葉 洪，周雪瑞，王 素，張瀠月，孫 月，曾朝懿，張 慶，唐 潔

（西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川成都 610036）

臍橙（Navel orange）屬薔薇亞綱無患子目蕓香科柑橘屬，是柑橘品種中最優(yōu)良的甜橙種類，含有多種常量和微量元素、維生素、氨基酸、膳食纖維等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]。經(jīng)常食用臍橙具有解油膩、分解脂肪、醒酒、促進(jìn)腸道蠕動(dòng)、清腸通便、增進(jìn)食欲等功效[2]。

目前，臍橙飲品主要是單一酵母菌或酵母菌與非釀酒酵母菌發(fā)酵，研究主要集中在果酒[3]、果醋[4]以及發(fā)酵工藝的優(yōu)化，針對(duì)臍橙飲品中酵母菌與乳酸菌共發(fā)酵特性的研究較少。釀酒酵母菌[5]和植物乳桿菌[6]共發(fā)酵是一個(gè)生物混合體系，體系中微生物之間大多具有生長(zhǎng)代謝協(xié)調(diào)作用[7]。有相關(guān)研究報(bào)道，乳酸菌和酵母菌共發(fā)酵不但能夠相互促進(jìn)生長(zhǎng)，而且可以獲得某些純種發(fā)酵不易得到的產(chǎn)物，這些物質(zhì)賦予了飲品獨(dú)特的風(fēng)味和口感[8-10]。Sun 等[11]研究了酵母菌LAIVIN RC212 與乳酸菌PL18 共同接種對(duì)櫻桃酒化學(xué)和感官特性的影響，不僅使共發(fā)酵的揮發(fā)性物質(zhì)更多，而且縮短了發(fā)酵時(shí)間；陳毅堅(jiān)等[12]利用乳酸菌RSJ-1 與酵母菌JMJ-1 發(fā)酵新型乳制品，使苯乙醇和3-甲基丁醇等風(fēng)味物質(zhì)含量大大增加；馬麗娟等[13]利用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）發(fā)酵菠蘿汁，發(fā)現(xiàn)該飲品既保留了菠蘿原有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和特有香氣，還賦予一定的發(fā)酵風(fēng)味。金曉帆[14]利用酵母菌DV10 與植物乳桿菌（Saccharomyces cerevisiae）發(fā)酵芒果漿，使得醇類、酯類以及總酚含量增加，抗氧化能力更強(qiáng)。

本文以臍橙汁為原料，利用實(shí)驗(yàn)室保藏的酵母菌和乳酸菌菌株進(jìn)行共菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以單一菌株發(fā)酵為對(duì)照，探究發(fā)酵過程中臍橙飲品的活菌數(shù)、酒精度、還原糖、總酚、抗氧化性、揮發(fā)性香氣物質(zhì)變化特性，為釀酒酵母和植物乳桿菌共發(fā)酵臍橙飲品的開發(fā)提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

臍橙 四川金堂臍橙果園，直徑約75～80 mm，無公害；酵母菌（釀酒酵母SC-125）、乳酸菌（植物乳桿菌B-5） 均由西華大學(xué)古法發(fā)酵（釀造）生物技術(shù)研究所保藏；乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（MRS）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（YPD） 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；1,1-二苯-2-庫基肼（DPPH 試劑） 成都市科隆化學(xué)品有限公司；3,5-二硝基水楊酸 福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；仲辛醇 成都市科隆化學(xué)品有限公司；以上試劑均為分析純。

FA1104 型電子天平 上海舜宇恒平有限公司；BPH-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；INFINITEF200 型酶標(biāo)儀 上海閃譜生物科技有限公司；GCMS-QP2020NX 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 島津公司；5804R 型冷凍離心機(jī) Eppendorf 公司；PEN3 型電子鼻 德國(guó)AIRSENSE 公司；G154DWS型全自動(dòng)高壓滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 臍橙飲品發(fā)酵試驗(yàn) 將臍橙鮮果的皮殼和核去掉，用榨汁機(jī)將果肉榨汁制備成果漿狀，以3000 r/min 離心30 min，120 目分樣篩過濾后取上清液置于250 mL 發(fā)酵容器中，于60 ℃巴氏滅菌15 min。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定最佳接種量和種子液濃度，同時(shí)將釀酒酵母菌SC-125、植物乳桿菌B-5 活化（釀酒酵母菌種子液濃度為106CFU/mL，植物乳桿菌種子液濃度為108CFU/mL）按2%的比例添加，30 ℃恒溫靜置發(fā)酵，設(shè)置三個(gè)平行，使用阿貝折光儀檢測(cè)發(fā)酵狀態(tài)，直至可溶性固形物穩(wěn)定，主發(fā)酵結(jié)束。期間每隔12 h 進(jìn)行取樣，在超凈臺(tái)收集臍橙發(fā)酵上清液，將其-50 ℃冷凍保存。

1.2.2 菌落計(jì)數(shù)方法 用PDA 瓊脂平板計(jì)數(shù)法和MRS 瓊脂平板計(jì)數(shù)法分別測(cè)定釀酒酵母SC-125 和植物乳桿菌B-5 協(xié)同發(fā)酵臍橙汁在不同發(fā)酵階段的活細(xì)胞數(shù)。同時(shí)分別以兩種菌株單獨(dú)發(fā)酵臍橙為對(duì)照?；罴?xì)胞數(shù)以每毫升菌落形成單位（CFU/mL）表示。

1.2.3 臍橙飲品理化指標(biāo)的測(cè)定 可溶性固形物：手持糖度儀測(cè)定；pH：pH 計(jì)測(cè)定；均參照GB/T 15038-2006 的方法[15]；還原糖含量：參照高文軍等[16]的DNS 法；總酚：福林酚法[17],以沒食酸計(jì)。

1.2.4 酒精度的測(cè)定 酒精度含量的測(cè)定參照Fulgencio 等[18]通過外標(biāo)法利用氣相色譜測(cè)定白酒酒精度，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=5255.3x-769.1，R2=0.998。

色譜條件：初始溫度45 ℃，保持5 min，以3 ℃·min-1升溫至60 ℃，保持3 min，以20 ℃·min-1升溫至200 ℃，保持5 min。色譜柱為Rtx-Wax 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為高純度氦氣，載氣流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度: 200 ℃。

1.2.5 臍橙飲品抗氧化能力測(cè)定

1.2.5.1 DPPH 自由基清除率 取1 mL 待測(cè)臍橙飲品溶液和1 mL 0.5 mmol·L-1的DPPH 溶液，搖勻避光靜置30 min，于517 nm 處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)1，同時(shí)用蒸餾水做空白對(duì)照，無水乙醇做陽性對(duì)照[19]。DPPH 自由基清除率計(jì)算公式如式（1）：

式中：A0為蒸餾水代替臍橙飲品溶液的吸光度；A1為加入臍橙飲品溶液的吸光度；A2為無水乙醇代替DPPH 溶液的吸光度。

1.2.5.2 羥基自由基清除率 參考Hui 等[20]的方法，精確吸取9 mmol·L-1硫酸亞鐵1 mL，加入1 mL 9 mmol·L-1水楊酸乙醇溶液，然后加入酒樣1 mL，最后加入8.8 mmol·L-1的H2O21 mL，搖勻后在37 ℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min，在波長(zhǎng)510 nm下測(cè)定吸光度A1，同時(shí)用甲醇做空白對(duì)照，蒸餾水代替H2O2做陽性對(duì)照。羥基自由基清除率計(jì)算公式如式（2）：

式中：A0為甲醇代替臍橙飲品溶液的吸光度；A1為加入臍橙飲品溶液的吸光度；A2為蒸餾水代替H2O2溶液的吸光度。

1.2.6 揮發(fā)性成分的分析

1.2.6.1 樣品預(yù)處理 參照文獻(xiàn)[21-22]的方法，基于HS-SPME/GC-MS 對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)的分析，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析，內(nèi)標(biāo)選用濃度為0.4175 mg·L-1的仲辛醇。取3.8 mL 發(fā)酵樣品加入0.2 mL 稀釋的仲辛醇（用超純水稀釋1×105倍），置于頂空瓶中，加入1 g NaCl，加蓋密封，放入60 ℃恒溫水浴中平衡20 min，將老固相微萃取器插在樣品瓶上，吸附20 min 后拔出，插入氣相色譜儀進(jìn)樣口，于220 ℃解吸3 min，進(jìn)行GC-MS 檢測(cè)分析。

1.2.6.2 GC-MS 檢測(cè)條件 a.氣相色譜條件：色譜柱為DB-Wax（30 mm×0.25 mm×0.25 μm），進(jìn)樣溫度為240 ℃；程序升溫：初始溫度40 ℃保持2 min；以6 ℃·min-1升至240 ℃保持4 min；載氣為氦氣，線速為1.0 mL·min-1，不分流。

b.質(zhì)譜條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量為70 eV，燈絲流量為0.20 mA，離子源溫度為200 ℃，接口溫度為250 ℃。

1.2.7 電子鼻香氣成分的測(cè)定 電子鼻可對(duì)特定香氣成分進(jìn)行響應(yīng)，然后可以通過模式識(shí)別算法來執(zhí)行區(qū)分和分類[23]。為了研究臍橙汁發(fā)酵過程中風(fēng)味的變化，分析發(fā)酵中的風(fēng)味變化，采用頂空吸氣法[24]檢測(cè)，比較氣味的差異性，并使用Origin 2018 進(jìn)行主成分分析對(duì)其風(fēng)味特征進(jìn)行比較，表1 為電子鼻的10 個(gè)傳感器性能。

表1 電子鼻的10 個(gè)傳感器的性能Table 1 Ten sensors performance of the e-nose

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 進(jìn)行顯著性分析，柱狀圖折線圖采用 Origin 2018 進(jìn)行繪制，每組試驗(yàn)三個(gè)平行，所有結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 臍橙發(fā)酵過程中活菌數(shù)和pH 的變化

在臍橙發(fā)酵初期，酵母菌SC-125 和植物乳桿菌B-5 都能很好的代謝臍橙中的有機(jī)質(zhì)，表現(xiàn)出了較好的生長(zhǎng)能力。如圖1A 所示，在共發(fā)酵前期，酵母菌SC-125 迅速增加達(dá)約8.0 CFU·mL-1，這是由于臍橙汁中的還原糖為酵母菌提供了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。盡管隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，共發(fā)酵酵母菌SC-125 活菌數(shù)在降低，但共發(fā)酵中的植物乳桿菌B-5 活菌數(shù)保持相對(duì)的穩(wěn)定，其利用酵母代謝產(chǎn)物和還原糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝產(chǎn)生了乳酸、氨基酸等[25]，使飲品中的可滴定酸含量升高，導(dǎo)致pH 下降（如圖1B 所示）。葡萄酒pH 的最佳活性是2.5～3.8，三種不同菌種發(fā)酵飲品的pH 均在此范圍，而且都有下降趨勢(shì)，pH 的大小會(huì)影響最終產(chǎn)品中高級(jí)醇的含量，從而影響飲品的風(fēng)味。

圖1 臍橙發(fā)酵過程中活菌數(shù)（A）和pH（B）的變化趨勢(shì)Fig.1 Variation trend of viable count (A) and pH (B) during navel orange fermentation

2.2 臍橙發(fā)酵過程中酒精度和還原糖含量的變化

還原糖的利用表明了酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵和底物轉(zhuǎn)化的能力[26]，而微生物對(duì)糖的耐受性和利用率也成為發(fā)酵終點(diǎn)判斷的重要指標(biāo)之一。如圖2 所示，在發(fā)酵前期，釀酒酵母SC-125 單獨(dú)發(fā)酵和共培養(yǎng)的還原糖含量從70.31 g·L-1迅速下降，分別達(dá)到3.4 和3.2 g/L，符合葡萄酒還原糖的標(biāo)準(zhǔn)[15]，即4 g/L 以下；臍橙飲品酒精度持續(xù)升高，0～96 h，釀酒酵母SC-125 單獨(dú)發(fā)酵的酒精度比共發(fā)酵的酒精度高，酒精度都在60 h 時(shí)達(dá)到最高峰，說明植物乳桿菌B-5 同型乳酸發(fā)酵利用還原糖生長(zhǎng)繁殖，與釀酒酵母SC-125 共發(fā)酵中能起到一定的降低酒精度的作用。整個(gè)發(fā)酵過程中，共發(fā)酵酒精度在0～6%左右，發(fā)酵終點(diǎn)酒精度為5.2%，與葡萄酒低醇標(biāo)準(zhǔn)6%以下相符。

圖2 臍橙發(fā)酵過程中酒精度和還原糖含量的變化Fig.2 Changes in alcohol content and reducing sugar content during navel orange fermentation

2.3 臍橙發(fā)酵過程中總酚含量的變化和臍橙飲品抗氧化能力分析

由于酵母細(xì)胞會(huì)對(duì)酚類物質(zhì)產(chǎn)生吸附作用，隨著發(fā)酵液環(huán)境的變化，又會(huì)產(chǎn)生解吸作用[27]，從圖3A 可知，對(duì)照組釀酒酵母SC-125 單獨(dú)發(fā)酵過程中，總酚含量差異波動(dòng)較大，而隨著植物乳桿菌B-5 的添加，共發(fā)酵總酚含量最高，共發(fā)酵總酚含量從338.78 mg·L-1上升到355.5 mg·L-1，相比對(duì)照組酵母SC-125 總酚提高了7.73%。共發(fā)酵對(duì)DPPH 自由基的清除率和羥基自由基清除率最高，這與總酚含量的變化是一致的，共發(fā)酵臍橙飲品的抗氧化能力與總酚含量呈正相關(guān)關(guān)系，這與王東偉等[28]的研究是一致的。如圖3B 所示，對(duì)照組釀酒酵母SC-125、對(duì)照組植物乳桿菌B-5 以及共發(fā)酵對(duì)DPPH 自由基的清除率分別由臍橙汁的62.67%提高到75.54%、72.45%、78.82%，對(duì)羥基自由基的清除率分別由初始的68.77%提高到74.71%、71.82%、77.08%。共發(fā)酵對(duì)DPPH 自由基的清除率和羥基自由基清除率最高，。證明菌株的協(xié)同作用發(fā)酵有利于抗氧化活性的增加，且共發(fā)酵的抗氧化能力效果最佳。

圖3 臍橙發(fā)酵過程中總酚含量（A）的變化和自由基清除率（B）Fig.3 Changes of total phenolic content (A) and free radical scavenging rate (B) during navel orange fermentation

2.4 臍橙發(fā)酵飲品揮發(fā)性物質(zhì)及電子鼻主成分分析

通過對(duì)發(fā)酵結(jié)束后的樣品進(jìn)行HS-SPME/GCMS 進(jìn)行分析，得到如圖4 及表2 的結(jié)果。釀酒酵母SC-125 單菌發(fā)酵共有41 種揮發(fā)性成分，含有16 種酯類、16 種醇類、4 種酸類、4 種醛酮類、1 種其他類；植物乳桿菌B-5 單菌發(fā)酵共檢測(cè)出38 種，含有15 種酯類、15 種醇類、3 種酸類、4 種醛酮類、1 種其他類；共發(fā)酵共檢測(cè)出53 種揮發(fā)性成分，包括23 種酯類、19 種醇類、4 種酸類、5 種醛酮類、2 種其他類。相比于釀酒酵母SC-125 和植物乳桿菌B-5，共發(fā)酵后有更多的風(fēng)味物質(zhì)，還產(chǎn)生特有的揮發(fā)性成分，如甲酸異丙酯、十一酸乙酯、乙酸異丁酯、丁酸甲酯、四氫芳樟醇、1-十四醇、2-戊醇、十一醛、2-硝基丙烷，這些物質(zhì)賦予臍橙飲品醚香、梨子、蘋果、干酪、玫瑰和木香橙皮等香氣特征，這與之前的研究類似，即酵母菌與乳酸菌共發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生更多的揮發(fā)性物質(zhì)[30]。

圖4 臍橙飲品揮發(fā)性成分總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram of volatile components in navel orange beverage

表2 三種發(fā)酵方式的臍橙飲品揮發(fā)性物質(zhì)的含量Table 2 Content of volatile substances in three kinds of fermented navel orange drinks

續(xù)表2

酯類化合物對(duì)果酒的主體香型具有重要的作用，是構(gòu)成果酒香氣的重要物質(zhì)[31]。共發(fā)酵酯類物質(zhì)含量和種類高于酵母菌SC-125 和植物乳桿菌B-5，其中酵母菌SC-125 的酯類物質(zhì)種類及含量高于植物乳桿菌B-5，主要產(chǎn)生的香氣物質(zhì)有乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯、乙酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯和3-羥基己酸乙酯，共發(fā)酵使這些物質(zhì)的含量分別提高到479.54、407.48、309.44、273.51、65.24 、127.57 μg/L。乙酸苯乙酯[32]呈草莓香味，月桂酸乙酯呈油脂水果味，乙酸乙酯具有果子的芳香，癸酸乙酯具有白蘭地和果香，辛酸乙酯具有花香和酒香，增加了臍橙飲品的復(fù)雜性。

醇類物質(zhì)是果酒中的主要香氣成分，主要通過糖代謝分解產(chǎn)生或是果酒中氨基酸轉(zhuǎn)化形成[33]。對(duì)比三種發(fā)酵方式，醇類物質(zhì)在種類和含量上均有不同，其中在共發(fā)酵中種類更多，含量最高，主要的醇類物質(zhì)如：苯乙醇、4-萜烯醇[34]、異戊醇和正己醇。苯乙醇具有溫和淡雅的玫瑰花氣味，4-萜烯醇呈胡椒香和較淡的泥土香，異戊醇有蘋果白蘭地香氣，正己醇微帶酒香和果香。張毅堅(jiān)等[12]的研究表明酵母菌與植物乳桿菌共培養(yǎng)增加了更多的醇類物質(zhì)，使發(fā)酵制品具有更好的風(fēng)味。

酸類物質(zhì)是酵母代謝產(chǎn)生的次級(jí)物質(zhì)，在本研究中，酸類物質(zhì)主要有辛酸、庚酸、油酸和9-癸烯酸，共發(fā)酵的酸類物質(zhì)含量比單菌發(fā)酵含量更少，這可能是共發(fā)酵中的酸與醇發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生更多酯類物質(zhì)[35]。

醛酮類和其他類物質(zhì)在本試驗(yàn)中含量占比較少，如正辛醛、3-羥基-2-丁酮和2-甲基吡嗪，正辛醛呈果香、茉莉香氣，3-羥基-2-丁酮呈奶油香氣，2-甲基吡嗪有牛肉加熱時(shí)的香味和果仁香味，這些物質(zhì)與酯類、醇類和酸類物質(zhì)相互協(xié)同，賦予了飲品更多的風(fēng)味。

2.5 通過電子鼻比較臍橙飲品香氣成分

由圖5 可知，第一主成分區(qū)分貢獻(xiàn)率為83.9%，第二主成分區(qū)分貢獻(xiàn)率為8.2%，兩個(gè)主成分區(qū)分貢獻(xiàn)率和為92.1%，大于90%，表明兩個(gè)主成分已經(jīng)基本代表了樣品的主要信息特征[36]，而且風(fēng)味相互獨(dú)立，整體區(qū)分度較好，其中W5S、W1S、W2S 貢獻(xiàn)較大，他們分別對(duì)氮氧化合物、短鏈烷烴、乙醇靈敏。PCA 顯示臍橙發(fā)酵飲品與臍橙原汁區(qū)分明顯，共發(fā)酵與單菌發(fā)酵的臍橙飲品在第一主成分和第二主成分上雖然有交叉，但是雷達(dá)圖可以明顯看出，共發(fā)酵10 個(gè)傳感器得分均高于臍橙原汁和單菌，尤其在W5S、W1S、W2S 三個(gè)傳感器的得分更高，因此判斷共發(fā)酵飲品香氣物質(zhì)相較于臍橙原汁以及單菌發(fā)酵飲品更加豐富。

圖5 臍橙原汁與不同發(fā)酵飲品的PCA 圖和雷達(dá)圖Fig.5 PCA and radar plots of navel orange juice and different fermented beverage

3 結(jié)論

本研究以金堂臍橙為發(fā)酵原料，首次利用釀酒酵母和植物乳桿菌發(fā)酵臍橙飲品，并比較了釀酒酵母SC-125 和植物乳桿菌B-5 單獨(dú)發(fā)酵以及共發(fā)酵臍橙過程中各項(xiàng)指標(biāo)的變化規(guī)律，結(jié)果表明：在共發(fā)酵前期釀酒酵母SC-125 迅速繁殖，還原糖含量下降；酒精度持續(xù)上升后下降最終達(dá)到為5.33%，低于釀酒酵母SC-125 單獨(dú)發(fā)酵；其抗氧化能力強(qiáng)，共揮發(fā)性成分的種類更加豐富，特有成分賦予了共發(fā)酵的臍橙飲品椰子、堅(jiān)果和醚香等香氣；結(jié)合主成分分析，共發(fā)酵飲品對(duì)氮氧化合物、短鏈烷烴、乙醇更加靈敏?？傮w來說，釀酒酵母與植物乳桿菌協(xié)同發(fā)酵制備臍橙飲品口感酸甜適中，香氣濃郁，為臍橙風(fēng)味飲品提供了理論依據(jù)和技術(shù)參考。后續(xù)還可以針對(duì)臍橙飲品的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步探討不同菌種接種量及其接種順序等因素對(duì)臍橙飲品品質(zhì)的影響。