馮海波，王怡璇，姚金龍，熊輝

〔摘要〕 目的 通過觀察桃紅四物湯對創(chuàng)傷性股骨頭壞死大鼠血管內皮細胞生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2， VEGFR2）、Delta樣配體4（Delta-like 4， Dll4）蛋白表達的影響，探究其防治創(chuàng)傷性股骨頭壞死的作用機制。方法 將44只大鼠采用隨機數(shù)字表法分為正常組（10只）和造模組（34只）。造模組行創(chuàng)傷性股骨頭壞死造模；8周后從正常組和造模組分別隨機取2只進行對比檢測造模是否成功。將造模成功的剩余32只大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組及桃紅四物湯低、中、高劑量組，每組8只；加上正常組剩余大鼠8只，共計5組。正常組和模型組予以生理鹽水灌胃；桃紅四物湯低、中、高劑量組分別予以9、18、36 g/kg桃紅四物湯灌胃。持續(xù)4周后采集股骨頭標本，采用micro-CT觀察股骨頭組織形態(tài)學，光鏡下檢測空骨陷窩率，免疫組織化學法測定VEGFR2和Dll4的蛋白表達水平。結果 與正常組對比，其余4組大鼠股骨頭均有不同程度的骨質破壞、軟骨面塌陷及空骨陷窩率升高（P＜0.05）；模型組和桃紅四物湯低劑量組VEGFR2蛋白表達均下降（P＜0.05）；桃紅四物湯中、高劑量組Dll4蛋白表達明顯增加（P＜0.05）。與模型組對比，桃紅四物湯中、高劑量組大鼠股骨頭軟骨形態(tài)改善，組織空骨陷窩率下降（P＜0.05）；桃紅四物湯低、中、高劑量組VEGFR2蛋白表達均升高（P＜0.05）；桃紅四物湯中、高劑量組Dll4蛋白表達升高（P＜0.05）。結論 桃紅四物湯能有效降低創(chuàng)傷性股骨頭壞死骨組織空骨陷窩、改善組織形態(tài)，可能與增加VEGFR2、Dll4蛋白的表達、激活VEGF/Notch信號通路有關。

〔關鍵詞〕 桃紅四物湯；組織形態(tài)學；創(chuàng)傷性股骨頭壞死；血管內皮細胞生長因子受體2；Delta樣配體4；血管重建

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.07.006

Effects of Taohong Siwu Decoction on histomorphology and expressions of VEGFR2 and Dll4 in rats with traumatic osteonecrosis of the femoral head

FENG Haibo1，2， WANG Yixuan2， YAO Jinlong1， XIONG Hui2*

1. The Second Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha，

Hunan 410005， China; 2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the effects of Taohong Siwu Decoction （THSWD） on the expressions of vascular endothelial growth factor receptor 2 （VEGFR2）and Delta-like 4 （Dll4） proteins in rats with traumatic osteonecrosis of the femoral head （ONFH）， so as to explore its mechanism of action in preventing and treating this disease. Methods Totally 44 rats were randomized into normal group （n=10） and modeling group （n=34） using the random number table method. Modeling group underwent traumatic ONFH modeling; after 8 weeks， 2 rats were randomly selected from normal group and 2 rats from modeling group， for comparative testing to determine whether the modeling was successful. The remaining 32 rats with successful modeling were randomly subdivided into model group and low-， medium-， and high-dose THSWD groups using the random number table method， with 8 rats in each group; with the 8 remaining rats from normal group， totally 5 groups were set. Normal group and model group were given normal saline by gavage; low-， medium-， and high-dose THSWD groups were given 9， 18， and 36 g/kg THSWD by gavage， respectively. After 4 weeks of continuous treatment， femoral head specimens were collected， and the morphology of femoral head tissues was observed using micro-CT; the rate of empty bone lacuna was checked by light microscopy; the expression levels of VEGFR2 and Dll4 proteins were measured using immunohistochemistry. Results Compared with normal group， the other four groups of rats showed varying degrees of bone destruction， cartilage surface collapse， and an increase in the rate of empty bone lacuna （P<0.05）; the expression of VEGFR2 protein decreased in both model group and low-dose THSWD group （P<0.05）; the expression of Dll4 protein was significantly higher in medium- and high-dose THSWD groups （P<0.05）. Compared with model group， the morphology of the femoral head cartilage in medium- and high-dose THSWD groups improved， and the rate of empty bone lacunae in the tissue decreased （P<0.05）; the expression of VEGFR2 protein increased in low-， medium-， and high-dose THSWD groups （P<0.05）; the expression of Dll4 protein increased in medium- and high-dose THSWD groups （P<0.05）. Conclusion THSWD can effectively reduce the empty bone lacunae of traumatic ONFH and improve the tissue morphology， which may be related to increasing the expressions of VEGFR2 and Dll4 proteins and activating the VEGF/Notch signaling pathway.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Taohong Siwu Decoction; histomorphology; traumatic osteonecrosis of the femoral head; vascular endothelial growth factor receptor 2; Delta-like 4; vascular reconstruction

股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head， ONFH）是骨科臨床常見的致殘率高、治療較為復雜的骨關節(jié)疾病[1]。目前，對于本病的發(fā)病機制尚未完全闡明，但根據(jù)病因主要分為激素性、酒精性和創(chuàng)傷性ONFH。隨著生活節(jié)奏和交通的快速化，創(chuàng)傷性ONFH發(fā)病率不斷升高，并逐漸年輕化[2]。目前，髖關節(jié)置換是本病的主要治療方式，但存在創(chuàng)傷大、需二期翻修等風險[3]。因此，早期非手術保髖治療ONFH尤為重要。創(chuàng)傷性ONFH的機制主要在于損傷局部血管、導致血運的破壞，因此，治療的關鍵在于血液循環(huán)的重新建立。

桃紅四物湯是中醫(yī)經典活血方，具有活血化瘀的作用，臨床運用廣泛。研究發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯具有促進壞死股骨頭修復，改善股骨頭局部血運，使壞死股骨頭修復的功能，對ONFH臨床療效較好[4-5]。血管的通暢是血運重建的基礎，因此，推測其機制可能與促進損傷血管的修復和血管新生相關。VEGF/Notch信號軸是調節(jié)血管新生的重要通路，其中血管內皮細胞生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2， VEGFR2）是血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）受體中與血管最相關的調控因子，VEGFR2水平上調，可促進血管新生[6]。Delta樣配體4（Delta-like4， Dll4）是與血管新生和損傷血管修復最為相關的Notch配體，在血管生成中發(fā)揮重要作用[7]。本研究通過觀察桃紅四物湯對大鼠創(chuàng)傷性ONFH進程中VEGFR2及Dll4表達的影響，進一步探討桃紅四物湯治療創(chuàng)傷性ONFH的作用機制。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

44只雄性健康SD大鼠（體質量180～200 g），由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心[許可證號：SYXK（湘）2019-0005]統(tǒng)一購置并分籠飼養(yǎng)于SPF級實驗室，飼養(yǎng)溫度24～26 ℃，濕度50%～70%，由動物實驗中心人員進行專人飼養(yǎng)。實驗動物倫理號：LL2019100906。

1.2? 藥物及試劑

蘇木精染液、蘇木精分化液（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：G1004、G1309）；伊紅染液（上海晶萊生物技術有限公司，批號：17372-87-1）；Dll4（英國abcam公司，批號：ab176876）；VEGFR2（北京博奧森生物技術公司，批號：Bs-1047R）；PBS溶液（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：ZLI-9062）。

1.3? 主要儀器

Micro-CT（美國Perkin Elmer公司，型號：Quantum FX）；成像系統(tǒng)（日本Nikon公司，型號：Nikon DS-U3）；臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，型號：H1650R）；電泳儀、轉膜儀（中國北京六一生物科技有限公司，型號：DYY-6C、DYCZ-40D）；電磁爐（荷蘭Philips公司，型號：HD4925）；包埋機（武漢俊杰電子有限公司，型號：JB-P5）；旋轉蒸發(fā)儀（上海一恒科學儀器有限公司，型號：RV-211M）。

1.4? 動物分組

將44只雄性大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法分為正常組（10只）和造模組（34只）。正常組不予特殊處理，造模組予以手術造模。8周后正常組和造模組分別隨機取2只大鼠進行對比，檢測造模是否成功。造模成功后，將剩余32只造模大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組及桃紅四物湯低、中、高劑量組，每組8只，正常組剩余大鼠8只，共計5組。

1.5? 模型制備

參照PELED等[8]手術造模方式，具體步驟如下：根據(jù)常用標準配制大鼠麻醉所需戊巴比妥鈉，然后用1 mL注射器予以腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉滿意后，用固定器將大鼠俯臥位固定于保溫操作臺上，在備皮處（手術區(qū)域）用聚維酮碘消毒。手術切口以大鼠大轉子為中心，沿大腿方向縱向依次切開皮膚、皮下組織，分離臀中肌。在保護好神經血管的前提下切斷圓韌帶，使髖關節(jié)脫位、股骨頭充分暴露；將股骨頸基底骨膜用尖刀充分刮離，并切除關節(jié)囊的折返纖維，然后將股骨頭重新復位，復位后用生理鹽水沖洗傷口后逐層縫合。術后予以青霉素5萬U/d，肌內注射，連續(xù)3 d，防止傷口感染。注意在鼠籠上方放置鼠糧，以便大鼠只有在保持站立的情況下才能進食水。通過micro-CT見大鼠股骨頭軟骨面改變、軟骨下骨出現(xiàn)壞死、骨小梁稀疏甚至斷裂等即為造模成功[9]。

1.6? 桃紅四物湯制備及給藥劑量

桃紅四物湯的配比根據(jù)《醫(yī)宗金鑒》中的比例換成現(xiàn)代計量：桃仁20 g、紅花10 g、生地黃20 g、當歸20 g、赤芍20 g、川芎10 g。中藥材由湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院藥劑科一次購進，采用傳統(tǒng)煎煮后，用蒸發(fā)儀濃縮成含生藥2 g/mL的湯劑，并封包處理。以大鼠200 g為中位數(shù)，采用人與動物體表面積換算[10]確定大鼠具體給藥劑量，桃紅四物湯的低、中、高劑量分別為9、18、36 g/kg。

1.7? 干預方法

正常組大鼠予以常規(guī)喂養(yǎng)+生理鹽水灌胃；模型組在造模成功后予以常規(guī)飼料喂養(yǎng)+生理鹽水灌胃；桃紅四物湯低、中、高劑量組予以正常喂養(yǎng)并分別予以桃紅四物湯9、18、36 g/kg的標準進行灌胃。持續(xù)4周后采集股骨頭標本。

1.8? 觀察指標

1.8.1? 大體組織形態(tài)學觀察? 將所截取的股骨頭標本用專用試管進行存放固定，然后用micro-CT對股骨頭及近端股骨頸進行掃描，觀察股骨頭大體組織形態(tài)學，主要包括股骨頭整體外觀、關節(jié)軟骨面塌陷情況。X線掃描參數(shù)：電壓90 kV，電流80 ？滋A，像素尺寸90 ？滋m，高分辨率掃描模式。

1.8.2? 空骨陷窩率檢測? 將股骨頭經4%多聚甲醛固定后，在用EDTA脫鈣，持續(xù)3～4周。脫鈣完全后常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制作成厚度約4 μm的切片。在200倍鏡下，每張切片隨機選取5個視野，記錄出空骨陷窩和總骨陷窩，并計算出平均值。平均空骨陷窩數(shù)與平均總骨陷窩數(shù)的比值用百分比率表示，即為空骨陷窩率[11]。

1.8.3? 大鼠股骨頭VEGFR2、Dll4蛋白表達水平檢測? 取出大鼠股骨頭標本后，用多聚甲醛液固定，采用免疫組織化學法進行樣品制備、抗原修復、背景封閉等步驟，測定VEGFR2、Dll4蛋白的平均光密度。首先進行石蠟切片脫蠟、抗原修復、孵育；然后將切片進行DAB顯色，顯色時間在顯微鏡下控制，陽性為棕黃色；再用蘇木精復染細胞核，蘇木精返藍液返藍；最后進行脫水封片，顯微鏡檢查并采集圖像進行分析。

1.9? 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件處理，滿足正態(tài)性、方差齊性時，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法；方差不齊時，采用Dunnett's T3檢驗；當數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)性時，采用秩和檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1? 各組大鼠大體組織形態(tài)學觀察

正常組大鼠股骨頭軟骨面光滑，形態(tài)結構完整，未見塌陷；模型組股骨頭可見骨質破壞、軟骨面塌陷明顯；桃紅四物湯低劑量組大鼠股骨頭軟骨面可見部分塌陷、骨質破壞較明顯；桃紅四物湯中劑量組大鼠股骨頭形態(tài)結構輕度變形、軟骨面可見少部分塌陷和毛糙；桃紅四物湯高劑量組大鼠股骨頭形態(tài)稍改變，關節(jié)面欠規(guī)整，少部分軟骨面塌陷。詳見圖1。

2.2? 各組大鼠股骨頭空骨陷窩率比較

與正常組比較，其余各組大鼠空骨陷窩率升高（P＜0.05）。與模型組比較，桃紅四物湯中、高劑量組空骨陷窩率下降（P＜0.05）。與桃紅四物湯低劑量組比較，桃紅四物湯中、高劑量組空骨陷窩率降低（P＜0.05）。桃紅四物湯中、高劑量組空骨陷窩率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表1。

2.3? 各組大鼠股骨頭VEGFR2、Dll4蛋白表達比較

與正常組比較，模型組和桃紅四物湯低劑量組VEGFR2蛋白表達均下降（P＜0.05）；桃紅四物湯中、高劑量組Dll4蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，桃紅四物湯低、中、高劑量組VEGFR2蛋白表達均升高（P＜0.05）；桃紅四物湯中、高劑量組Dll4蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。與桃紅四物湯低劑量組比較，桃紅四物湯中劑量組VEGFR2蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；桃紅四物湯高劑量組Dll4蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。桃紅四物湯中、高劑量組VEGFR2、Dll4蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表2、圖2—3。

3 討論

創(chuàng)傷性ONFH是臨床上的常見骨科疾病，其發(fā)病機制主要是由于創(chuàng)傷損傷了營養(yǎng)股骨頭的血管，導致血液循環(huán)的中斷或不暢，從而使骨代謝出現(xiàn)異常并進一步形成ONFH；多見于髖周骨折、脫位等損傷，以股骨頸骨折和髖關節(jié)脫位最為常見[12]。ONFH的治療主要在于抑制壞死股骨頭的進一步惡化和促進骨組織新生重建，這兩方面皆離不開血運[13]。因此，血液循環(huán)的恢復離不開血管的運載，血管的重建和修復是保守治療的關鍵。

中醫(yī)學中，沒有“股骨頭壞死”的病名；但根據(jù)發(fā)病的部位及臨床癥狀與“髖痹”“骨痹”“骨痿”“骨蝕”等疾病相對應。歷代不同醫(yī)家認為[14]，其發(fā)病機制主要與各種致病因素導致人體血瘀氣滯、瘀血阻絡、正氣虧虛有關，其中瘀血阻絡是關鍵因素。現(xiàn)代眾多醫(yī)家也主張“從瘀論治”，活血化瘀的治則應貫穿在本病治療的全過程[15]。桃紅四物湯是中醫(yī)活血化瘀的經典方，廣泛應用于血瘀病癥，在臨床上對ONFH的治療也有肯定的療效[16]。林智軍等[17]在臨床運用桃四物湯加減治療ONFH患者，發(fā)現(xiàn)能有效減輕Ⅰ、Ⅱ期ONFH患者的臨床癥狀。高玉龍等[18]在臨床中采用手術聯(lián)合桃紅四物湯加減治療ONFH，發(fā)現(xiàn)不僅可有效降低炎癥因子水平，而且可有效降低全血黏度（vhole blood viscosity， WBV）和血漿黏度（plasma viscosity， PV）。課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)[19]，桃紅四物湯對創(chuàng)傷性ONFH的髖關節(jié)功能有明顯的改善作用。本實驗研究顯示，micro-CT可見中、高劑量的桃紅四物湯能有效改善創(chuàng)傷性ONFH大鼠股骨頭塌陷，降低骨組織空骨陷窩率，進一步證實了桃紅四物湯對創(chuàng)傷性ONFH的作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯治療ONFH的機制可能與其調控炎性因子和凝血因子表達、改善血液流變學（hemorheology， HR）特性、促進血管修復或新生等有關[20-22]。VEGF是一種具有調控內皮細胞生長及促進血管生成和重塑的特異性生長因子[23]，VEGF表達的上調在血管新生中發(fā)揮重要的作用[24]。趙建濤等[25]研究證實，心肌組織VEGF、b-FGF表達的上調，能促進血管新生，改善心室重構，從而改善急性心肌梗死大鼠心功能。人體中的VEGF主要有VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D以及PLGF 5個亞型；有VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3 3種受體[26]。VEGFR2作為重要的血管生長因子受體之一，與VEGF結合后發(fā)生磷酸化，p-VEGFR2繼而調控下游信號通路，在血管新生及重塑過程中發(fā)揮著重要的調控作用[27-28]。研究發(fā)現(xiàn)，機體對血管內皮生長增殖與機體血管形成的調控，主要是通過相關的細胞因子調控血管內皮細胞表面受體VEGFR2的活化及表達，進而抑制或激活其相關的下游信號傳導通路，通過影響增殖、遷移等途徑達到調控作用[29-30]。宋宇可等[31]實驗研究發(fā)現(xiàn)，血管生成數(shù)和長度的增長與VEGF、VEGFR-2表達的上調密切相關。欒冰等[32]在研究中發(fā)現(xiàn)，化瘀通絡中藥單體的主要成分可通過抑制VEGFR2/Akt/ERK1/2信號通路調節(jié)血管新生，進一步印證了VEGFR2在血管新生中的作用。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，桃紅四物湯低、中、高劑量組的VEGFR2蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與桃紅四物湯低劑量組比較，桃紅四物湯中劑量組VEGFR2蛋白的表達明顯升高（P＜0.05）；桃紅四物湯低、高劑量組的VEGFR2蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；說明桃紅四物湯能提高VEGFR2蛋白表達水平，但并不是濃度越高越好，以中劑量桃紅四物湯為最佳。

Notch信號通路由Notch受體、配體及下游信號分子組成。哺乳動物中有Notch1、Notch2、Notch3、Notch4共4個Notch受體和Deltalike1、Deltalike3、Deltalike4，Jagged1、Jagged2 5個配體，其中Notch1和Dll4與損傷血管的修復和血管新生關系最為密切[33-34]。有研究發(fā)現(xiàn)，基因敲除小鼠Dll4比敲除Notch1會出現(xiàn)更加嚴重的血管缺陷；在血管新生過程中，Notch1受體必須與配體Dll4相結合才能激活，發(fā)揮Notch信號通路的作用[35]。有研究證明[36]，動脈內皮細胞上血管內皮生長因子可誘導Notch1及其配體Dll4的表達來促進損傷內皮修復，若Notch信號通路被阻斷，血管內皮細胞將停止增殖。LI等[37]研究發(fā)現(xiàn)，宣痹通瘀方可通過促進Dll4表達，從而促進心肌缺血大鼠血管生成。ＨE等[38]研究發(fā)現(xiàn)，錦雞兒總黃酮通過促進腦組織中Dll4和VEGF的表達，促進大腦中動脈閉塞大鼠的局部血管生成，改善局部血循環(huán)，使缺血性腦卒中癥狀改善并使梗死面積減少。HULTGREN等[39]研究發(fā)現(xiàn)，通過Dll4-Notch-VEGFR2軸可以調節(jié)內皮細胞活化和血管生成。Dll4作為Notch信號通路的配體之一，在血管修復和新生過程中起著十分重要的作用。本研究結果顯示，低、中、高劑量的桃紅四物湯均具有促進股骨頭Dll4蛋白表達的作用，并隨著藥物濃度的提升不斷增強；與低劑量組比較，桃紅四物湯高劑量組Dll4蛋白表達明顯升高，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；但桃紅四物湯中、高劑量組之間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明Dll4蛋白表達并不是隨著藥物濃度的升高而無限增加。

綜上所述，經典活血方桃紅四物湯可有效改善創(chuàng)傷性ONFH形態(tài)，有效降低股骨頭空骨陷窩率；桃紅四物湯中、高劑量組可明顯增加股骨頭VEGFR2和Dll4蛋白的表達，與藥物濃度有一定的相關性，但不是隨著濃度升高而無限增加。因此，推測中、高劑量的桃紅四物湯能有效降低股骨頭組織空骨陷窩、改善組織形態(tài)，可能與增加VEGFR2、Dll4蛋白的表達，激活VEGF/Notch信號通路有關，但是否具有靶向作用，需進一步深入研究。

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（本文編輯? 周? 旦）