廖端芳，張佳，盧光明，李凱

〔摘要〕 70年前，隨著DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)，人類進(jìn)入基因組時(shí)代；21世紀(jì)初，人類基因組測(cè)序完成及對(duì)轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和表觀遺傳的研究，人類繼而進(jìn)入后基因組時(shí)代；近年對(duì)DNA甲基化的深入研究，預(yù)示更為神秘寬廣的表觀遺傳組學(xué)時(shí)代已經(jīng)到來(lái)。人體血液中大量存在的甲基化DNA構(gòu)成甲基化譜，作為一個(gè)整合性指標(biāo)，有如一曲流淌的生命脈律，反映不同細(xì)胞的生理或病理狀態(tài)。精準(zhǔn)分析甲基化譜，具有診斷疾病特別是腫瘤早篩早診的價(jià)值；同時(shí)可作為人類健康、乃至天賦的量化評(píng)估指標(biāo)；也可用于中醫(yī)體質(zhì)辨識(shí)與證型分類及中藥材溯源、真?zhèn)巫R(shí)別和品種改良。本文介紹表觀遺傳組學(xué)時(shí)代甲基化譜的重要意義，以紀(jì)念DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)70周年。

〔關(guān)鍵詞〕 DNA甲基化；甲基化譜；游離核酸；表觀遺傳；腫瘤早篩

〔中圖分類號(hào)〕R2? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.07.026

DNA methylation profile， the flowing melody of life：

Marking the 70th anniversary of discovering DNA double helix

LIAO Duanfang1，2， ZHANG Jia1， LU Guangming3， LI Kai1，2*

1. National Engineering Research Center of Personalized Diagnostic and Therapeutic Technology， Hunan University of

Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Key Laboratory for Quality Evaluation of Bulk Herbs of Hunan

Province， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. General Hospital of Eastern

Theater Command， Jinling Hospital of Nanjing University， Nanjing， Jiangsu 210016， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Seven decades ago， the discovery of double helix structure announced the genetic era of human beings; at the beginning of the century， human genomic sequencing， study of transcriptome， proteome， and epigenetics marked the post-genomic era; in recent years， the study of DNA methylation signifies the era of mysterious epigenetics. DNA methylation profile is composed of numerous DNA methylation markers in human blood. As the integrated parameter， it resembles the flowing melody of life， and reflects the physiological or pathological statues of the cells. The methylation profile can diagnose diseases such as cancer at its early stage， evaluate healthy status and constitution， classify the patterns of Chinese medicine， and standardize the diagnosis of Chinese medicine. In addition， it can help trace， identify and improve the Chinese medicines. To mark the 70th anniversary of discovering double helix structure， this paper introduces the biomedical significance of methylation profile.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 DNA methylation; methylation profile; circulating cell-free DNA; epigenetic; early detection of cancer

生命，是一首歌，通過(guò)優(yōu)美的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)奏響著由A、T、C、G和甲基化C 5種音符組成的動(dòng)人旋律[1-2]；生命，是一條河，流淌著蘊(yùn)含億萬(wàn)細(xì)胞交織而成的甲基化譜脈律。每個(gè)個(gè)體的生命，從誕生到離去，那動(dòng)人的5種音符，從深?yuàn)W無(wú)底的基因組，透過(guò)甲基化胞嘧啶（methylcytosine， mC）組成的甲基化譜，無(wú)時(shí)無(wú)刻不在我們血液中流淌，是我們生命的脈律，影響著我們的人生。

在跨入21世紀(jì)之際，隨著人類基因組測(cè)序計(jì)劃完成，人類獲取了由ATCG和甲基化C 5種核酸構(gòu)成的長(zhǎng)達(dá)30億個(gè)堿基音符的生命天書(shū)，定義了我們所處的時(shí)代為后基因組時(shí)代[3-5]。解碼生命天書(shū)，成為當(dāng)代生物科學(xué)技術(shù)的主旋律。

甲基化譜，是生物體DNA不同CpG位點(diǎn)甲基化數(shù)量在某一時(shí)刻的總和[6-8]?；蚪M中的每個(gè)單一CpG位點(diǎn)，通過(guò)不斷更新或凋亡細(xì)胞釋放入血的游離核酸，攜帶其組織的特異性信息，這些信息的集合反映機(jī)體不同系統(tǒng)、器官、組織的生理或病理狀態(tài)。同一個(gè)體在不同時(shí)間、不同個(gè)體在同一時(shí)間，甲基化狀態(tài)均有不同；血液游離核酸所呈現(xiàn)的甲基化譜亦相應(yīng)有所區(qū)別[9-10]。因此，游離核酸甲基化譜是生命的信息子集，是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)、由不同細(xì)胞類型凋亡或死亡細(xì)胞碎片化核酸組成的瞬時(shí)集合，與之相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞甲基化圖譜，則屬于特定細(xì)胞類型各自具有的、相對(duì)恒定的甲基化組學(xué)序列[10-12]。

核酸甲基化是表觀遺傳的主要方式[12-15]，通過(guò)對(duì)編碼人類大約5萬(wàn)種蛋白質(zhì)的基因在何時(shí)何處以及何種強(qiáng)度進(jìn)行甲基化調(diào)控，使生命樂(lè)章得以完美演奏。甲基化調(diào)控基因的表達(dá)水平，抑癌基因的甲基化可顯著增加癌癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[16-18]。文獻(xiàn)報(bào)道，超過(guò)2 500多種基因參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，早期腫瘤為單克隆，而晚期腫瘤常常表現(xiàn)出高度異質(zhì)性，即多克隆或?qū)嶋H為多種疾病的集合[19-20]。DNA甲基化也與循環(huán)腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞特性、解聚及轉(zhuǎn)移能力相關(guān)[21]。以上提示，DNA甲基化對(duì)指導(dǎo)腫瘤早期診斷、早期治療及轉(zhuǎn)移監(jiān)控具有非常重要的價(jià)值。

參與特定腫瘤發(fā)生的基因種類多樣，早期診斷需要對(duì)盡可能多的基因甲基化進(jìn)行高敏感檢測(cè)[11]。在現(xiàn)有甲基化分析技術(shù)中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction， PCR）檢測(cè)一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)甲基化位點(diǎn)，而二代測(cè)序（next gene sequencing， NGS）可進(jìn)行組學(xué)層面的甲基化測(cè)序[22-23]。甲基化分析技術(shù)雖已用于肺癌、結(jié)直腸癌等篩查，但這些技術(shù)大都采用亞硫酸氫鈉對(duì)未甲基化的胞嘧啶（C）向尿嘧啶（U）進(jìn)行轉(zhuǎn)化，U在PCR或測(cè)序時(shí)的后續(xù)擴(kuò)增中表現(xiàn)為T(mén)，而甲基化的C則維持不變，比較化學(xué)轉(zhuǎn)化前后兩個(gè)標(biāo)本，即可得到待測(cè)標(biāo)本的CpG是否甲基化。因此，保留了mC在基因分析時(shí)仍呈現(xiàn)為C的基本結(jié)構(gòu)特征（圖1）。由于亞硫酸氫鈉在上述化學(xué)轉(zhuǎn)化過(guò)程中大量破壞核酸，相應(yīng)技術(shù)對(duì)低拷貝DNA甲基化表觀遺傳學(xué)信息進(jìn)行檢測(cè)的敏感性不高，用于腫瘤的早期診斷存在很大局限性[24-25]。

為克服亞硫酸氫鈉相關(guān)技術(shù)的致命缺陷，多種新技術(shù)已用于DNA甲基化研究[26-28]。其中，以甲基化依賴酶為核心的單序列特異性引物甲基化檢測(cè)技術(shù)和med-NGS技術(shù)，人工創(chuàng)造了一系列抑制接頭自連系統(tǒng)，結(jié)合廣泛用于基因編輯的金門(mén)克隆技術(shù)，構(gòu)建動(dòng)態(tài)抑制甲基化接頭的自連，并促使可逆反應(yīng)向接頭與待測(cè)核酸形成產(chǎn)物的方向進(jìn)行[28-31]（圖2）。這些創(chuàng)新性技術(shù)，可對(duì)數(shù)個(gè)到成千上萬(wàn)個(gè)CpG選定位點(diǎn)設(shè)計(jì)序列特異性引物（圖3），以達(dá)到在不破壞待測(cè)核酸前提下對(duì)甲基化核酸的富集和解碼，均可望成為甲基化譜的標(biāo)配技術(shù)。

從基因組時(shí)代到后基因組時(shí)代，從遺傳學(xué)時(shí)代到表觀遺傳學(xué)時(shí)代，從單個(gè)甲基化位點(diǎn)檢測(cè)到甲基化組學(xué)測(cè)序，生物科技和生命科學(xué)領(lǐng)域經(jīng)歷了漫長(zhǎng)而艱辛的探索。在21世紀(jì)20年代之初，當(dāng)全球生物醫(yī)學(xué)因?yàn)樾鹿谝咔椴坏貌恢貜?fù)開(kāi)發(fā)和廣泛應(yīng)用相對(duì)原始的核酸檢測(cè)RT-PCR技術(shù)的特殊時(shí)期，甲基化譜技術(shù)的出現(xiàn)，拓展了其在重大傳染病防治中的應(yīng)用[32-33]。再次使我們可以通過(guò)表觀遺傳學(xué)，去聆聽(tīng)生命的歌，去感受生命的脈律，去呵護(hù)生命的美好。

甲基化譜是機(jī)體細(xì)胞新陳代謝在基因?qū)用娴囊粋€(gè)瞬時(shí)性總體集合，重復(fù)檢測(cè)甲基化譜，可以動(dòng)態(tài)反映組成生命各系統(tǒng)、各器官的細(xì)胞更新速率和各種細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控水平的變化程度。人類基因組含有大約2 800萬(wàn)個(gè)CpG位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的C是否甲基化直接關(guān)系到相關(guān)基因表達(dá)與否以及表達(dá)水平的高低。換言之，基因的甲基化與去甲基化，高甲基化與低甲基化，均參與基因表達(dá)的調(diào)控[34-35]。甲基化譜直接反映生命活動(dòng)的健康、亞健康，亦或某種疾病狀態(tài)。

甲基化譜分析技術(shù)的出現(xiàn)，突破了長(zhǎng)期困擾腫瘤早篩早診的技術(shù)瓶頸[18，20-21]。然而，器官特異性腫瘤甲基化譜和泛癌種甲基化譜要逐步成為基因診斷標(biāo)準(zhǔn)或成熟為臨床指南，尚有待積累大量臨床檢測(cè)病例，并通過(guò)甲基化譜與早篩早診所必須的突變數(shù)量、突變豐度、突變比例和突變速率等臨床數(shù)據(jù)的不斷細(xì)化、更新和臨床再驗(yàn)證。甲基化譜的臨床應(yīng)用，短期可用于耐藥監(jiān)測(cè)和圍手術(shù)期監(jiān)測(cè)（minimal residual disease， MRD）[35]，減少晚期腫瘤患者比例，提高患者生存期和生存質(zhì)量，使常態(tài)化荷瘤生存成為可能，其遠(yuǎn)期效果有望根治大部分腫瘤患者。

在臨床推進(jìn)上，甲基化譜用于腫瘤的早期診斷，首先需要通過(guò)對(duì)單一癌種晚期患者手術(shù)前后的甲基化譜進(jìn)行布爾代數(shù)運(yùn)算，以及術(shù)前術(shù)后甲基化譜的差異性（即病集）運(yùn)算，從而得到相應(yīng)腫瘤的疾病特異性甲基化譜[36-37]。多種腫瘤甲基化譜的進(jìn)一步并集，即得到泛癌種的甲基化譜。甲基化譜在用于腫瘤早期診斷之前，一個(gè)合適的應(yīng)用場(chǎng)景是對(duì)影像學(xué)發(fā)現(xiàn)的微小增生病灶進(jìn)行良惡性鑒別，然后初步擴(kuò)大臨床應(yīng)用。正是因?yàn)檠河坞x核酸甲基化的高敏感檢測(cè)技術(shù)，人類得以第一次認(rèn)識(shí)到甲基化譜——這一動(dòng)態(tài)與全息的生命脈律。在腫瘤早期診斷的醫(yī)學(xué)旅程中，可以預(yù)期，甲基化譜分析技術(shù)的出現(xiàn)對(duì)甲基化譜成為腫瘤早期腫瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)之一將具有重要推動(dòng)作用。

甲基化譜分析新技術(shù)[25-30]研發(fā)的初心，是為防止晚期腫瘤。這些技術(shù)避免使用亞硫酸氫鈉對(duì)待測(cè)標(biāo)本的破環(huán)，不僅提高了檢測(cè)敏感性，更解決了亞硫酸氫鈉技術(shù)導(dǎo)致的“薛定諤的貓”相類似難題。以亞硫酸氫鈉為基礎(chǔ)的經(jīng)典DNA甲基化分析技術(shù)，需對(duì)化學(xué)處理前后標(biāo)本進(jìn)行比對(duì)，很明顯，在對(duì)體外受精的單細(xì)胞甲基化分析中，臨床實(shí)際難以提供兩個(gè)細(xì)胞進(jìn)行比對(duì)。新的甲基化譜技術(shù)，因其只需對(duì)一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，即可在生命誕生的初始階段對(duì)其進(jìn)行監(jiān)控。作為一個(gè)機(jī)體細(xì)胞的整合性指標(biāo)，甲基化譜除了可以廣泛用于多種疾病的早期診斷、療效評(píng)估以及藥物毒副作用監(jiān)測(cè)外，還可以用于人種[38-39]、同卵及異卵雙胞胎[9]鑒別，甚至還可以用于衰老速率評(píng)估及特定工作狀態(tài)分析[40]。

游離核酸甲基化譜同樣可以用于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的全流程分析。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)都是根據(jù)可觀察到的癥狀或證候指標(biāo)描述病理變化，而甲基化譜揭示了在遺傳和表觀遺傳水平上發(fā)生的變化。中醫(yī)學(xué)的整體觀念和辨證論治兩大特點(diǎn)，很可能與甲基化譜及其變化相吻合。一方面，甲基化譜可以作為一個(gè)通用的參數(shù)，對(duì)中醫(yī)的基本概念進(jìn)行分類，如陰陽(yáng)五行、臟腑及其表現(xiàn)、氣血津液、經(jīng)絡(luò)等。特別是在辨識(shí)中醫(yī)的不同證型或亞證型方面，甲基化譜可能是中醫(yī)證素（包括病性證素和病位證素）的重要展現(xiàn)方式，可為中醫(yī)體質(zhì)辨識(shí)和療效評(píng)估提供一個(gè)敏感的定量技術(shù)途徑，從表觀遺傳的角度更加精準(zhǔn)地指導(dǎo)中醫(yī)治病防病。另一方面，也可以利用植物DNA甲基化（CpG、CpHG和CpHH）譜辨別中藥材的真?zhèn)危捎眉谆V技術(shù)結(jié)合基因編輯技術(shù)對(duì)農(nóng)作物和中藥材進(jìn)行品種改良和優(yōu)化[15，41-42]。此外，DNA甲基化譜還可用于動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)[43]。利用甲基化譜對(duì)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)進(jìn)行量化評(píng)估，可能成為中藥通過(guò)多途徑、多靶標(biāo)調(diào)節(jié)人體功能的一種最好詮釋方式，使人類歷史上的經(jīng)驗(yàn)性知識(shí)升華為現(xiàn)代科學(xué)理論。

游離核酸甲基化譜既是生命中屬于機(jī)體的物理性動(dòng)態(tài)指標(biāo)，可授益通常意義上的疾病診斷；也可在一定程度上作為人類健康、亞健康的衡量指標(biāo)，甚至成為心理和智商的判斷指標(biāo)。譬如，機(jī)體處于亞健康狀態(tài)、應(yīng)激狀態(tài)或某個(gè)特殊工作狀態(tài)（如夜班工作者）時(shí)，可能不存在病理、生化或物理等指標(biāo)的改變，但以甲基化譜為代表的表觀遺傳學(xué)改變已經(jīng)悄悄展現(xiàn)[40]；又如，當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞中參與思維的基因表達(dá)異常時(shí)，外周血cfDNA的甲基化譜將可能早于常規(guī)的行為學(xué)和生化檢測(cè)指標(biāo)[44]。

因?yàn)榛蚪M主要定性組成生命的元器件，甲基化譜則定量各元器件在生命活動(dòng)中的實(shí)時(shí)參與程度[13]。一方面，從更廣的視野上，人類有望利用甲基化譜對(duì)多種能力如運(yùn)動(dòng)、音樂(lè)、繪畫(huà)、管理等進(jìn)行量化評(píng)估；另一方面，甲基化譜技術(shù)對(duì)植物育種，同樣具有實(shí)用價(jià)值。一個(gè)甲基化譜技術(shù)，可以連通整個(gè)真核生物世界[45]，為構(gòu)建包括人類健康、動(dòng)植物健康以及環(huán)境健康在內(nèi)的大健康生態(tài)打通航道、揚(yáng)起風(fēng)帆。

從千萬(wàn)年蠻荒時(shí)代走來(lái)，得益于一代又一代科學(xué)家的努力，人類終于在20世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，盡管最早發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)——X射線衍射照片的富蘭克林女士因?yàn)橥砥诎┌Y去世，未能與沃森和克里克分享諾貝爾獎(jiǎng)的殊榮，但DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)，讓我們進(jìn)入了基因組時(shí)代，進(jìn)入了后基因組時(shí)代，進(jìn)入了表觀遺傳學(xué)時(shí)代。新年伊始，Nature和Nature Genetics又分別以“正常人細(xì)胞甲基化譜”和“DNA甲基化提供了復(fù)雜性狀背后的分子聯(lián)系”開(kāi)篇[46-47]。正常細(xì)胞甲基化譜的完成，為腫瘤甲基化譜的確定起到了加速作用，我們有理由期待，我們有理由相信，因?yàn)橛糜谘河坞x核酸甲基化譜分析技術(shù)的出現(xiàn)，因?yàn)橛坞x核酸甲基化譜的廣泛應(yīng)用，迎接我們的，將是一個(gè)更加健康、更加美好的燦爛明天。

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（本文編輯? 匡靜之）