馬志桃, 胡婷婷, 張丹鳳, 葉應旺

(合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

灰霉(Botrytiscinerea)是一種重要的植物病原真菌,其寄主有1 400種,包括多種重要糧食和經(jīng)濟作物[1]。該病原菌具有廣泛的遺傳變異性和適應性,在寒冷、干旱、饑餓等條件下可產(chǎn)生菌核以提高對不良環(huán)境壓力的抗性,因此十分難以控制[2]。

綠原酸又稱5-o-咖啡基奎寧酸,在植物中廣泛存在[3],具有調(diào)節(jié)人體糖代謝和脂代謝、誘導減肥、降血壓、消炎、抗氧化等多種健康益處[4],用于采后保鮮可延長水果貨架期[5]。綠原酸還有廣譜抗菌活性,具有作為生物殺菌劑的潛力。據(jù)報道綠原酸可上調(diào)擬莖點霉鈣轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)基因的表達[6]。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn),綠原酸可引起真菌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激,使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子釋放到細胞質(zhì),破壞真菌細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)。但關(guān)于綠原酸對真菌外源鈣攝入影響的相關(guān)報道較少。

真菌細胞膜上Cch1和Mid1組成的鈣通道,感知施加于細胞壁和質(zhì)膜的多種機械壓力信號,允許Ca2+快速流入細胞質(zhì),從而激活一系列靶基因表達,以維持細胞在環(huán)境壓力下的生長[7-8]。Mid1基因缺失會導致真菌徑向生長速度減慢,但在培養(yǎng)基中添加外源性CaCl2后可緩解Mid1敲除株的生長缺陷[9]。結(jié)合綠原酸對灰霉菌生長的抑制現(xiàn)象,本文推測綠原酸通過Mid1影響灰霉菌正常的鈣流活動以達到抑制效果。因此,本研究在驗證外源性鈣可緩解綠原酸對灰霉徑向生長抑制的基礎(chǔ)上,探討了綠原酸是否通過與Mid1蛋白互作抑制灰霉生長,為深入研究綠原酸抑制灰霉的生長機理奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 菌株與載體

灰霉菌株(Botrytiscinerea,FJH5)來自中國農(nóng)業(yè)大學種子健康中心;大腸桿菌菌株DH5α、Rosetta以及蛋白原核表達載體pET-28a(+)均存于合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院實驗室-80 ℃冰箱,該表達載體攜帶6×His標簽。

1.1.2 試劑

綠原酸(純度≥98%)購于北京百靈威科技有限公司;Taq DNA Polymerase、dNTPs、苯甲基磺酰氟(PMSF)、過硫酸銨(Aps)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、甘氨酸、30%丙烯酰胺(Acr)、四甲基乙二胺(TEMED)、硫酸卡那霉素均購于合肥博美生物科技有限責任公司;TransStartFastPfu DNA Polymerase、Quick Gel Extraction Kit均購于北京全式金生物技術(shù)有限公司;Tianprep Mini Plasmid Kit 購于天根生化科技(北京)有限公司;T4 DNA Ligase、限制性內(nèi)切酶(NdeⅠ、XhoⅠ)購于New England Biolabs;DNA Marker(2 000/10 000 bp)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、Mag-Beads His-Tag 蛋白純化磁珠、PEG20000均購于生工生物工程(上海)股份有限公司;蛋白Marker購于Thermo scientific;His-Tag (D3I10) XP Rabbit mAb購于Cell Signaling Technology;Goat Anti-Rabbit IgG購于博士德生物。

1.1.3 儀器設(shè)備

霉菌培養(yǎng)箱購于上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療廠;立式高壓蒸汽滅菌鍋購于上海申安醫(yī)療器械廠;臺式高速冷凍離心機購于湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;超聲波破碎儀購于江蘇海思睿智能科技有限公司;聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增儀、蛋白小垂直板電泳槽、電泳儀電源均購于美國BIO-RAO;化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購于上海天能科技有限公司;LAS4000mini分子影像儀購于日本Cytiva;LS-55熒光分光光度計購于美國Perkin Elmer公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Ca2+對灰霉菌絲生長的影響

用直徑為5 mm的無菌打孔器取7 d左右菌齡的灰霉菌餅,分別接種于直徑為35 mm的含3 g/L綠原酸的察氏(CD)培養(yǎng)基、添加50 mmol/L CaCl2的CD培養(yǎng)皿中心,倒置于25 ℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察菌落直徑及生長狀態(tài)。以不含綠原酸的CD培養(yǎng)基作為對照,每個處理進行3個重復,整個實驗重復3次。

1.2.2 基因克隆

在NCBI數(shù)據(jù)庫下載BcMid1目的基因登錄號,利用Primer Premier5軟件設(shè)計引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列(5′→3′)如下:

F:CATATGCCTCTGCCAAAACTCAGTCC,

R:CTCGAGTCAGATGCCGCTCAACATGA。

以灰霉cDNA為模板,用高保真酶(Pfu酶)進行PCR擴增,退火溫度為58 ℃,得到目的基因片段。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1) 雙酶切。將PCR產(chǎn)物與蛋白表達載體pET-28a分別用限制性核酸內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ進行雙酶切,37 ℃酶切2 h,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,切膠回收。

2) 連接。酶切后的膠回收產(chǎn)物用T4連接酶16 ℃過夜連接。

3) 轉(zhuǎn)化。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中,涂布在含50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)。

4) 鑒定。挑取長勢良好的單克隆菌株搖菌,菌落PCR鑒定,取與陽性對照條帶一致的菌液提取質(zhì)粒雙酶切驗證是否可切開,若能切開則送菌液測序。

1.2.4 目的蛋白的原核表達及純化

1) 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET-28a∶∶BcMid1轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta感受態(tài)中,選取陽性菌株擴大培養(yǎng)后,加入0.5 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導劑,16 ℃誘導10 h,離心收集菌體。

2) 用pH值為7.0的PBS重懸菌體,加入終濃度為1.0 mmol/L 的PMSF、0.2 mg/mL的溶菌酶,靜置30 min,超聲破碎,離心收集上清,獲得粗蛋白提取液,SDS-PAGE檢測目的蛋白表達情況。

3) 將粗蛋白提取液與His標簽蛋白純化磁珠4 ℃孵育1 h,使目的蛋白與磁珠充分結(jié)合,隨后用含不同濃度咪唑的洗脫緩沖液從低到高梯度洗脫蛋白,收集得到純度較高的BcMid1蛋白。之后用透析袋在4 ℃透析12 h以除去目的蛋白中的咪唑。

4) 將得到的BcMid1目的蛋白用Western Blot鑒定。BcMid1蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后,轉(zhuǎn)到PVDF膜上,膜依次用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h,His標簽兔抗室溫孵育1 h,TBST清洗3次,HRP標記的羊抗兔IgG抗體室溫孵育1 h,TBST清洗3次,隨后用現(xiàn)配的曝光液浸濕膜,在提前預冷的分子影像儀上曝光。

1.2.5 目的蛋白與綠原酸的體外相互作用

將BcMid1蛋白與1 mmol/L綠原酸37 ℃、100 r/min避光孵育2 h,制備2份完全相同的蛋白膠進行SDS-PAGE凝膠電泳。一份經(jīng)考馬斯亮藍R250染色后10%醋酸脫色觀察BcMid1蛋白條帶位置;另一份直接經(jīng)熒光凝膠成像系統(tǒng)觀察熒光位置。對比觀察蛋白條帶位置是否與熒光位置重合。參考文獻[10]用熒光分光光度計進行綠原酸熒光測量。將綠原酸濃度固定在10 μmol/L,室溫下向含綠原酸的水溶液中依次等量滴加BcMid1蛋白,混勻后檢測0～15.0 μmol/L范圍內(nèi)的BcMid1蛋白隨濃度升高對綠原酸熒光強度的影響。并且以BcMid1蛋白濃度為橫坐標,綠原酸熒光強度為縱坐標繪制散點圖,觀察兩者的關(guān)系。其中激發(fā)波長350 nm,發(fā)射波長600 nm,激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度為15 nm。參考文獻[11],根據(jù)Stern-Volmer equation計算綠原酸與BcMid1蛋白的結(jié)合常數(shù)Ka,即

其中:F0、F分別為綠原酸中加入BcMid1蛋白前后的熒光強度;c為BcMid1蛋白濃度;Ka為兩者的結(jié)合常數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ca2+對灰霉菌落擴展的影響

利用CD培養(yǎng)基對灰霉進行鈣饑餓培養(yǎng),探討Ca2+對灰霉菌落生長的影響,結(jié)果如圖1所示。3個培養(yǎng)基分別為CD(培養(yǎng)基1)、含3 g/L綠原酸的CD(培養(yǎng)基2)、含3 g/L綠原酸和50 mmol/L CaCl2的CD(培養(yǎng)基3)。培養(yǎng)3 d后,與對照組相比,添加綠原酸后菌落直徑降低38.59%,而在綠原酸存在條件下添加Ca2+后灰霉菌落直徑降低22.63%,說明在察氏培養(yǎng)基中添加Ca2+可降低綠原酸對灰霉的抑菌作用(P<0.05),表明綠原酸對灰霉的抑制與Ca2+相關(guān)。

圖1 Ca2+對灰霉菌落擴展的影響

2.2 pET-28a∶∶BcMid1重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以灰霉cDNA為模板,擴增BcMid1基因片段,結(jié)果如圖2a所示。圖2中,M為DNA Marker,泳道1為PCR產(chǎn)物。由圖2可知,得到與預期大小(2 022 bp)一致的特異性條帶,由此判斷已擴增出BcMid1目的基因片段。BcMid1基因擴增產(chǎn)物與pET-28a表達空載經(jīng)雙酶切、膠回收后,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于E.coilDH5α過夜培養(yǎng),觀察到平板上的單克隆菌株圓潤飽滿,生長狀態(tài)良好。菌落PCR鑒定結(jié)果如圖2b所示,2、3、4號單克隆菌液與1號陽性對照大小一致,5號為陰性對照,說明這3株菌為潛在陽性菌株。

將上述2號和3號菌株擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒,進行10 μL體系酶切驗證,結(jié)果如圖2c所示。圖2c中:M為DNA Marker;泳道1和泳道3分別為2號菌液的質(zhì)粒、酶切產(chǎn)物;泳道2和泳道4分別為3號菌液的質(zhì)粒、雙酶切產(chǎn)物。結(jié)果顯示,提取的2個質(zhì)粒均可酶切成2個條帶,且條帶大小與pET-28a空載(5 369 bp)、BcMid1基因(2 022 bp)大小一致,表明目的基因片段成功連上載體。

圖2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

選2號菌株送生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序結(jié)果顯示基因序列正確,表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 BcMid1蛋白在Rosetta菌株中的原核表達

E.coilRosetta是表達型菌株,將重組質(zhì)粒pET-28a∶∶BcMid1轉(zhuǎn)入其中,在IPTG誘導下可大量表達目的蛋白。Ni-NTA瓊脂糖珠可純化攜帶His標簽的BcMid1蛋白,經(jīng)咪唑梯度洗脫獲得純度較高的BcMid1蛋白。經(jīng)4 ℃過夜透析除去咪唑和PEG20000濃縮后,進行Western Blot鑒定,結(jié)果如圖3所示,M為蛋白Marker。由圖3a可知,泳道1和泳道2為BcMid1蛋白,經(jīng)純化透析后蛋白條帶單一明亮,說明獲得的BcMid1蛋白質(zhì)量較高。由圖3b可知,泳道1和泳道2為WB曝光后的蛋白條帶,條帶大小符合預期,說明收集的蛋白即為BcMid1蛋白。

圖3 目的蛋白的表達純化和Western Blot檢測結(jié)果

2.4 BcMid1蛋白與綠原酸的體外相互作用

將BcMid1蛋白與綠原酸孵育,結(jié)果如圖4所示,M為蛋白Marker。由圖4a可知,泳道1為孵育液經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后BcMid1蛋白條帶位置。由圖4b可知,泳道1～泳道3為BcMid1蛋白條帶位置觀察到的熒光(綠原酸自發(fā)熒光),表明BcMid1蛋白是綠原酸作用于灰霉的潛在作用靶點。

圖4 目的蛋白與綠原酸的結(jié)合

綠原酸熒光強度的變化可以初步反映其與BcMid1蛋白的結(jié)合情況,如圖5所示。

圖5 目的蛋白對綠原酸熒光強度的影響

由圖5a可知,在350 nm激發(fā)下綠原酸在水中的熒光較弱,但隨著BcMid1蛋白濃度的增加,綠原酸的熒光強度不斷增強,這可能是由于兩者結(jié)合形成復合物,使綠原酸在水溶液中的溶解度增加熒光增強。由圖5b可知,在一定范圍內(nèi)綠原酸熒光強度與BcMid1蛋白濃度線性相關(guān)。根據(jù)計算可得Ka=(3.93±0.47)×104mol/L,這一現(xiàn)象進一步為綠原酸與BcMid1蛋白的體外結(jié)合提供了證據(jù)。

3 結(jié) 論

據(jù)報道鈣穩(wěn)態(tài)在真菌致病性和生長過程中發(fā)揮著重要作用[12]。本文發(fā)現(xiàn),在不含鈣的察氏培養(yǎng)基中,綠原酸導致灰霉對鈣缺乏敏感度增加,而加入Ca2+會緩解綠原酸對灰霉的抑制,且添加Ca2+后菌絲生長更為茂盛。這與前人研究發(fā)現(xiàn)的鈣離子可促進菌絲生長結(jié)果一致[12]。因此本文推測綠原酸對灰霉的抑制與鈣攝入相關(guān)。

Mid1蛋白是真菌特異性蛋白,與鈣穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)。研究表明,Mid1缺失的真菌突變株在低Ca2+培養(yǎng)基中的生長速率降低[13]。這與本文研究發(fā)現(xiàn)的綠原酸脅迫下灰霉的生長對低Ca2+敏感結(jié)果一致,表明綠原酸對灰霉的抑制可能與Mid1有關(guān)。通過SDS-PAGE和熒光定量檢測發(fā)現(xiàn),綠原酸和BcMid1蛋白可以結(jié)合且Ka=(3.93±0.47)×104mol/L,因此本文推測綠原酸通過結(jié)合BcMid1蛋白抑制灰霉Ca2+流入,使胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào),從而抑制灰霉生長、削弱致病力。但兩者不同條件下的結(jié)合效率和結(jié)合能力、結(jié)合位點以及結(jié)合后對目的蛋白構(gòu)象的改變還有待進一步研究。后續(xù)本課題組將通過分子對接模擬等手段多方式驗證綠原酸與BcMid1蛋白的互作。

綜上所述,本文通過體外平板實驗發(fā)現(xiàn)綠原酸對灰霉的抑制與鈣攝入相關(guān)。通過構(gòu)建表達載體、利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)表達BcMid1蛋白,體外分析綠原酸與BcMid1蛋白的結(jié)合作用,初步發(fā)現(xiàn)BcMid1蛋白與綠原酸存在相互作用。本文為綠原酸通過BcMid1蛋白抑制鈣通道,以降低灰霉生長和致病力的作用提供了初步證據(jù),為揭示綠原酸對灰霉的潛在抑菌機理提供了方向。