品種中的表達分析The lowercase letters in the figure indicate significant difference at the 0.05 level between different genes in the same variety. The same as below.Fig.6 Expression analysis of RPD3/HDA1 genes in different varieties of Brassica napus

2.7 不同脅迫條件下甘藍型油菜RPD3/HDA1基因表達

2.7.1 低溫脅迫下的表達為了探究BnRPD3/BnHDA1基因在低溫脅迫下的響應情況,利用qRT-PCR檢測8個BnRPD3/BnHDA1基因在‘黔油早2號’和‘中雙11’中的表達量。

結果(圖7)表明:在‘黔油早2號’中,BnHDA1、BnHDA9、BnHDA13、BnHDA21和BnHDA23基因在受到低溫脅迫后表達量降低,且顯著低于0 h表達水平;BnHDA2、BnHDA19和BnHDA28基因表達量達到峰值的時間存在差異,如BnHDA28在脅迫72 h時表達量最高,顯著高于0 h。特別的是,BnHDA13和BnHDA23隨著處理時間的遞增表達量依次降低,說明它們對冷脅迫具有響應。在‘中雙11’中,BnHDA9、BnHDA13、BnHDA19、BnHDA23和BnHDA21基因均在脅迫3 h時表達量最高;BnHDA1基因在冷處理后表達量下調,且處理后各個時間點的表達水平均低于0 h,而BnHDA2基因在脅迫后表達量上調,且顯著高于0 h。綜上可知,BnRPD3/BnHDA1基因家族參與冷脅迫的響應,但2個品種中表達模式存在差異。

圖7 甘藍型油菜RPD3/HDA1基因冷脅迫(4 ℃)下的表達模式Fig.7 Expression patterns of RPD3/HDA1 genes in Brassica napus under cold stress (4 ℃)

2.7.2 ABA脅迫下的表達qRT-PCR檢測了8個BnRPD3/BnHDA1基因在ABA脅迫后的表達水平(圖8)。結果顯示:‘黔油早2號’中BnHDA1、BnHDA2和BnHDA19基因在受到ABA脅迫后表達量降低,而其他5個BnRPD3/BnHDA1基因在ABA處理后表達量到達峰值的時間不一致,其中BnHDA13和BnHDA28基因在脅迫1 h時表達量達到峰值,分別是0 h的1.09和1.42倍;BnHDA9、BnHDA21和BnHDA23基因在處理6 h時表達量最高,分別是0 h的2.45,1.07,1.35倍。

圖8 甘藍型油菜RPD3/HDA1基因在ABA脅迫下的表達模式Fig.8 Expression patterns of RPD3/HDA1 genes in Brassica napus under ABA stress

在‘中雙11’中,BnHDA1、BnHDA2、BnHDA9、BnHDA13、BnHDA19、BnHDA21和BnHDA28在ABA脅迫后表達量均下調,且在各處理時間點的表達量均低于0 h。BnHDA23僅在脅迫后1 和12 h稍高于0 h,說明在‘中雙11’中該基因家族成員在激素信號途徑中可能具有調控作用。綜上所述,‘黔油早2號’和‘中雙11’中RPD3/HDA1基因在ABA處理后表達水平隨著處理時間的遞增上調或下調,說明該家族基因能對ABA脅迫做出響應。

3 討 論

RPD3/HDA1基因家族是調控植物開花重要家族之一[8],該家族成員之間通過協(xié)同調節(jié)基因表達,以多種方式改變組蛋白乙?；?抑制FLC基因的表達使植物早花[11-12]。植物開花受到多種因素的影響,其中低溫是誘導植物由營養(yǎng)生長轉向生殖生長的重要環(huán)境信號,合理低溫能夠加快植物開花進程,提高開花產量與品質[30]。郝蓬勃[31]指出植物在未受低溫脅迫時FLC大量表達,抑制花芽分化;而長時間低溫處理后卻抑制了FLC基因的表達,促進花芽分化。此外,低溫條件下能誘導ABA積累[32],而外源ABA能有效地減輕冷脅迫帶來的傷害[33]。但ABA被認為是植物成花起始的抑制因子,其信號因子ABI4和ABI5能與FLC基因啟動子中的ABRE/G-box元件結合促進FLC基因的轉錄,從而延遲植物開花[34-35]。研究人員發(fā)現(xiàn)越早熟的油菜品種在花芽分化期間ABA含量越低,表明低含量的ABA與油菜早熟關系密切[36]。因此,本研究以早熟品種‘黔油早2號’和中晚熟品種‘中雙11’為試驗材料,來探究冷和ABA脅迫對油菜早熟的影響,以期挖掘到RPD3/HDA1基因家族中調控油菜開花的基因。

本研究在甘藍型油菜中共鑒定到28個RPD3/HDA1基因,聚類為4個亞家族,不同亞家族基因數(shù)量存在差異。由于植物雜交或染色體加倍后基因組序列重排會發(fā)生基因丟失[37]。因此,猜測甘藍和白菜雜交、加倍過程中可能發(fā)生了該家族亞家族基因丟失。甘藍型油菜RPD3/HDA1家族除了不同亞家族基因數(shù)量不同以外,其不同亞家族成員的外顯子/內含子數(shù)量也存在差異。據(jù)報道,基因組中轉座子元件會使染色體序列發(fā)生重排,從而影響基因結構,包括缺失、反轉和易位[38],而外顯子/內含子的獲得或丟失會使基因結構和功能存在差異[39-40]。因此,甘藍型油菜RPD3/HDA1基因外顯子/內含子在進化中發(fā)生丟失,可能會使基因功能改變。

本研究采用qRT-PCR方法比較了‘黔油早2號’和‘中雙11’中RPD3/HDA1基因的表達水平,發(fā)現(xiàn)該家族基因在‘黔油早2號’中的表達量高于‘中雙11’,這一結果與張晶晶[41]在早熟棉花中的研究結果一致,暗示BnRPD3/BnHDA1家族基因可能參與油菜早熟性狀的調控。HU等[42]發(fā)現(xiàn)玉米RPD3/HDA1基因受到低溫脅迫后表達水平上調,導致H3和H4組蛋白完全去乙?；?。然而,‘黔油早2號’中BnHDA1、BnHDA9、BnHDA13、BnHDA21和BnHDA23基因受到低溫脅迫后表達量降低,‘中雙11’中僅BnHDA1基因的表達量下調,表明不同植物及不同的取樣時間可能使該基因家族植物冷脅迫中發(fā)揮不同的調控作用。此外,低溫能夠加快植物由營養(yǎng)生長轉向生殖生長,促使植物早花[43]?！驮?號’具有早花的特性,受到冷脅迫后‘黔油早2號’較‘中雙11’中大部分RPD3/HDA1基因表達量下調幅度大,這可能與該材料早花早熟特性有關。ABA作為植物重要的激素,被認為是一種開花抑制因子,延遲植物開花[34]。ABA處理后RPD3/HDA1基因的表達量在‘黔油早2號’中的下調幅度大于‘中雙11’,說明ABA能抑制RPD3/HDA1基因的表達,且在‘黔油早2號’中抑制程度較大,表明RPD3/HDA1基因經ABA處理后可能在油菜開花中發(fā)揮調節(jié)作用,但具體的調控機制還需進一步研究。

綜上所述,本研究借助生物信息學方法對甘藍型油菜RPD3/HDA1基因家族進行全面鑒定,并明確了該家族基因在低溫和ABA處理后的表達模式,進一步豐富了對油菜響應逆境脅迫應答機制的認識,也為早熟油菜抗逆性遺傳改良提供了理論基礎和候選基因。