劉振平 ，張 丹，黃 瑤

（1.重慶安全技術(shù)職業(yè)學(xué)院，重慶 404020；2.四川丁點兒食品開發(fā)股份有限公司，四川成都 611732；3.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川成都 610039；4.四川家和原味香料有限公司，四川廣漢 618323）

花椒（Zanthoxylum bungeanum）是蕓香科Rutaceae 花椒屬ZanthoxylumL.植物的果實，其干燥成熟的果皮是重要的藥食兩用植物資源[1]。在食品調(diào)味領(lǐng)域，花椒是川菜特色麻味的主要來源，具有增香增色、掩蓋異味、防腐保鮮、促進食欲等作用[2]。在醫(yī)藥領(lǐng)域，花椒有降血脂、抗氧化、抑菌抗蟲、抗腫瘤細(xì)胞增殖等廣泛的藥理學(xué)功能[3]。我國花椒的栽培面積和產(chǎn)量均位于全球首位，全國除東北、內(nèi)蒙古等地外均有種植，資源豐富[4]。漢源花椒色澤丹紅、粒大油重、芳香濃郁、醇麻爽口，深受消費者青睞，位居全國花椒之冠[5]，是中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品。唐元和年間（806 年～820 年）至清光緒二十七年（1901 年）漢源花椒被列為貢品，因此漢源花椒也被稱為“貢椒”[6]。近年來，漢源花椒以其優(yōu)良品質(zhì)享譽全國，名揚海外，表現(xiàn)出了巨大的經(jīng)濟效益和文化價值。但由于利益驅(qū)使，不法分子以劣質(zhì)花椒冒充漢源花椒或者將劣質(zhì)花椒摻入漢源花椒高價銷售，擾亂花椒市場秩序，損害消費者利益。因此，建立簡便有效的漢源花椒鑒別方法具有重要意義。

風(fēng)味成分與食品質(zhì)量之間存在一定的對應(yīng)關(guān)系，基于風(fēng)味物質(zhì)的食品質(zhì)量檢測技術(shù)發(fā)展迅速[7]。風(fēng)味是花椒質(zhì)量的重要評價指標(biāo)，通過對花椒風(fēng)味成分的分析能夠較全面地揭示其質(zhì)量信息[8]。目前，用于食品風(fēng)味分析或鑒別主要有感官法[9]、氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法[10]、氣相離子遷移譜法[11]及電子鼻法[12]等。感官法主要依靠分析人員對食品風(fēng)味的感知并結(jié)合經(jīng)驗做出判斷，簡便快捷，但受主觀因素影響大；氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法和氣相離子遷移譜法設(shè)備昂貴、操作繁瑣；基于電子鼻技術(shù)對食品風(fēng)味成分分析用于食品類別區(qū)分具有簡便、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用食品的無損檢測[13]。

吳莉莉等[14]運用自制電子鼻裝置進行了不同花椒品種風(fēng)味成分分析，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法實現(xiàn)了對花椒品種的高識別率鑒別，張正武等[15]利用電子鼻PEN3.5 系統(tǒng)實現(xiàn)了對隴南34 個花椒品種準(zhǔn)確鑒別，辛松林等[16]通過電子鼻技術(shù)對市售花椒油商品進行了準(zhǔn)確鑒別，這些研究表明通過電子鼻技術(shù)測定和分析風(fēng)味成分能夠?qū)崿F(xiàn)對花椒及其產(chǎn)品的類別區(qū)分。電子鼻檢測技術(shù)已趨于成熟，設(shè)備體積小，便于攜帶，且自帶分析軟件，對于樣品的分析可在幾分鐘內(nèi)完成，操作簡便，可實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測，但針對漢源花椒的鑒別研究未見報道。

本研究利用電子鼻技術(shù)對包括漢源花椒在內(nèi)的全國6 個不同主要產(chǎn)地的紅花椒進行10 個傳感器通道的揮發(fā)性成分測定，并對數(shù)據(jù)分別進行了主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）、線性判別分析（Linear Discriminate Analysis，LDA）和偏最小二乘判別分析（Partial Least Squares Discriminant Analysis，PLS-DA），構(gòu)建漢源花椒的鑒別模型，為漢源花椒的中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品保護及質(zhì)量評價提供新的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

四川漢源花椒及與漢源花椒外觀顏色、顆粒大小類似，從表面難以區(qū)分且常用于冒充或摻假的不同產(chǎn)地的紅花椒，包括四川康定紅花椒、四川鹽源紅花椒、山東萊蕪紅花椒、四川丹巴紅花椒、甘肅臨夏紅花椒 由四川家和原味香料有限公司和四川丁點兒食品開發(fā)股份有限公司提供，均能保證產(chǎn)地來源準(zhǔn)確。

PEN3 便攜式電子鼻系統(tǒng)（配有一組10 個金屬氧化物傳感器） 德國AIRSENSE 公司；JA5003B型電子天平（精度0.001 g） 上海精科儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料的處理 分別將不同產(chǎn)地的鮮紅花椒樣品在40 ℃下干燥24 h，收集干燥果皮。在室溫（25±2） ℃條件下，精密稱取不同產(chǎn)地干燥的紅花椒果皮樣品3 g 置于20 mL 的頂空樣品瓶中，加蓋密封，靜置30 min，待頂空樣品瓶中富集氣體達到平衡后用電子鼻檢測。

1.2.2 電子鼻傳感器類型和性能 本研究采用的PEN3 便攜式電子鼻系統(tǒng)配置的10 個金屬氧化物氣體傳感器，其類型和性能如表1 所示。

表1 電子鼻傳感器類型和性能Table 1 Types and performances of electronic nose sensors

1.2.3 電子鼻分析條件 在使用電子鼻檢測不同產(chǎn)地紅花椒樣品時，傳感器的信號響應(yīng)值從101 s 后開始趨于穩(wěn)定，106 s 后響應(yīng)值基本不發(fā)生變化，達到穩(wěn)定狀態(tài)。因此，取111 s 處采集的信號數(shù)據(jù)用于分析研究。樣品的檢測參數(shù)為：洗氣時間180 s，調(diào)零時間5 s，樣品準(zhǔn)備時間5 s，采用頂空進樣方法，進樣時間120 s，載氣為干燥的空氣，流速300 mL/min。每類樣本設(shè)置6 個平行樣品，每個樣品重復(fù)檢測3 次[15]。

1.2.4 PLS-DA 模型的建立與驗證 采用PEN3 便攜式電子鼻系統(tǒng)自帶WinMuster 分析程序?qū)y得的6 個不同產(chǎn)地紅花椒樣品數(shù)據(jù)進行PCA 和LDA分析。數(shù)據(jù)經(jīng)EXCEL 初步處理后，采用Metabo-Analyst-5.0 進行多元數(shù)據(jù)可視化分析，應(yīng)用PLSDA 評價樣品風(fēng)味成分與產(chǎn)地的相關(guān)性，建立鑒別漢源花椒模型。此外，利用變量投影重要性（Variable Importance for the Projection，VIP）值進行潛在特征類別風(fēng)味成分的篩選。最后，對摻雜不同比例其他產(chǎn)地紅花椒的漢源花椒進行鑒別分析以驗證模型的有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子鼻傳感器對不同產(chǎn)地紅花椒的響應(yīng)

本研究采用的PEN3 便攜式電子鼻系統(tǒng)配置的10 個金屬氧化物氣體傳感器對6 個不同產(chǎn)地紅花椒樣品產(chǎn)生信號響應(yīng)，響應(yīng)情況如圖1 所示，10 個傳感器對6 種花椒樣品均有響應(yīng)，尤其W5S、W2W、W1S、W6S 的信號響應(yīng)明顯，說明6 種不同產(chǎn)地紅花椒風(fēng)味成分中氮氧化合物、含硫和含氯的有機化合物、烷烴類化合物、含氫化合物濃度較高。

圖1 不同產(chǎn)地紅花椒電子鼻10 個傳感器信號響應(yīng)雷達圖Fig.1 The radar map of electronic nose 10 sensors signals response for red Zanthoxylum bungeanum from different origins

熱圖（Heatmap）是一種用顏色變化來反映數(shù)據(jù)信息的方式，可將數(shù)據(jù)之間的差異直觀的通過顏色深淺表示。如圖2 所示，在不同產(chǎn)地紅花椒電子鼻10 個傳感器信號數(shù)據(jù)熱圖中，每一列代表一個樣品，每一行代表一種傳感器，每個小格代表某個樣品中某種傳感器檢測到的數(shù)據(jù)，紅色越深代表對應(yīng)樣品中的對應(yīng)傳感器響應(yīng)的風(fēng)味成分濃度越高，藍(lán)色越深則含量越低。由此，從圖中可以看出，漢源花椒中風(fēng)味成分的10 個傳感器的響應(yīng)數(shù)據(jù)與其他紅花椒明顯不同，即漢源花椒中的風(fēng)味成分與其他5 個不同產(chǎn)地紅花椒中風(fēng)味成分有明顯差異，這是建立有效的漢源花椒鑒別模型的重要基礎(chǔ)。

圖2 不同產(chǎn)地紅花椒電子鼻10 個傳感器信號數(shù)據(jù)熱圖Fig.2 Heat map of electronic nose 10 sensor signals data of red Zanthoxylum bungeanum from different origins

2.2 主成分分析

主成分分析（PCA）是一種常用的有效的多維數(shù)據(jù)降維分析方法，利用PCA 可將原始眾多的特征變量線性變換為低維新特征變量（即幾個綜合因子），保留了原有特征的主要信息，有利于數(shù)據(jù)的直觀分析[17]。圖3 是不同產(chǎn)地紅花椒的PCA 結(jié)果，從圖中可以看出，降維后的新特征變量第一主成分和第二主成分累計貢獻率高達97.47%，代表了樣品的主要特征信息。圖4 是PCA 中電子鼻傳感器對不同產(chǎn)地紅花椒風(fēng)味成分響應(yīng)的載荷圖，它反映的是不同位置分布的傳感器對PCA 圖中分布的不同產(chǎn)地紅花椒響應(yīng)信號的相對強弱，相對位置越近響應(yīng)越強，相對位置越遠(yuǎn)響應(yīng)越弱，例如傳感器W5S 和W2W 對漢源花椒的信號響應(yīng)相對較強，說明它們敏感的風(fēng)味化合物分布相對集中在漢源花椒中。同時也可以看出傳感器W5S 對第一主成分貢獻率最大，傳感器W2W對第二成分貢獻率最大，說明這兩個傳感器的響應(yīng)數(shù)據(jù)對于在PCA 分析中實現(xiàn)漢源花椒與其他產(chǎn)地紅花椒的有效區(qū)分發(fā)揮了重要作用。從圖3 可以看出，6 個不同產(chǎn)地紅花椒均分布于不同區(qū)域，康定紅花椒與丹巴紅花椒有少部分重疊，這可能與兩種紅花椒產(chǎn)地距離較近有關(guān)，漢源花椒特征明顯，與其他5 種紅花椒距離較遠(yuǎn)，說明漢源花椒具有明顯的風(fēng)味特性，電子鼻技術(shù)根據(jù)這些風(fēng)味特性差異能夠?qū)h源花椒與其他5 個產(chǎn)地紅花椒區(qū)分。另外，由于PCA屬于無監(jiān)督的分類方法，僅簡單地利用變量數(shù)據(jù)進行分析，不考慮樣本類別輸出，在圖3 中也可以看出漢源花椒樣品間的離散明顯，為得到更好的結(jié)果，還需要對數(shù)據(jù)進行進一步分析。

圖3 電子鼻傳感器對不同產(chǎn)地紅花椒響應(yīng)數(shù)據(jù)的PCA 得分圖Fig.3 PCA score plot of electronic nose sensors response data of red Zanthoxylum bungeanum from different origins

圖4 電子鼻傳感器對不同產(chǎn)地紅花椒響應(yīng)的載荷圖Fig.4 Loading diagram of electronic nose sensors response for red Zanthoxylum bungeanum from different origins

2.3 線性判別分析

對電子鼻10 個傳感器類型測得的6 個不同產(chǎn)地紅花椒數(shù)據(jù)進行線性判別分析（LDA）。LDA 是一種有監(jiān)督的降維且有類別輸出的分析技術(shù)，其目標(biāo)是使降維后的數(shù)據(jù)類內(nèi)方差最小，類間方差最大，即對數(shù)據(jù)在低維度上進行投影，投影后同一個類別數(shù)據(jù)的投影點盡可能接近，而不同類別的數(shù)據(jù)中心之間的距離盡可能的大。圖5 是電子鼻對不同產(chǎn)地紅花椒揮發(fā)性成分的LDA 圖，從圖中可以看出，第一主成分和第二主成分總的區(qū)分貢獻率為87.67%，這兩個主成分也基本代表了樣品的主要特征信息，漢源花椒所處區(qū)域獨立于其他5 種紅花椒，表明LDA 能夠較好地將漢源花椒與其他紅花椒區(qū)分，同時，漢源花椒平行樣品間的離散度較小，類別特征顯著。由上可知，本研究構(gòu)建的基于電子鼻技術(shù)的LDA 模型能夠?qū)崿F(xiàn)對漢源花椒的準(zhǔn)確鑒別。

圖5 電子鼻傳感器對不同產(chǎn)地紅花椒響應(yīng)的LDA 圖Fig.5 LDA diagram of electronic nose sensors response to red Zanthoxylum bungeanum from different origins

2.4 PLS-DA“是-否”鑒別模型構(gòu)建

為了建立更直觀、更簡便的漢源花椒鑒別模型，我們引入了偏最小二乘判別分析（PLS-DA）的理論與方法對基于電子鼻技術(shù)測得的不同產(chǎn)地紅花椒數(shù)據(jù)進行深入分析與挖掘。PLS-DA 是一種有監(jiān)督的降維判別分析方法，其數(shù)學(xué)原理是將變量數(shù)據(jù)與分類信息劃分為兩組數(shù)據(jù)集，通過投影與判別計算，借助分組信息挖掘組間差異進而將每一組樣本區(qū)分。本研究在進行分析前，首先將樣品數(shù)據(jù)分為漢源花椒和其他產(chǎn)地紅花椒兩類以便建立更直觀的漢源花椒“是-否”鑒別模型，其次對數(shù)據(jù)進行了指數(shù)轉(zhuǎn)換歸一化和Auto Scaling 標(biāo)準(zhǔn)化，以消除或減少背景造成的干擾以及與實驗原始數(shù)據(jù)的不必要偏差。圖6 為漢源花椒PLS-DA 鑒別模型的二維得分圖，從圖中可以看出漢源花椒與其他紅花椒所在的區(qū)域均相對獨立，說明漢源花椒與其他產(chǎn)地紅花椒的特征差異非常明顯，以此為依據(jù)能夠較好的將漢源花椒與其他產(chǎn)地紅花椒分開，實現(xiàn)漢源花椒的有效鑒別。

圖6 漢源花椒與其他產(chǎn)地紅花椒鑒別PLS-DA 得分圖Fig.6 PLS-DA score diagram for Hanyuan Zanthoxylum bungeanum identification from other geographical origin

內(nèi)部交叉驗證（Cross Validation，CV）是小樣本模型常用的驗證方法，并將預(yù)測能力參數(shù)（Q2）和擬合優(yōu)度值（R2）作為評價模型性能的指標(biāo)[18]，Q2和R2分別代表模型的預(yù)測能力和解釋效果，Q2通過交叉驗證計算，即：

PRESS 為驗證過程中所有樣本的預(yù)測殘差平方和。在模型質(zhì)量評價中Q2比R2更重要，Q2的極限值為1，一般認(rèn)為Q2＞0.4 表示所建模型是可接受的有效模型[19]。R2是Q2經(jīng)交叉驗證前的值，它表示模型預(yù)測值（）與實際值（y）的適應(yīng)度，計算公式如下：

隨著潛在變量的增加，R2逐漸接近1。本研究的交叉驗證結(jié)果如圖7 所示，Q2和R2分別為0.947和0.968，表明所構(gòu)建的漢源花椒鑒別模型是有效的。

圖7 漢源花椒鑒別模型交叉驗證結(jié)果Fig.7 Results of cross verification for Hanyuan Zanthoxylum bungeanum identification model

置換驗證通過執(zhí)行隨機安排的樣本數(shù)據(jù)，Ydata 的位置隨機移位，以不同的順序出現(xiàn)[20]，然后統(tǒng)計推斷，可增加模型中的樣本數(shù)量，因此特別適用于樣本較少的模型[21]。在本研究構(gòu)建的漢源花椒鑒別模型使用的 MetaboAnalyst-5.0 平臺中，置換模擬驗證只要能推測出“只有極少數(shù)（5%）置換模擬的Q2值比當(dāng)前的Q2值大”即可認(rèn)為是沒有出現(xiàn)過擬合。本研究100 次置換驗證的結(jié)果如圖8 所示，置換模擬中Q2值比當(dāng)前的Q2值大的概率（P）均小于0.01，表明所構(gòu)建的PLS-DA 模型未出現(xiàn)過擬合，穩(wěn)健有效。

圖8 漢源花椒鑒別模型置換驗證結(jié)果Fig.8 Results of permutation verification for Hanyuan Zanthoxylum bungeanum identification model

在PLS-DA 模型中，變量投影重要性（Variable Importance for the Projection，VIP）值是評估各特征變量在類群區(qū)分中貢獻大小的重要參數(shù)，主要用于揭示特征變量與聚類分析的相關(guān)性[22]。一般情況下，VIP 值大于1 的變量被認(rèn)為是潛在特征變量，VIP 值越大的特征變量對于聚類鑒別模型有效性的貢獻就越大[23-24]，一個X 變量VIP 值的計算方法如下：

其中VIPj表示第j 個變量的VIP 值，p 為X 變量的數(shù)量，k 是h 個潛變量中的第k 個潛變量，ck為第k 個潛變量的回歸權(quán)值，wjk是X 變量的權(quán)矩陣w 的第k 列的第j 個元素[21]。本研究PLS-DA 模型的VIP 值如圖9 所示，VIP 值大于1 的變量分別為W6S、W3C、W3S、W1C、W5C 和W2S，這些變量代表的是對相應(yīng)傳感器響應(yīng)的風(fēng)味成分，即含氫化合物、芳香類成分及氨類、脂肪族烷烴類化合物、芳香成分及苯類、短鏈烷烴芳香類成分、醇類及醛酮類化合物。以上結(jié)果表明，這幾類化合物是漢源花椒與其他產(chǎn)地紅花椒具有顯著差異的重要特征變量，在漢源花椒鑒別中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

圖9 PLS-DA 鑒別模型VIP 值Fig.9 VIP value of PLS-DA identification model

2.5 摻雜鑒別驗證

為了驗證本研究建立的漢源花椒鑒別模型的有效性，在漢源花椒中摻入等比例混合的四川康定紅花椒、四川鹽源紅花椒、山東萊蕪紅花椒、四川丹巴紅花椒、甘肅臨夏紅花椒，摻雜比例分別為5%、10%、30%及50%，各摻雜比例分別設(shè)置6 個平行樣品，在相同的條件下測定電子鼻響應(yīng)數(shù)據(jù)，將測得數(shù)據(jù)用已建立的LDA 和PLS-DA 鑒別模型分析。分析結(jié)果為24 個摻雜的漢源花椒樣品均未被判定為漢源花椒，這表明本研究構(gòu)建的基于電子鼻技術(shù)的LDA 和PLS-DA 鑒別模型能夠?qū)崿F(xiàn)對漢源花椒5%以上比例摻雜的準(zhǔn)確鑒別。

3 結(jié)論

電子鼻技術(shù)在食品分析中應(yīng)用廣泛，設(shè)備簡單，容易攜帶，操作簡便。風(fēng)味成分組成是香辛料質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)，基于電子鼻技術(shù)的風(fēng)味成分分析對于香辛料的質(zhì)量評價與其他種類食品相比有更明確的目標(biāo)靶向性。本研究運用電子鼻技術(shù)對中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品漢源花椒及其他5 個不同產(chǎn)地的紅花椒進行了10 個傳感器通道的風(fēng)味成分測定，并采用PCA、LDA 和PLS-DA 的理論與方法進行分析，構(gòu)建了能夠?qū)h源花椒與其他5 種紅花椒區(qū)分的鑒別模型。同時，利用摻雜比例分別為5%、10%、30%及50%的漢源花椒樣品對LDA 和PLS-DA 模型的有效性進行了驗證，驗證結(jié)果表明所構(gòu)建模型能夠?qū)崿F(xiàn)對各摻雜比例的漢源花椒的準(zhǔn)確鑒別，為漢源花椒的中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品保護、質(zhì)量控制和產(chǎn)地溯源提供了新的技術(shù)參考。另外，通過VIP 值分析得到的對于漢源花椒鑒別具有關(guān)鍵作用的含氫化合物、芳香類成分及氨類、脂肪族烷烴類化合物、芳香成分及苯類、短鏈烷烴芳香類成分、醇類及醛酮類化合物，為后續(xù)通過靶向目標(biāo)物進行紅花椒產(chǎn)地鑒別研究奠定了基礎(chǔ)。