賈圓圓

(平潭綜合實(shí)驗(yàn)區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村發(fā)展服務(wù)中心，福建 福州 350400)

牡蠣享有“海中牛奶”之美稱(chēng)，其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，是一種高蛋白、低脂肪的健康海洋貝類(lèi)[1]。牡蠣已成為中國(guó)乃至世界重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖貝類(lèi)，據(jù)2022年《中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》，中國(guó)牡蠣2021年養(yǎng)殖產(chǎn)量高達(dá)581.9×104t，占海水貝類(lèi)養(yǎng)殖產(chǎn)量的三分之一以上，其中福建省牡蠣養(yǎng)殖產(chǎn)量為211.2×104t，約占全國(guó)的36.29%，居全國(guó)首位[2]。隨著牡蠣養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的不斷擴(kuò)大，牡蠣養(yǎng)殖病害問(wèn)題日益嚴(yán)重。近年來(lái)，由牡蠣皰疹病毒1型 (Ostreid herpesvirus- 1，OsHV-1)引起的貝類(lèi)大規(guī)模死亡事件給貝類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)損失[3]。

OsHV-1通稱(chēng)牡蠣皰疹病毒，隸屬皰疹病毒目(Herpesvirales)、軟體動(dòng)物皰疹病毒科(Malacoherpesviridae)、牡蠣皰疹病毒屬(Ostreavirus)，是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的能夠感染無(wú)脊椎動(dòng)物的皰疹病毒[4]。OsHV-1的感染宿主范圍較廣，能夠引起牡蠣、扇貝、蛤仔、蚶類(lèi)等雙殼貝類(lèi)的感染和死亡，其中牡蠣是受OsHV-1危害最嚴(yán)重的貝類(lèi)[3]，研究[5]發(fā)現(xiàn)OsHV-1會(huì)感染牡蠣從貝苗到成貝的各個(gè)階段，通常幼貝的發(fā)病率和死亡率高于成貝。被OsHV-1感染發(fā)病的貝苗表現(xiàn)為活力減弱和食欲降低，癥狀出現(xiàn)5～6 d后開(kāi)始死亡，通常于10 d內(nèi)全部死亡[6]。成貝發(fā)病后表現(xiàn)為食欲下降、閉殼肌收縮緩慢、黏液分泌增加等，死亡率較幼貝略低[7]。牡蠣皰疹病毒感染牡蠣各生長(zhǎng)階段的感染部位差別不大，病變組織主要集中在外套膜、生殖腺等器官的結(jié)締組織上[8]。

OsHV-1的檢測(cè)方法一般分為形態(tài)學(xué)檢測(cè)和分子學(xué)檢測(cè)兩種。形態(tài)學(xué)檢測(cè)主要通過(guò)光鏡和透射電鏡觀察樣本的組織病理變化和病毒粒子形態(tài)結(jié)構(gòu)，1972年，F(xiàn)arley C A等[4]通過(guò)電鏡首次發(fā)現(xiàn)了牡蠣皰疹病毒。形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法具有操作難度大、技術(shù)要求高及低病毒量時(shí)不易檢出等特點(diǎn)，一般需結(jié)合分子學(xué)技術(shù)確診[3，9]。分子學(xué)檢測(cè)方法主要包括PCR技術(shù)、原位雜交技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)等。PCR診斷技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和檢測(cè)速度快等特點(diǎn)，已成為牡蠣以及其他水產(chǎn)動(dòng)物疫病的主要檢測(cè)手段，且普通PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR已成為OsHV-1的常用檢測(cè)方法。與普通PCR相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR能夠精確檢測(cè)病毒的感染量，因而被越來(lái)越多地應(yīng)用到OsHV-1的檢測(cè)中。本文通過(guò)普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等分子生物學(xué)手段對(duì)福建省具有一定代表性的牡蠣育苗場(chǎng)和主要成貝養(yǎng)殖海區(qū)的牡蠣開(kāi)展檢測(cè)，以期為牡蠣皰疹病毒的分子學(xué)檢測(cè)及其防控方法的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

樣品采集于2020年3—5月，在福建省漳浦、詔安和莆田地區(qū)分別采集A育苗場(chǎng)長(zhǎng)牡蠣(Crassostreagigas)苗5個(gè)樣本，編號(hào)1～5；B育苗場(chǎng)長(zhǎng)牡蠣苗樣本5個(gè)，編號(hào)6～10；C育苗場(chǎng)福建牡蠣(C.angulata)苗樣品5個(gè)，編號(hào)11～15；D育苗場(chǎng)福建牡蠣苗樣品5個(gè)，編號(hào)16～20；E育苗場(chǎng)福建牡蠣5個(gè)，編號(hào)21～25；F育苗場(chǎng)福建牡蠣樣品5個(gè)，編號(hào)26～30。成貝采集于平潭海區(qū)、深滬灣海區(qū)和漳浦海區(qū)，每個(gè)海區(qū)采集牡蠣樣品20個(gè)。樣品取回后，于實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱凍存(表1)。

表1 樣品采集信息表

1.2 引物合成

普通PCR引物的選取根據(jù)世界動(dòng)物衛(wèi)生組織水生動(dòng)物診斷手冊(cè)推薦使用的C2/C6特異性引物，該引物在普通PCR檢測(cè)OsHV-1中應(yīng)用最早、最廣泛，其擴(kuò)增目的片段大小約700 bp，由上海美吉生物公司合成(表2)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物的選取根據(jù)世界動(dòng)物衛(wèi)生組織推薦，借鑒Martenot C等[10]在TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中使用的BF/B4引物及B-P探針。

1.3 DNA模板的提取

稱(chēng)取30 mg牡蠣樣本于1.5 mL無(wú)菌離心管中；加入Buffer ML1 350 μL、Pro K 25 μL，渦旋震蕩30 s，60 °C溫育1 h；加入氯仿∶異戊醇=24∶1的混合液350 μL，渦旋震蕩20 s，高速離心2 min(10 000 g)，取上清液250 μL至新的1.5 mL無(wú)菌離心管中；加入Buffer MBL 250 μL，渦旋震蕩15 s，70 °C溫育10 min；加入無(wú)水乙醇250 μL，渦旋震蕩15 s；取混合液700 μL轉(zhuǎn)移至柱子+2 mL收集器的組合中，高速離心1 min(10 000 g)，棄液體，收集管重復(fù)利用；加入HB Buffer 500 μL，高速離心30 s(10 000 g)，棄濾液；加入DNA Wash Buffer 700 μL，高速離心1 min(10 000 g)，棄濾液；加入DNA Wash Buffer 700 μL，高速離心2 min(15 000 g)，棄濾液；將柱子放入1.5 mL無(wú)菌離心管中，加入60 °C預(yù)熱的Elution Buffer 50 μL于柱子底部，室溫靜置2 min，高速離心1 min(10 000 g)，收集洗脫液；重復(fù)上一步，收集的洗脫液即為提取的DNA模板，立即用于實(shí)時(shí)定量PCR或保存于-20 ℃冰箱中待用。

表2 合成的引物序列

1.4 普通PCR反應(yīng)和電泳檢測(cè)

從冰箱中取出凍存的待檢測(cè)的DNA樣品1～90為模板，加入水樣為空白對(duì)照，通過(guò)普通PCR反應(yīng)擴(kuò)增OsHV-1基因，反應(yīng)體系如表3所示。在PCR儀上通過(guò)如下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)。通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳(電壓120 V、20 min)對(duì)得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，凝膠成像儀中觀察結(jié)果。

表3 普通PCR反應(yīng)體系

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)低病毒載量的檢測(cè)不敏感[11]，本文根據(jù)普通PCR電泳結(jié)果，選取A、B、C育種場(chǎng)中電泳條帶最亮的3個(gè)陽(yáng)性樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。在PCR儀上通過(guò)如下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系見(jiàn)表4。

表4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系

2 結(jié)果與分析

2.1 普通PCR電泳檢測(cè)結(jié)果

將提取的OsHV-1片段通過(guò)普通PCR擴(kuò)增、1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如表5、圖1所示。電泳結(jié)果顯示，1～3、8～9、11～12、86～88樣本均在700 bp處出現(xiàn)電泳條帶，與目的條帶大小一致。其中1～3、8～9、11樣本中目的條帶較亮，12、86～88樣本出現(xiàn)微弱的電泳條帶，與目的條帶大小一致，其他樣本中未檢測(cè)出目的電泳條帶(圖1)。由表5可知，A、B、C育苗場(chǎng)和漳浦海區(qū)均檢測(cè)出OsHV-1，A育苗場(chǎng)陽(yáng)性檢出率高達(dá)60%，B、C育苗場(chǎng)陽(yáng)性檢出率均為40%，漳浦海區(qū)陽(yáng)性檢出率為15%。此次檢測(cè)的90個(gè)樣本中，陽(yáng)性檢出約10個(gè)，平均陽(yáng)性檢出率為11.11%，其中幼苗樣本30個(gè)，平均陽(yáng)性檢出率為23.33%，高于成貝5%的平均陽(yáng)性檢出率。

表5 普通PCR電泳檢測(cè)結(jié)果

注：M為Marker；1～5為漳浦A育苗場(chǎng)長(zhǎng)牡蠣樣品；8～10為漳浦B育苗場(chǎng)長(zhǎng)牡蠣樣品；11～15為漳浦C育苗場(chǎng)福建牡蠣樣品；86～88為漳浦海區(qū)福建牡蠣成貝樣品。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

選取A、B、C育苗場(chǎng)中電泳條帶最亮的2、8、11三個(gè)陽(yáng)性樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，檢測(cè)其取樣點(diǎn)的病毒最大拷貝數(shù)，結(jié)果如表6所示，2、8樣品長(zhǎng)牡蠣的OsHV-1病毒感染量分別約為6.1×107、3.5×102copies/mg，11樣品福建牡蠣的OsHV-1病毒感染量約為3.7×102copies/mg。

表6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

瓊脂糖凝膠電泳是通過(guò)瓊脂凝膠的分子篩作用，分子量或分子形狀不同的核酸片段在電泳過(guò)程因移動(dòng)速度不同而分離，通過(guò)電泳結(jié)果中產(chǎn)生的條帶強(qiáng)度可大致了解樣品中DNA的數(shù)量[12]。彭桂莊等[13]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)電泳中條帶的明亮度與所測(cè)目的基因的濃度有關(guān)，電泳條帶的亮度隨著濃度的增大而增大。本研究結(jié)果顯示1～3、8～9、11樣本的牡蠣感染了OsHV-1，12、86～88樣本條帶微弱，因此上述牡蠣樣本雖然感染了OsHV-1，但其感染量相對(duì)較低。Oden E等[11]研究結(jié)果顯示，OsHV-1感染引起的宿主發(fā)病和死亡狀態(tài)主要與病毒在宿主內(nèi)的感染量相關(guān)，當(dāng)病毒感染量低于8.8×103個(gè)/mg組織時(shí)，宿主通常保持無(wú)癥狀感染狀態(tài)，當(dāng)感染量繼續(xù)增加，宿主則會(huì)發(fā)病或死亡。本文檢測(cè)結(jié)果顯示，2樣本感染的OsHV-1病毒感染量高達(dá)6.1×107copies/mg，8、11樣品的病毒感染量較低，分別為347.9、368.9 copies/mg。因此A育苗場(chǎng)1～3樣品長(zhǎng)牡蠣苗種的死亡可能由OsHV-1感染引起發(fā)病所造成的，OsHV-1感染不是造成B、C育苗場(chǎng)牡蠣苗種死亡的主要原因。

此次檢測(cè)的90個(gè)樣本中，陽(yáng)性檢出10個(gè)，平均陽(yáng)性檢出率為11.11%。其中牡蠣幼苗樣本30個(gè)，平均陽(yáng)性檢出率為23.33%，高于牡蠣成貝5%的平均陽(yáng)性檢出率，這與于江南[14]的研究結(jié)果類(lèi)似。漳浦海區(qū)的福建牡蠣成貝雖然有部分檢測(cè)出OsHV-1病毒，但電泳條帶極其微弱，電泳條帶亮度遠(yuǎn)低于A、B、C 三個(gè)育苗場(chǎng)的陽(yáng)性樣本亮度，成貝中OsHV-1含量均很低。Barbosa V等[15]和Lopez M等[16]對(duì)長(zhǎng)牡蠣和福建牡蠣的流行病學(xué)調(diào)查也顯示，成貝往往無(wú)臨床癥狀，其病毒含量大多在103copies/mg以下，因此漳浦海區(qū)的牡蠣雖然感染了OsHV-1，但其不會(huì)對(duì)牡蠣的生長(zhǎng)造成影響。本研究檢測(cè)的牡蠣樣本取自漳浦、詔安、泉州、莆田、平潭5個(gè)地區(qū)，結(jié)果顯示牡蠣陽(yáng)性檢出點(diǎn)均位于漳浦地區(qū)，這可能與漳浦地區(qū)為福建主要的牡蠣苗種生產(chǎn)地有關(guān)，牡蠣苗種生產(chǎn)企業(yè)較多，一旦出現(xiàn)OsHV-1感染，則容易發(fā)生交叉感染；其次陽(yáng)性感染也可能與親本攜帶有關(guān)，三家陽(yáng)性檢出育苗場(chǎng)的親本來(lái)自不同地區(qū)。

4 牡蠣皰疹病毒的防控與建議

由于貝類(lèi)多在開(kāi)放海域養(yǎng)殖，這給貝類(lèi)相關(guān)疾病的防控帶來(lái)了難度。OsHV-1的防控主要有以下幾點(diǎn)建議：1)開(kāi)展育苗前的消毒工作?？赏ㄟ^(guò)海水加熱(50 ℃、5 min)、紫外線(xiàn)照射(10 min)、次氯酸鈉(0.05 g/L、15 min)、福爾馬林(40 g/L、30 min)等物理和化學(xué)方式殺滅海水中的OsHV-1。2)對(duì)育苗海水進(jìn)行處理。海水中的浮游生物、組織碎片也能成為病毒的攜帶者，5 μm濾孔過(guò)濾海水可有效防止貝類(lèi)感染[7]。Hick P等[17]研究發(fā)現(xiàn)，OsHV-1可以在海水中存活2 d，因此抽取的海區(qū)海水在育苗場(chǎng)靜置2 d可有效降低病毒的存活率。3)開(kāi)展親貝的檢測(cè)。隨機(jī)選取待使用的親貝或者對(duì)親本熱應(yīng)激(21 ℃、2～3周)后[18]，進(jìn)行PCR檢測(cè)，選取不攜帶病毒的親本可有效降低苗種感染率。4)干露可降低已感染的海區(qū)養(yǎng)殖貝類(lèi)的死亡率。尤其能提高成貝的成活率，但對(duì)幼貝效果不明顯[7]。5)選育抗OsHV-1的新品系。De Lorgeril J等[19]對(duì)15個(gè)長(zhǎng)牡蠣家系開(kāi)展人工感染實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示家系之間的感染率(0%～97.4%)差別較大，這為病毒的選育提供了可能。Bai C M等[20]也在自然海區(qū)中發(fā)現(xiàn)了對(duì)OsHV-1不敏感的長(zhǎng)牡蠣。因此建議牡蠣育苗企業(yè)在購(gòu)買(mǎi)親本或苗種時(shí)，選購(gòu)健康的親本進(jìn)行育苗，育苗前開(kāi)展相應(yīng)的OsHV-1檢測(cè)及處理；牡蠣養(yǎng)殖戶(hù)選購(gòu)已開(kāi)展OsHV-1檢疫的生產(chǎn)廠家苗種，為牡蠣育苗及養(yǎng)殖做好保障工作。