李輝平 駱昕 馬林 姜雅 王琳 楊華平 曲紹軒

摘要：為研究草菇生產(chǎn)過程中不同階段培養(yǎng)料中的養(yǎng)分和微生物群落結(jié)構(gòu)組成的變化特征，以二次發(fā)酵結(jié)束后、發(fā)菌期和出菇期等3個不同栽培階段培養(yǎng)料為研究對象，測定培養(yǎng)料中有機質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、有效磷、速效鉀、水解性氮含量和pH值。同時，基于16S和18S rDNA序列研究同批次的培養(yǎng)料在3個不同栽培階段的細(xì)菌和真菌等生物群落的組成時空動態(tài)特征。在此基礎(chǔ)上，還對比了同批次和非同批次未正常結(jié)實培養(yǎng)料與正常結(jié)實培養(yǎng)料的生物群落差異特征，以揭示培養(yǎng)料養(yǎng)分含量和生物群落中優(yōu)勢種群組成與草菇結(jié)實之間的關(guān)系。結(jié)果表明，二次發(fā)酵后的培養(yǎng)料中有機質(zhì)、全氮、水解性氮、全鉀和速效鉀養(yǎng)分含量以及pH值在發(fā)菌期和出菇期均明顯上升，而全磷和有效磷含量在發(fā)菌期顯著上升后在出菇期下降。與正常結(jié)實的培養(yǎng)料相比，同批次未正常結(jié)實草菇培養(yǎng)料的全氮、水解性氮、全磷、全鉀和速效鉀養(yǎng)分含量均存在顯著性差異；生物群落α多樣性指數(shù)表明，培養(yǎng)料中真核生物群落的Chao1、Ace指數(shù)隨著草菇的定植、生長和子實體形成而下降，細(xì)菌群落的Chao1、Ace、香農(nóng)指數(shù)呈現(xiàn)一直增加的趨勢；發(fā)酵料隨著草菇生長發(fā)育其生物群落在門水平上優(yōu)勢菌群組成和相對豐度差異較大，厚壁菌門、放線菌門、子囊菌門、毛霉菌門是二次發(fā)酵后培養(yǎng)料的優(yōu)勢菌群，草菇菌絲定植后變形菌門、擔(dān)子菌門和褐藻門的相對豐度提高；不能結(jié)實培養(yǎng)料與正常結(jié)實培養(yǎng)料的生物菌落結(jié)構(gòu)存在顯著差異，其優(yōu)勢菌群的相對豐度下降以及可能缺少出菇期特有的微生物菌群是造成出菇異常的重要因素。本研究結(jié)果對揭示草菇出菇異常的形成機制具有一定的參考價值。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵料；出菇異常；群落結(jié)構(gòu)；聚類分析；多樣性分析

中圖分類號：S646.1+30.4? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）13-0149-09

草菇（Volvariella volvacea）是世界重要的可栽培草腐食用菌之一，以作物秸稈（如稻草、麥稈、玉米秸稈等）發(fā)酵后的腐殖質(zhì)作為主要營養(yǎng)來源［1］。自然分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，是一種高溫型食用菌，其人工栽培最早起源于我國，因此又被稱為“中國蘑菇”，在我國和東南亞地區(qū)栽培廣泛，我國是全球最大的草菇生產(chǎn)國［2-3］。

草菇的栽培方式以培養(yǎng)料經(jīng)一次發(fā)酵或二次發(fā)酵處理后的大棚栽培和室內(nèi)栽培為主，栽培周期在20～23 d。發(fā)酵料中的有益微生物能促進(jìn)培養(yǎng)料的大分子降解、轉(zhuǎn)化和利用生物熱能以及抑制病蟲和雜菌的滋生。在已報道的以稻草、廢棉或菌渣為主要培養(yǎng)料栽培草菇的研究中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵料中的微生物優(yōu)勢種群在發(fā)酵不同時期會發(fā)生變化，同時微生物的群落結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢種群因培養(yǎng)料組成的不同而存在顯著性差異［4］。目前已初步明確了草菇培養(yǎng)料發(fā)酵中的優(yōu)勢微生物類群及變化情況，即以廢棉為主要培養(yǎng)料，在二次發(fā)酵中細(xì)菌是以變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門為優(yōu)勢種群，真菌是以非培養(yǎng)散子囊菌目為優(yōu)勢種群［5-6］；以工廠化杏鮑菇或鹿茸菇栽培后的菌渣為主要培養(yǎng)料栽培草菇時，一次發(fā)酵后是變形菌門和擬桿菌門為細(xì)菌優(yōu)勢種群，二次發(fā)酵后以變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門為優(yōu)勢種群［7］。然而，培養(yǎng)料發(fā)酵完成后栽培過程中生物群落組成結(jié)構(gòu)與草菇生長發(fā)育之間相關(guān)分析的研究還未有報道，是否還有其他生物群落在草菇栽培中起關(guān)鍵作用尚不清楚。本研究運用高通量測序技術(shù)對草菇栽培過程中培養(yǎng)料內(nèi)生物群落的動態(tài)變化特征進(jìn)行解析，并比較分析其養(yǎng)分組成的動態(tài)變化過程，以期明確不同階段培養(yǎng)料養(yǎng)分和生物群落動態(tài)特征，為解析其與草菇生長結(jié)實互作關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究于2022年夏季在江蘇江南生物科技有限公司進(jìn)行。草菇菌種為V06，由江蘇江南生物科技有限公司提供。草菇的培養(yǎng)料配方為鹿茸菇菌渣90%，稻草10%，石灰調(diào) pH值到7.9～8.0，含水量為65%。

分別采集二次發(fā)酵后（CK）、草菇發(fā)菌期（F）、草菇出菇期（V）的培養(yǎng)料以及同批次不出菇（T）和不同批次不出菇（TJ）的培養(yǎng)料（不出菇的培養(yǎng)料發(fā)菌正常，無雜菌污染和病蟲害發(fā)生）。采用隨機取樣法，每個時期的樣品取5點混合，重復(fù)3次，每個重復(fù)分成2份樣品，一份用于培養(yǎng)料理化性質(zhì)測定，一份用于高通量測序［7-8］。樣品于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)料DNA提取及高通量測序 利用土壤DNA提取試劑盒（Omega Bio-Tek，Norcross，GA，美國）提取培養(yǎng)料微生物DNA。分別利用細(xì)菌16S rRNA 基因的V4～V5 區(qū)域特異性引物［515F （5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和907R （5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）］，真核 18S rRNA基因的 V4 區(qū)特異性引物［1380F （5′-CCCTGCCHTTTGTACACAC-3′）和1510R （5′-CCTTCYGCAGGTTCACCTAC-3′）］進(jìn)行PCR擴增［9-10］。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，30個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s）擴增，最后72 ℃延伸 5 min。PCR反應(yīng)體系為30 μL，其中Phanta Max Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）為15 μL，F(xiàn)/R引物（10 μmol/L）各1 μL，模板DNA為20 ng。擴增子在 2% 的瓊脂糖凝膠中電泳分離，用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（Axygen Biosciences，Union City，CA，美國）進(jìn)行純化回收，產(chǎn)物送至南京瑞源生物技術(shù)有限公司經(jīng) Qubit3.0 （Life Invitrogen，美國）定量后構(gòu)建測序文庫，在Illumina Novaseq 6000平臺進(jìn)行高通量測序［7］。

1.2.2 培養(yǎng)料中養(yǎng)分含量和pH值測定 培養(yǎng)料中有機質(zhì)含量采用重鉻酸鉀法測定；全氮含量的測定采用凱氏定氮法；水解性氮含量的測定采用堿解擴散法；全磷和有效磷含量的測定采用比色法；全鉀和速效鉀含量的測定采用火焰光度法；pH值的測定采用電位測定法［11］。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

1.3.1 序列分析 采用DADA2方法對得到的原始數(shù)據(jù)（raw data）進(jìn)行拼接、去噪過濾［12］，得到有效數(shù)據(jù)（clean data）。然后基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行ASVs（amplicon sequence variants）聚類和物種分類分析［13］。使用QIIME2軟件對ASVs進(jìn)行豐度和Alpha多樣性計算等分析，獲得樣本內(nèi)物種豐富度和均勻度信息、不同樣本或分組間的共有和特有ASVs信息（https：//github.com/QIIME2/q2-feature-classifier）［13］；為進(jìn)一步挖掘分組樣本間的群落結(jié)構(gòu)差異，選用T-test、MetaStat、LEfSe、Anosim和MRPP等統(tǒng)計分析方法對分組樣本的物種組成和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行差異顯著性檢驗［7］；PICRUST2軟件對生態(tài)樣本中的微生物群落進(jìn)行功能預(yù)測分析（https：//github.com/picrust /picrust2/wiki）。

1.3.2 統(tǒng)計分析 采用Microsoft Excel 2016 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和作圖；SPSS 21.0軟件采用最小顯著差異法（LSD）進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA）［7］。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)料在草菇不同發(fā)育階段的養(yǎng)分組成和pH值

對4組草菇發(fā)育不同階段的培養(yǎng)料理化性質(zhì)進(jìn)行分析（表1），培養(yǎng)料pH值在8.14～8.96之間，均為堿性，無顯著性差異。水解性氮和速效鉀含量隨著草菇的生長發(fā)育不斷的提高，各階段呈極顯著差異；全氮和有機質(zhì)含量在二次發(fā)酵后（CK）和發(fā)菌期（F）之間差異不顯著，但出菇期（V）與CK和F處理差異極顯著，全氮含量在V階段提高了10%左右，有機質(zhì)含量提高了2.4%；全磷、有效磷含量和全鉀含量在F階段顯著提高，在V階段顯著下降，與F階段相比，全磷含量下降了12.3%，有效磷含量下降了21.3%，全鉀含量下降了2.9%。

與正常結(jié)實的培養(yǎng)料V相比，同批次不出菇的培養(yǎng)料T在全氮、水解性氮、全磷、全鉀、速效鉀和有機質(zhì)含量等理化性質(zhì)方面均有極顯著差異。相較于F階段，全氮和有機質(zhì)含量表現(xiàn)出相似的上升趨勢，但有效磷和全鉀含量呈現(xiàn)出下降趨勢，水解性氮和速效鉀含量在T階段沒有顯著變化但在V階段顯著提高，全磷含量在T階段中繼續(xù)上升而非如V階段下降。

2.2 培養(yǎng)料在草菇不同發(fā)育階段的細(xì)菌多樣性指數(shù)與群落組成

經(jīng)高通量測序分析，15個樣品共得到有效reads數(shù)832 802條，平均每個樣品55 520條，共檢測到25門、56綱、135目、200科和323屬。每個樣品隨機抽取28 980條reads數(shù)據(jù)進(jìn)行抽平處理，所得的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行ASVs聚類和物種分類分析。通過培養(yǎng)料中細(xì)菌群落的多樣性分析指數(shù)，對草菇不同發(fā)育階段以及不能正常結(jié)實的培養(yǎng)料細(xì)菌群落物種的豐富度和均勻度進(jìn)行了評估。由表2所示，培養(yǎng)料在F和V期的細(xì)菌豐富度指數(shù)（Chao1指數(shù)）和群落多樣性（Ace指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)）與二次發(fā)酵（CK）相比，呈現(xiàn)出增加的趨勢；T和TJ不出菇的培養(yǎng)料細(xì)菌群落的Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)低于V期的培養(yǎng)料，其細(xì)菌多樣性和物種豐富度下降。

培養(yǎng)料中的細(xì)菌群落種類在門水平上有8個門的細(xì)菌在15個樣品中共有（圖1-A）。CK中相對豐度大于1%的細(xì)菌菌群從高到低依次為厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteriota）、芽單胞菌門（Gemmatimonadota）、黏球菌門（Myxococcota）和變形菌門（Proteobacteria），5個優(yōu)勢菌門約占所有細(xì)菌總數(shù)的99%左右（圖1-B）；F階段的培養(yǎng)料厚壁菌門相對豐度由CK時的68.3%降低至51.2%，放線菌門相對豐度從17.7%提高到23.4%，擬桿菌門（Bacteroidota）由CK時的0.04%提高到2.6%，6個優(yōu)勢菌門占到所有細(xì)菌總數(shù)的99%以上（圖1-B）；V階段的培養(yǎng)料中厚壁菌門的相對豐度繼續(xù)降低到18.9%，放線菌門的相對豐度開始下降到11.6%，而變形菌門和擬桿菌門的相對豐度達(dá)到最高（分別為41.3%、22.3%），6個優(yōu)勢菌門約占到所有細(xì)菌總數(shù)的98.4%（圖1-B）。各優(yōu)勢菌門在草菇不同發(fā)育階段的分布均有明顯差異，但變形菌門和擬桿菌門的相對豐度隨著草菇的生長發(fā)育呈上升趨勢說明二者在其中發(fā)揮著重要作用。排在前2位的優(yōu)勢種群的代謝通路均為氨基酸代謝和碳水化合物代謝。

從屬水平（圖1-C），對獲得的323屬中前20個優(yōu)勢屬進(jìn)行多樣性分析。豐富度大于1%的優(yōu)勢屬有19個，分布在草菇不同的發(fā)育階段。CK階段主要屬有厚壁菌門耐熱芽孢桿菌屬（Thermobacillus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、庫特氏菌屬（Kurthia）、Limnochordaceae科未知屬、嗜熱共生菌屬（Symbiobacterium）和科恩氏菌屬（Cohnella）（耐熱），放線菌門熱孢菌屬（Thermobispora）、芽單胞菌門S0134_terrestrial_group以及黏球菌門流行桿菌屬（Vulgatibacter），約占所有優(yōu)勢屬的62.8%；草菇在定植培養(yǎng)料后，在F階段和V階段新出現(xiàn)了放線菌門野野村氏菌屬（Nonomuraea）和異樣根瘤菌屬-新根瘤菌屬-副根瘤菌屬-根瘤菌屬（Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobiu）、變形菌門鞘脂菌屬（Sphingobium）和寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）以及擬桿菌門的噬幾丁質(zhì)菌屬（Chitinophaga）5個優(yōu)勢屬；同時，變形菌門的絲狀微球菌屬（Filomicrobium）和厚壁菌門的芽孢桿菌屬（Geobacillus）、放線菌門的鏈霉菌屬（Streptomyces）、擬桿菌門的鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）在草菇定植后相對豐度提高到1.3%～9.9%（圖1-C）；CK階段和F階段（相對豐度大于5%）的優(yōu)勢屬以高溫的厚壁菌門為主，V階段的細(xì)菌多樣性最高，以變形菌門鞘脂菌屬和擬桿菌門的金黃桿菌屬（Chryseobacterium）為主；有4個門7個綱20個目27個科共51個屬的細(xì)菌僅在V階段出現(xiàn)，其相對豐度均低于1%，其中大于0.5%相對豐度的有拉氏噬冷菌屬（Algoriphagus）、黃桿菌屬（Flavobacterium）和印度副土地桿菌（Parapedobacter）。

2.3 培養(yǎng)料在草菇不同發(fā)育階段的真核生物多樣性指數(shù)與群落組成

利用18S rRNA基因序列高通量測序獲得了15個樣品的所有真核生物種類，反映了樣本間生物種類的差異。15個樣品共得到有效reads數(shù)1 121 536條，平均每個樣品74 769條，共檢測到24門、39綱、55目、70科和76屬。每個樣品隨機抽取35 705條reads數(shù)據(jù)進(jìn)行抽平處理，所得的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行ASVs聚類和物種分類分析。由表3可知，培養(yǎng)料在F和V階段的真核生物Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)與二次發(fā)酵（CK）相比呈現(xiàn)出下降的趨勢，而香濃指數(shù)和辛普森指數(shù)呈上升趨勢。同批次T不出菇的培養(yǎng)料群落的Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、辛普森指數(shù)低于正常出菇的培養(yǎng)料（V），其生物多樣性和物種豐富度下降；不同批次的TJ不出菇培養(yǎng)料的香農(nóng)指數(shù)是最低。

15個樣品的真核生物群落種類在門水平上有11個門共有和5個門特有（圖2-A）。由圖2-B可知，CK中相對豐度大于1%的生物群落從高到低依次為真菌中的子囊菌門（Ascomycota）、毛霉菌門（Mucoromycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）以及原生動物中的絲足蟲門（Cercozo），其中子囊菌門為優(yōu)勢群落，占所有生物總數(shù)的83.7%；F階段子囊菌門相對豐度降低到12.6%，毛霉菌門相對豐度也下降了4.7%，擔(dān)子菌門相對豐度從3.3%提高到37.1%， 褐藻門（Ochrophyta）由CK階段的0.4%上升到了26.2%；V階段的子囊菌門和毛霉菌門的相對豐度繼續(xù)下降，特別是毛霉菌門降低到0.8%，擔(dān)子菌門占所有生物總數(shù)的69.0%，褐藻門雖由F階段的26.2%降到17.6%，但其仍是在擔(dān)子菌門之后的優(yōu)勢群落。此外，在V階段，原生生物雙并鞭蟲（Bicosoecida）的相對豐度從F階段的0.01%提高到2.2%。真菌優(yōu)勢種群的代謝通路排在前2位的均為核苷酸代謝和遺傳基因信息處理的復(fù)制和修復(fù)。

在目水平上（圖2-C），對獲得的所有目中前20個優(yōu)勢目進(jìn)行多樣性分析。豐富度大于1%的優(yōu)勢目有7個，分布在草菇不同的發(fā)育階段。CK階段主要有子囊菌門的酵母目（Saccharomycetales）、毛霉菌目（Mucorales）和散囊菌目（Eurotiales），以及擔(dān)子菌門的傘菌目（Agaricales），約占所有目的94.7%；F階段隨著草菇的定植，傘菌目的相對豐度很快提高到37.0%，子囊菌門的酵母目和糞殼菌目（Sordariales）以及原生動物門的分類地位未定的（Incertae_Sedis）相對豐度提高，毛霉菌目和散囊菌目的相對豐對降低；V階段傘菌目的相對豐度提高到69.0%，超過1%的豐富度的優(yōu)勢目還有酵母目（6.2%）、糞殼菌目（1.3%）和Incertae_Sedis（7.4%），約占所有目的83.9%；草菇定植后，培養(yǎng)料的生物多樣性和豐富度都有所下降。

2.4 生物群落的多樣性對草菇結(jié)實的影響

為研究生物群落的結(jié)構(gòu)及其多樣性對草菇結(jié)實的影響，分別比較分析T和TJ與V階段的細(xì)菌菌落（圖3）、真核生物（圖4）在門和屬水平上的豐富度和組成的差異。細(xì)菌菌落差異分析結(jié)果（圖3）表明， T與V階段有65個屬共有、 27個屬特有，TJ與V階段有51個屬共有、13個屬特有，T和TJ都有博斯氏菌屬（Bosea）和短桿菌屬（Brevibacterium）2個屬，二者相對豐度約占0.1%；T中變形菌門的博德特氏菌屬（Bordetella）的相對豐度較低，而放線菌門的野野村氏菌屬相對豐度顯著提高，與V階段呈現(xiàn)出相反趨勢（圖3-A、圖3-C）；TJ中放線菌門野野村氏菌屬和芽單胞菌門S0134_terrestrial_group的相對豐度低于V階段，而擬桿菌門的噬幾丁質(zhì)菌屬的相對豐度高于V階段（圖3-B、圖3-D）；在所有的樣品中，V階段特有的4個門為纖維桿菌門（Fibrobacterota）的纖維桿菌屬（Fibrobacter）、蛭弧菌門（Bdellovibrionota）、藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）和脫硫桿菌門（Desulfobacterota），除纖維桿菌的相對豐度為0.18%外，后3個的相對豐度均低于0.01%。

真核生物群落差異分析結(jié)果表明，T與V階段有18個屬共有，無特有屬，TJ與V階段有20個屬共有、2個屬特有，T和TJ之間無特有的屬；從門水平看，T中原生動物中絲足蟲門的相對豐度顯著低于V階段；V階段的優(yōu)勢群落褐藻門（26.2%）在TJ樣品中相對豐度僅為1.7%，而真菌群落中子囊菌門的毛殼菌屬（Chaetomium）和畢赤酵母菌屬（Pichia）相對豐度顯著高于V階段，子囊菌門嗜熱真菌屬（Thermomyces）相對豐度下降（圖4）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)料經(jīng)二次發(fā)酵腐食后隨著草菇生長發(fā)育其養(yǎng)分組成和生物群落在相對豐度和組成上表現(xiàn)出較大的時空變化。利用高通量測序，筆者在草菇培養(yǎng)料中共檢測到細(xì)菌25門、56綱、135目、200科、323屬，真核生物24門、39綱、55目、70科、76屬，物種多樣性差異反映了草菇栽培的微生態(tài)群落的功能和動態(tài)變化。二次發(fā)酵后的培養(yǎng)料是以高溫的厚壁菌門和放線菌門為細(xì)菌優(yōu)勢種群，子囊菌門和毛霉菌門為真菌優(yōu)勢種群，這一結(jié)果與已報道的有關(guān)食用菌菌渣為發(fā)酵料的微生物菌群研究較為一致［7］。草菇定植后，細(xì)菌多樣性不斷提高，有4個目7個綱共51個屬的細(xì)菌僅在草菇出菇階段出現(xiàn)，厚壁菌門、放線菌門、子囊菌門和毛霉菌門的相對豐度逐漸降低，而變形菌門、擬桿菌門、擔(dān)子菌門和褐藻門上升為優(yōu)勢種群?？梢?，培養(yǎng)料生物群落的多樣性和物種豐富度受草菇生長發(fā)育的影響。

培養(yǎng)料的發(fā)酵腐熟過程是由多種微生物共同作用而實現(xiàn)的，在這個過程中培養(yǎng)料的營養(yǎng)成分得到充分降解以利于草腐菌的吸收，理化性質(zhì)是微生物群落的重要推動因素［14］。此外，培養(yǎng)料的組成也影響草菇呈味物質(zhì)的組成，以棉籽殼為基質(zhì)栽培草菇，其粗蛋白及水解氨基酸含量及組成最高，以稻草為基質(zhì)栽培草菇，其可溶性糖醇、有機酸含量最高［15］。在對雙孢蘑菇培養(yǎng)料的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及其功能研究中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)料中50%以上的纖維素和60%左右的半纖維素是通過微生物降解得到的，在二次發(fā)酵中纖維素降解的細(xì)菌優(yōu)勢種群為假黃單胞菌屬（Pseudoxanthomona）、高溫單胞菌屬（Thermomonospor）和高溫雙歧桿菌屬（Thermobifida），這個過程會使木質(zhì)纖維素降解為食用菌生長所需的單糖，影響培養(yǎng)料中氮含量、木質(zhì)素含量和灰分含量，為食用菌生長提供營養(yǎng)，因此也成為影響產(chǎn)量的必然因素［16-19］。Kabel等研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)料種類不同，特別是木質(zhì)纖維素組成和結(jié)構(gòu)不同其相關(guān)降解所需的酶系存在較大差異，導(dǎo)致培養(yǎng)料中微生物群落的差異性以及食用菌利用的偏好性和選擇性，從而影響子實體發(fā)生的早晚、多少和質(zhì)地，最終影響食用菌的產(chǎn)量和品質(zhì)［20］。草菇培養(yǎng)料在發(fā)酵過程中，中溫型的細(xì)菌和真菌主要分布在發(fā)酵料的最外層，高溫固氮菌位于內(nèi)層，放線菌、固氮菌、微嗜氮菌在外層和中層差異不大，其群落的組成和分布隨著發(fā)酵進(jìn)程而不同。但培養(yǎng)料中微生物組成與草菇產(chǎn)量的相關(guān)性還未明確，有報道顯示固氮類微生物的多樣性可能與高產(chǎn)性狀相關(guān)［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，以鹿茸菇菌渣為主要基質(zhì)的發(fā)酵料二次發(fā)酵后的培養(yǎng)料中，嗜熱細(xì)菌優(yōu)勢種群以耐熱芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬和熱孢菌屬為主，其預(yù)測的功能是在氨基酸代謝和碳水化合物代謝途徑上；嗜熱真菌是以酵母目、毛霉菌目和散囊菌目為主，其預(yù)測的功能是在核苷酸代謝、復(fù)制和修復(fù)途徑上；隨著草菇的生長發(fā)育，培養(yǎng)料的生物優(yōu)勢種群和種群結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著性變化，細(xì)菌種群新出現(xiàn)了放線菌門野野村氏菌屬和異樣根瘤菌屬-新根瘤菌屬-副根瘤菌屬-根瘤菌屬、變形菌門鞘脂菌屬和寡養(yǎng)單胞菌屬以及擬桿菌門的噬幾丁質(zhì)菌屬等5個優(yōu)勢屬，真核生物種群褐藻門真菌相對豐度從0.4%上升到26.2%。同時，培養(yǎng)料中的氮和鉀養(yǎng)分含量以及pH值在發(fā)菌期和出菇期均顯著上升，而磷在發(fā)菌期顯著上升在出菇期下降，這說明培養(yǎng)料生物群落結(jié)構(gòu)影響基質(zhì)的養(yǎng)分組成。從細(xì)菌和真菌群落優(yōu)勢種群結(jié)構(gòu)來看，二次發(fā)酵料中微生物在培養(yǎng)料的分解代謝和改善培養(yǎng)料理化性質(zhì)中發(fā)揮重要作用，在草菇生長發(fā)育中，放線菌對草菇并無負(fù)面影響，而是進(jìn)一步使木質(zhì)素內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，形成腐殖質(zhì)為草菇提供營養(yǎng)，并且可產(chǎn)生抗生素抑制致病菌，有改善草菇生長的培養(yǎng)料微生態(tài)環(huán)境的作用［22］。在不結(jié)實的培養(yǎng)料中，水解性氮、速效鉀的含量沒有顯著提高，同時全磷的含量繼續(xù)增加，表現(xiàn)出與出菇培養(yǎng)料相反的變化規(guī)律，進(jìn)而使生物群落的豐富度和結(jié)構(gòu)組成出現(xiàn)顯著差異，特別是不出菇的培養(yǎng)料中缺少正常出菇培養(yǎng)料特有的纖維桿菌門的纖維桿菌屬、蛭弧菌門、藍(lán)藻菌門和脫硫桿菌門等。

本研究進(jìn)一步揭示了培養(yǎng)料出菇異常問題可能是培養(yǎng)料微生物群落結(jié)構(gòu)失衡導(dǎo)致的，缺乏特異的菌落來分解成水解性氮、全磷、有效磷和速效鉀養(yǎng)分，而使草菇的出菇能力下降，這可能是導(dǎo)致出菇異常的潛在因素。研究草菇生長發(fā)育中的有益微生物組成和功能，將其提取出來作為生物菌劑或生物表面活性劑添加到培養(yǎng)料中可以顯著改變培養(yǎng)料的微生物群落結(jié)構(gòu)，增加基質(zhì)的養(yǎng)分吸收、改善培養(yǎng)料的微生態(tài)環(huán)境，對提高食用菌品質(zhì)和產(chǎn)量具有重要意義［16，18］。

4 結(jié)論

本研究表明，草菇的生長發(fā)育影響培養(yǎng)料中生物的多樣性，表現(xiàn)為細(xì)菌多樣性呈增加趨勢而真菌多樣性呈下降趨勢。草菇正常出菇與出菇異常的培養(yǎng)料細(xì)菌群落在屬水平上差異較大，正常出菇培養(yǎng)料的優(yōu)勢菌有野野村氏菌屬、異樣根瘤菌屬-新根瘤菌屬-副根瘤菌屬-根瘤菌屬、鞘脂菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬和噬幾丁質(zhì)菌屬，而出菇異常的培養(yǎng)料細(xì)菌群落α多樣性下降。培養(yǎng)料中營養(yǎng)成分包括有機質(zhì)、全氮、水解性氮、全鉀和速效鉀養(yǎng)分含量以及pH值隨著草菇的生長發(fā)育均上升，這與培養(yǎng)料中生物群落結(jié)構(gòu)改變相關(guān)。是否因缺乏某種特異的菌落來分解成水解性氮、全磷、有效磷和速效鉀養(yǎng)分，而使草菇的出菇能力下降，其相關(guān)性需要進(jìn)一步研究證實。

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