李昭楠，李長忠，保長虹，賀彩霞，金文杰，陳艷霞

(青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海 西寧 810016)

黃河流域是中國重要的生態(tài)屏障和經(jīng)濟地帶，整個流域的生態(tài)保護和高質(zhì)量發(fā)展已經(jīng)成為國家戰(zhàn)略。青海省地處黃河源頭，擁有天然有魚水域131.36×104hm2、宜魚水域5.49×104hm2，水體潔凈、水質(zhì)優(yōu)良，常年水溫在3～22 ℃之間，冬季不封凍、無大風(fēng)浪，是養(yǎng)殖鮭鱒等冷水魚的理想場所，也是國內(nèi)外公認的養(yǎng)殖鮭鱒條件較好的地區(qū)之一[1-2]。近年來，青海省黃河沿岸的鮭鱒網(wǎng)箱養(yǎng)殖始終堅持生態(tài)優(yōu)先的理念，保持了穩(wěn)步發(fā)展的勢頭，高原冷水魚品牌的優(yōu)勢顯現(xiàn)，青海省也成為國內(nèi)最重要的鮭鱒生產(chǎn)基地[3]。

目前，國內(nèi)外市場三文魚的銷售量穩(wěn)步增加，挪威、芬蘭和美國分別以生產(chǎn)大西洋鮭(Salmosalar)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)和阿拉斯加鮭(Oncorhynchusnerka)為主，中國以生產(chǎn)虹鱒為主。虹鱒是鮭科的一員，在世界范圍內(nèi)具有重要的生態(tài)價值[4]。其中，三倍體虹鱒因體內(nèi)有三套染色體、無法進行減數(shù)分裂、不能產(chǎn)生精子和卵子以及不存在性腺發(fā)育等特點，具有生長快、肉質(zhì)好、個體大和能夠有效防范物種入侵[5]等優(yōu)勢，而成為黃河上游青海段的主要養(yǎng)殖品種，促進青海省冷水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的效益穩(wěn)步提升。目前，有關(guān)三倍體虹鱒的研究主要集中在能量代謝[6-7]、發(fā)育過程[8-9]以及不同發(fā)育階段基因的表達[10-11]等方面，在魚種鑒定方面鮮有報道。市售的三倍體虹鱒主要以冰鮮、腌制和煙熏的形式存在，急需一種有效的鑒定方法，以利于保護消費者的合法權(quán)益，規(guī)范市場監(jiān)管。

隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，魚類的物種鑒定研究已逐漸從形態(tài)學(xué)方法轉(zhuǎn)向形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法[12]。DNA作為生物體最核心的信息遺傳載體，其遺傳序列直接決定了生物體的本質(zhì)。以DNA為基礎(chǔ)的分子檢測技術(shù)由于具有較高的靈敏度、特異性、可靠性，己成為魚類物種鑒定的主要檢測技術(shù)[13]。分子鑒定技術(shù)主要包括隨機引物 PCR(Arbitrarily primed PCR，AP-PCR)、隨機擴增多態(tài)性 DNA(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)、擴增性簡單序列重復(fù)(Inter-simple sequence repeats，ISSR)、限制性內(nèi)切酶切片段長度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)、擴增限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(Amplified restriction endonuclease fragment length polymorphism，AFLP)、單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)和DNA條形碼(DNA-barcode)序列分析[14]等。其中，DNA條形碼在物種鑒定中具有獨特的優(yōu)勢，即可以根據(jù)整條魚、魚片、魚鰭、魚卵或組織碎片的樣本識別魚類物種，僅需要少量樣本即可進行DNA條形碼檢測。此外，即使是加工處理的樣品，也可以應(yīng)用DNA條形碼對其進行物種鑒別[15]。目前，DNA-barcode和Mini-barcode技術(shù)已被廣泛用于魚種鑒定，其通過擴增部分COⅠ序列作為條形碼，以此對物種進行準確鑒定，但該技術(shù)應(yīng)用于近緣物種、雜交種和變種之間的鑒定尚未被明確。本研究以三倍體虹鱒、二倍體虹鱒及其變種金鱒、大西洋鮭、大麻哈魚(Oncorhynchusketa)和高白鮭(Coregonuspeled)為研究對象，利用COⅠ基因?qū)琪V進行DNA條形碼研究和系統(tǒng)進化分析，探討COⅠ基因在分子鑒定中的適用性，為虹鱒的物種鑒定提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

三倍體虹鱒、金鱒、二倍體虹鱒和大西洋鮭樣品各3條，分別采自青海省海東市、循化縣、化隆縣和門源縣；冰鮮大麻哈魚和高白鮭樣品各3條，分別購自庫爾勒愛果電子商務(wù)有限公司和哈爾濱龍德食品有限公司。取以上魚類的背部肌肉組織，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取及引物設(shè)計

使用DNA提取試劑盒(TIANGEN，Code No.DP304)提取上述鮭科魚類肌肉組織基因組DNA，通過紫外分光光度計(Implen，NanoPhotometer N60)測定各樣本的濃度和純度。以質(zhì)量合格的DNA為模板，分別擴增6種樣本魚的DNA barcode和Mini barcode，擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。通過NCBI數(shù)據(jù)庫下載10種鮭科魚類CO Ⅰ基因序列(表1)，經(jīng)Clustal X[16]對比后，選取保守區(qū)序列，利用Primer Premier 5軟件分別設(shè)計兩對DNA barcode、Mini barcode引物用于虹鱒鑒定(表2)，所有引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 鮭科魚類COⅠ基因信息

表2 PCR引物信息

1.3 PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件及產(chǎn)物分析

PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括：Premix Taq 10 μL(Takara，Code No.RR902A)，DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL(濃度為10 μmol/L)，ddH2O補充反應(yīng)體系至20 μL。CO Ⅰ-1 PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，5個循環(huán)；94 ℃變性30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃結(jié)束。CO Ⅰ-2 PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃結(jié)束。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，以DNA 2000 Marker(Takara，Code No.3427A)判定PCR產(chǎn)物片段大小與引物產(chǎn)物片段大小的一致性。

1.4 測序及數(shù)據(jù)分析

將符合要求的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進行測序，數(shù)據(jù)使用DNAStar軟件中的SeqMan程序[17]進行序列拼接，再利用Clustal X[16]對比查找上下游引物位置。將處理好的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，并基于相似性、覆蓋度和綜合評分來確定樣品的種屬信息。為分析虹鱒的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，從NCBI查找COⅠ基因序列長度為600 bp左右的17個鮭科物種(表3)，應(yīng)用MEGA 7.0[18]中的鄰接法(Neighbor-joining method，NJ)[19]構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

表3 17個鮭科物種的COⅠ基因信息

續(xù)表3

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增及序列分析

各樣本基因組DNA濃度在100～200 ng/μL之間,A260/280比值在1.9～2.1之間(表4),均滿足后續(xù)PCR擴增的要求(圖1)。對于擴增長度為681、678 bp的DNA barcode而言,所有樣品均得到單一明亮的條帶,因此選擇引物CO Ⅰ-F24和CO Ⅰ-R24進行基因測序分析。對于擴增長度為153、230 bp的Mini barcode而言,引物TEYL-1擴增后大西洋鮭與高白鮭條帶較暗(圖2),故使用TEYI-0F和TEYI-0R引物擴增出的片段進行測序分析。

表4 各樣本DNA質(zhì)量檢測結(jié)果

注：M為DL 2000分子質(zhì)量標準；1～6使用COⅠ-F24、COⅠ-R24引物；7～12使用COⅠ-F25、COⅠ-R25引物；1、7為三倍體虹鱒；2、8為金鱒；3、9為二倍體虹鱒；4、10為大西洋鮭；5、11為大麻哈魚；6、12為高白鮭。

2.2 測序結(jié)果分析

將測序得到的DNA barcode和Mini barcode序列拼接處理后，基于NCBI數(shù)據(jù)庫檢索比對，結(jié)果表明本研究擴增得到的6種魚的CO Ⅰ基因信息同NCBI數(shù)據(jù)庫中的已知物種信息匹配度與覆蓋度均在97%以上。相比于DNA barcode序列，Mini barcode序列的最高匹配度較低，由表5可知，DNA barcode比對結(jié)果均為100%，而Mini barcode中只有大西洋鮭比對結(jié)果為100%，這可能是因為Mini barcode序列長度較短(153 bp)，而長片段(DNA barcode)中個別堿基的缺失、插入及突變會對結(jié)果產(chǎn)生較大的影響。通過BLAST發(fā)現(xiàn)待測樣本高白鮭應(yīng)為歐白鮭(Coregonusalbula)，可能存在標簽誤貼的情況。本研究以CO Ⅰ作為單一靶基因，可對虹鱒和其他魚種進行區(qū)分，但對于近緣物種和變種不能區(qū)分，需要尋找新的鑒別手段。

表5 6種鮭科魚基于DNA條形碼技術(shù)物種鑒定結(jié)果

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

三倍體虹鱒屬于鮭科，鮭科有3個亞科11個屬，分別基于DNA barcode和Mini barcode構(gòu)建鮭科魚類系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3、圖4)。兩個聚類結(jié)果基本一致。鮭科17個物種聚為2大支，其中白鮭亞科和茴魚亞科聚集在一起，鮭亞科聚集在一起，表明白鮭亞科和茴魚亞科的親緣關(guān)系較近。每個魚種獨立分支，由于三倍體虹鱒是由二倍體虹鱒和四倍體虹鱒雜交出的全雌性虹鱒，金鱒為二倍體虹鱒的變種，因此三倍體虹鱒、金鱒、二倍體虹鱒和虹鱒聚為一支；測序后大西洋鮭和大麻哈魚的序列也與在NCBI上下載的序列(MN850430.1、MN880432.1)聚集在一起，表明其親緣關(guān)系最近；測序后高白鮭的序列與NCBI下載的歐白鮭、高白鮭聚集在一起；白鮭屬(Coregonus)、茴魚屬(Thymallus)聚在一起，麻哈魚屬(Oncorhynchus)、副哲羅魚屬(Parahucho)、哲羅魚屬(Hucho)、紅點鮭屬(Salvelinus)、鱒屬(Salmo)聚在一起，表明此系統(tǒng)發(fā)育樹可信。

3 討論

遺傳學(xué)方法的優(yōu)點之一是從任何年齡動物的活體或死體身上收集的一個小組織樣本就包含了完整的核和線粒體基因組信息。通過比較基因組選定區(qū)域內(nèi)的中性或保守變異，可以在個體水平上進行鑒定[20]。本研究利用此原理進行采樣后虹鱒與其他魚種的區(qū)分。相比較蛋白質(zhì)檢測方法，利用DNA鑒別更為簡便，它比蛋白質(zhì)更耐高溫，在不利的環(huán)境條件下仍然有可能通過聚合酶鏈式反應(yīng)擴增小的DNA片段用于鑒定，DNA還存在于生物體的幾乎所有細胞中，可以從任何基質(zhì)中被提取[21]。DNA分子標記能夠直接反映特種DNA分子水平上的差異[22]。DNA條形碼技術(shù)是利用線粒體基因的短序列來識別物種，應(yīng)用于特定生物分類群的DNA條形碼標記，對物種邊界、群落生態(tài)學(xué)、功能性狀進化、營養(yǎng)相互作用和生物多樣性保護等研究具有重要意義[23]。DNA條形碼技術(shù)因準確、經(jīng)濟、高效的特性而備受關(guān)注，比較適合鑒別較高經(jīng)濟價值的魚種[24]。

隨著全球貿(mào)易魚類產(chǎn)品的種類和類型的增加，產(chǎn)品標簽錯誤的案例也在增加，而其發(fā)生有不同的原因。在某些情況下，當(dāng)魚肉具有類似的物理性質(zhì)(顏色、質(zhì)地)，并且通過加工去除魚鰭和頭部等形態(tài)特征時，魚會被錯誤地識別為其他種類。Nedunoori A等[25]利用DNA條形碼技術(shù)結(jié)合BOLD識別引擎和本地組裝的條形碼庫，對來自食品店的22個冷凍魚和魚片樣本進行了誤標調(diào)查，研究發(fā)現(xiàn)白眼鱈魚被錯標為鱈魚片，羅非魚無法被準確識別。利用DNA條形碼技術(shù)，Cline E等[26]對來自美國華盛頓西部商店和餐館的鮭魚樣本進行了檢測，以確定大西洋鮭魚取代了太平洋鮭魚，在99個鮭魚樣本中，有11個(11%)是貨真價實的；超過38%的餐廳樣本被錯誤標記物種，而有7%的商店樣本被錯誤標記。Clark L F等[27]討論了魚類價值鏈中標簽錯誤和替代問題的范圍、公共和私營部門目前使用的條形碼以及進一步實施的一些建議。本研究中發(fā)現(xiàn)高白鮭存在標簽誤貼現(xiàn)象，實際應(yīng)該為歐白鮭，結(jié)果同時證明利用DNA條形碼技術(shù)可以對物種進行鑒定。

在魚類條形碼研究中，通常用于物種鑒定的DNA標記是線粒體DNA(mtDNA)中一個648 bp的區(qū)域，被稱為COⅠ基因。現(xiàn)有的分子鑒定研究通常使用DNA barcode、Mini barcode或二者與其他基因相結(jié)合的方法進行物種鑒定，例如Chang C等[28]、Zahn R J等[29]和Sultana S等[30]分別利用650、130、259 bp的COⅠ基因與141 bp的18S rRNA基因?qū)ε_灣魚、鯊魚和20種商品魚進行鑒定，結(jié)果均顯示該方法可行。盡管DNA條形碼技術(shù)在魚類物種鑒定方面已逐漸成熟，但其鑒別能力受到許多因素的影響。其中，數(shù)據(jù)庫脆弱性和標本誤認是主要因素[31]。本研究中使用681 bp的DNA barcode和153 bp的Mini barcode相結(jié)合的方法，對虹鱒及其他鮭科魚進行鑒定，可以有效地減少在測序過程中因堿基缺失或者錯配而產(chǎn)生的誤差，可在結(jié)果上相互驗證，使結(jié)果更有說服力；系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果表明，此方法可用于虹鱒的鑒定，為其產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供理論依據(jù)。

關(guān)于鮭科魚類的系統(tǒng)發(fā)育分析，目前常用的方法有NJ法和最大似然法(Maximum likelihood estimate，MLE)[32-33]。本研究使用NJ法對三倍體虹鱒、金鱒、二倍體虹鱒、大麻哈魚、大西洋鮭、高白鮭和其他17種鮭科魚類的線粒體基因組構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，白鮭屬、茴魚屬聚在一起，麻哈魚、副哲羅魚屬、哲羅魚屬、紅點鮭屬、鱒屬聚在一起。本研究所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹與李瑤瑤等[34]根據(jù)鮭科魚cytb基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹和孫毅[35]依據(jù)鮭科魚COX1基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果一致，佐證了本研究結(jié)果的可靠性?；谛蛄蠦LAST和進化樹分析發(fā)現(xiàn)，檢測的6種魚類樣本中高白鮭存在標簽誤貼的情況，這在魚類消費市場中常有發(fā)生[36-37]，故各種魚類鑒定方法的建立對規(guī)范市場具有重要意義。

金鱒為虹鱒的變種[38]，二者拉丁名一致，基于線粒體基因組無法被區(qū)分，因此需探索其他可對二者進行鑒定的方法。Stephens M R等[39]利用SNP技術(shù)對摻入金鱒中的虹鱒進行了區(qū)分，本課題組后續(xù)將對該方法的適用性做進一步驗證。在魚類中，三倍體是由一個四倍體產(chǎn)生的配子與一個二倍體產(chǎn)生的配子通過受精方式結(jié)合的，三倍體化被普遍認為是不育魚大規(guī)模生產(chǎn)最實用、經(jīng)濟和有效的方法[40]。本研究結(jié)果顯示，三倍體虹鱒、金鱒和二倍體虹鱒的COⅠ基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果一致，且測序發(fā)現(xiàn)三倍體虹鱒和二倍體虹鱒線粒體基因組完全一致，故基于mtDNA無法對三者進行區(qū)分和鑒定。已有研究發(fā)現(xiàn)，依據(jù)核基因可鑒定三倍體虹鱒、金鱒和二倍體虹鱒[41-42]，但該方法對樣本來源要求較高，無法被廣泛應(yīng)用于加工樣本的鑒定。綜上所述，本研究開發(fā)的DNA條形碼可將虹鱒與其他鮭科魚類進行區(qū)分，這將為虹鱒物種鑒定及產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

本研究開發(fā)的DNA條形碼技術(shù)可區(qū)分虹鱒與其他鮭科物種，但對于三倍體虹鱒、二倍體虹鱒和金鱒之間不能區(qū)分，需要尋找新的鑒定方法對變種進行區(qū)分。