林秀燕，石宏

1 河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，石家莊 050017；2 河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院兒童口腔科；3 河北省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室；3 河北省口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心

低齡兒童齲（Early childhood caries，ECC）是臨床最常見的兒童口腔疾病，其患病率高居兒童疾病的首位，是患病率第2 位的哮喘病的5 倍［1］。ECC 可導(dǎo)致兒童乳牙缺損、根尖周炎、乳牙滯留，影響恒牙的正常替換，嚴(yán)重者可引起全身其他器官的感染與損害，對兒童的身心健康造成極大危害。ECC 的發(fā)生發(fā)展可能與細(xì)菌、宿主、飲食等因素密切相關(guān)，口腔微生物群落的存在和生態(tài)失調(diào)可能在ECC 的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［2］。既往研究［3］認(rèn)為，變形鏈球菌是齲病的主要致齲菌之一，在重度低齡兒童齲（Severe early childhood caries，SECC）的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。然而基于傳統(tǒng)致病菌的治療未能有效降低齲病的發(fā)生率，可見以變形鏈球菌為主的單一致病菌理論無法完全反映口腔微生物在ECC 發(fā)生發(fā)展中的作用。最新研究［4］認(rèn)為，齲齒并不是單純由變形鏈球菌導(dǎo)致的，口腔微生物群落的整體平衡的改變導(dǎo)致齲齒的發(fā)生。有學(xué)者認(rèn)為雙歧桿菌、韋榮球菌及耐瑟氏菌是益生菌，可維持人體口腔健康；但部分學(xué)者認(rèn)為，雙歧桿菌、韋榮球菌及耐瑟氏菌具有一定致齲性，與ECC 的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。目前，雙歧桿菌、韋榮球菌及耐瑟氏菌在ECC 發(fā)生發(fā)展中的作用及作用機制已有部分研究報道。 現(xiàn)將雙歧桿菌，韋榮球菌、耐瑟氏菌的生物學(xué)特點及其在ECC 發(fā)生發(fā)展中的作用及作用機制研究進展進行綜述。

1 雙歧桿菌生物學(xué)特點及其在ECC 發(fā)生發(fā)展中的作用和作用機制

1.1 雙歧桿菌的生物學(xué)特點 雙歧桿菌屬［5］是一群具有多形態(tài)、無動力的革蘭陽性無芽孢厭氧菌，其最適pH 值為6.5～7.0，最適生長溫度為37～41 ℃，是一種耐酸微生物。該菌屬首先從嬰兒糞便中分離到，生化反應(yīng)特征為過氧化氫酶陰性，具有Y 形特征，G+C含量高，雙歧桿菌與絕大多數(shù)糖類的分解代謝途徑不同，其主要依賴于果糖-6-磷酸解酮酶，而產(chǎn)物不生成二氧化碳、丁酸、丙酸，其主要代謝產(chǎn)物中的乳酸、乙酸以及少量的甲酸的等量比例會隨菌株不同形成差異。雙歧桿菌與腸壁相互作用維護腸道內(nèi)生理環(huán)境，具有調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系、產(chǎn)生抗菌物質(zhì)、增強免疫系統(tǒng)等生理功能，被認(rèn)為是人體益生菌［6-7］。迄今為止，已經(jīng)分離鑒定的雙歧桿菌（亞種）有88種，多數(shù)來自人類腸道和口腔、動物胃腸道［7-8］，比如棲牙雙歧桿菌、齒雙歧桿菌及殊形雙歧桿菌主要在人體口腔中發(fā)現(xiàn)。細(xì)菌的產(chǎn)酸能力和耐酸性與齲病的發(fā)生密切相關(guān)，當(dāng)口腔環(huán)境中pH 值小于5.5時，牙釉質(zhì)開始脫礦。研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌屬里長雙歧桿菌、動物雙歧桿菌的產(chǎn)酸性最強，芽孢桿菌的產(chǎn)酸能力最低［8］，表明不是所有的雙歧桿菌屬均有強致齲性，不同菌株的致齲性不同，臨床應(yīng)尋找并阻斷優(yōu)勢致齲菌株在牙面的定植，抑制ECC的發(fā)生發(fā)展。

雙歧桿菌的常規(guī)鑒定和分類是基于其表型和生化特征，如菌群形態(tài)、革蘭氏染色結(jié)果、生化反應(yīng)等。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，16S rRNA 可以從基因序列中得到不同種系發(fā)生水平的多個區(qū)域的特定基因信息，目前臨床常用的雙歧桿菌鑒定工具均基于16S rRNA 基因序列分析方法，如ARDRA、DGGE 及物種特異性引物PCR。有研究［9］采用從糞便中進行DNA 的宏基因組測序分析了雙歧桿菌分類群在復(fù)雜細(xì)菌群落的相關(guān)性。納米孔測序技術(shù)可用于新的物種鑒定及驗證物種分配的局限性。ANGELL 等［10］使用六聚體頻率和納米孔測序數(shù)據(jù)的k均值聚類相結(jié)合識別了3 個月大嬰兒腸道微生物群中的雙歧桿菌屬及與陰道分娩有關(guān)的雙歧桿菌。說明雙歧桿菌屬是較早出現(xiàn)在腸道微生物群落中的，而口腔和腸道微生物之間存在相互作用的關(guān)系，腸道的菌群生態(tài)的組成和功能失調(diào)可能會導(dǎo)致口腔中有害菌的增殖，從而促進ECC 的發(fā)生發(fā)展。宏基因組霰彈槍方法可根據(jù)測序深度提供與特定生態(tài)系統(tǒng)相關(guān)的復(fù)雜微生物群落中存在的微生物的遺傳信息，可識別一些尚未培養(yǎng)的新物種，有學(xué)者［11］應(yīng)用宏基因組霰彈槍測序方法對動物腸道微生物群落中屬于雙歧桿菌屬的新型腸道共生物種進行鑒定。

1.2 雙歧桿菌在ECC 發(fā)生發(fā)展中的作用及作用機制 研究［12-13］研究了短期食用含乳雙歧桿菌Bb12的益生菌對患齲風(fēng)險個體唾液中變形鏈球菌計數(shù)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)唾液中變形鏈球菌計數(shù)顯著降低，說明食用含有乳酸雙歧桿菌Bb12 的益生菌酸奶可能會改變口腔生態(tài)環(huán)境。但肖小芬等［14］認(rèn)為，雙歧桿菌屬在SECC 組口腔中的豐度較高，且與齲失補牙面數(shù)強正相關(guān)，其可能是兒童早期重度齲發(fā)生的指示菌屬。有研究［15］采用qPCR 法對75例ECC兒童口腔中的雙歧桿菌、變形鏈球菌、嗜酸乳桿菌等進行量化檢測，發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌在牙本質(zhì)齲患兒的口腔牙菌斑中檢出率較高，說明雙歧桿菌在牙本質(zhì)齲進展中發(fā)揮了一定的作用。TANTIKALCHAN 等［16］通過收集122 例泰國2～5 歲無齲及SECC 兒童過夜的牙菌斑進行檢測，發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌與齲均和牙齦指數(shù)相關(guān)，但在SECC 兒童牙菌斑中并未檢測到該細(xì)菌。這表明雙歧桿菌在ECC 進展中可能并不是最初的定植者之一，其可能具有促進或加速其他細(xì)菌在牙面定植及致齲作用。

SANTOS 等［17］發(fā)現(xiàn)動物芽孢桿菌和長芽胞桿菌與變形鏈球菌聯(lián)合可促進不溶性胞外多糖的產(chǎn)生和齲損的進展，說明不同細(xì)菌在ECC 的發(fā)生、發(fā)展所起的作用不同，菌群之間可能發(fā)揮著相互協(xié)同或者拮抗的作用。雙歧桿菌具有獨特的代謝途徑，即“雙歧分流”，它可能通過增加產(chǎn)酸性而賦予其致齲潛力。MANOME 等［18］研究結(jié)果表明雙歧桿菌能夠在氟化物存在下代謝碳水化合物，在pH 值為7 時其產(chǎn)酸能力與pH 值為5.5 時一樣高，表明雙歧桿菌產(chǎn)酸能力強且具有很高的致齲潛力。通常細(xì)菌致齲能力包括它在牙面上的定植能力及其產(chǎn)酸和耐酸能力。雖然多數(shù)研究認(rèn)為，雙歧桿菌可促進ECC 的發(fā)生，但由于雙歧桿菌無法在牙面大范圍定植且多在胃腸道黏膜上黏附，及不同菌株之間如何互相作用從而影響ECC 致病程度，其在ECC 發(fā)生發(fā)展中的具體作用機制仍有待進一步深入研究。而目前生態(tài)菌斑學(xué)說被大家逐漸接受，其認(rèn)為致齲微生物可作為口腔常居菌的一部分存在于牙菌斑生物膜中，因此在中性環(huán)境下，這些微生物并不在菌群中處于優(yōu)勢地位，在此生態(tài)環(huán)境中，牙面的脫礦和再礦化過程處于平衡狀態(tài)。那么在雙歧桿菌定植牙面、黏附、繁殖生長、最終在ECC 發(fā)生發(fā)展的過程中，其他微生物如變形鏈球菌等可能都有不同程度的參與，盡管其產(chǎn)酸能力可能有所差異，但在生態(tài)種群的改建中并不存在特異性的選擇。

2 韋榮球菌屬的生物學(xué)特點及其在ECC 發(fā)生發(fā)展中的作用和作用機制

2.1 韋榮球菌的生物學(xué)特點 韋榮球菌屬［19］為0.3～0.5 μm 細(xì)小直徑的革蘭陰性球菌，呈雙球狀排列、不能運動、無芽孢形成、無莢膜及鞭毛，是絕對的厭氧菌，其作為共生微生物存在于人和動物的口腔、腸道以及生殖泌尿系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)中。韋榮球菌作為牙菌斑形成過程中的早期定植菌之一［20］，其豐度和多樣性在口腔微生物中具有一定的比例，對口腔健康造成了影響。有研究［19］表明在韋榮球菌屬的14 種中，不典型弧菌、牙癬弧菌、小弧菌、羅戈弧菌、散葉弧菌、嬰兒弧菌和托貝蘇氏弧菌已在人類唾液或舌或牙齒生物膜中被發(fā)現(xiàn)，它們構(gòu)成了在齦上、齦下牙菌斑以及口腔粘膜菌群重要組成部分。

韋榮球菌在屬水平上相對容易識別，但在種水平上仍然難以識別，因為沒有有用的表型或生化檢查來區(qū)分它們。基于16S rRNA 基因測序的分子方法，包括PCR-RFLP，通常用于鑒定韋榮球菌種水平的菌株，但因為韋榮球菌高度保守的基因序列及其染色體內(nèi)一致性相對較高，目前較多使用如rpoB、dnak、gltA 等管家基因?qū)ζ湮锓N進行辨別［21］。MASHIMA 等［22］學(xué)者通過采集89例泰國兒童舌部生物膜樣本，使用了一種新的基于rpoB 基因序列的物種特異性引物的一步法PCR 方法進行檢測，這種方法能夠清楚地區(qū)分基于DNA-DNA 同源性定義良好但基于16S rDNA定義較差的物種。結(jié)果顯示，89例受試者中僅有10 例分離到101 株韋榮球菌屬細(xì)菌，對6 種韋榮球菌的rpoB 基因進行相似性搜索，發(fā)現(xiàn)所有受試者的rpoB基因在2 500～3 100位具有高度多態(tài)性。盡管新證實的這40 個菌株目前已經(jīng)不能被歸類為任何已經(jīng)建立的口腔韋榮球菌屬，但說明其他韋榮球菌物種也有可能棲息于口腔環(huán)境中。目前也有基于16S 核糖體DNA 基因測序的分子方法，包括PCR 隨機片段長度多態(tài)性分析，用來在物種水平上鑒定韋榮球菌菌株［23-24］。然而，關(guān)于口腔韋榮球菌的鑒定和分布的研究是有限的，因為該細(xì)菌群落可能受到地理位置、年齡、飲食、生活方式、社會經(jīng)濟地位和口腔衛(wèi)生狀況差異的影響。

2.2 韋榮球菌在ECC 發(fā)生發(fā)展中的作用及作用機制 韋榮球菌屬被認(rèn)為是存在于人類口腔和胃腸道中的共生菌，因為它是核心微生物組的一部分。以往有研究［25］顯示，韋榮球菌因其利用乳酸而非碳水化合物作為能量來源、升高pH的特性以及減少產(chǎn)酸菌的致齲作用被認(rèn)為是防齲的益生菌。WANG等［26］通過單分子實時測序表征3～5 歲兒童齲齒中的口腔微生物群，結(jié)果發(fā)現(xiàn)韋榮球菌可能與健康的口腔微生物生態(tài)系統(tǒng)有關(guān)。但有研究［25］表明，韋榮球菌與變形鏈球菌存在著密切的共生關(guān)系。其可能有助于提高變形鏈球菌的群體競爭力，在適當(dāng)致齲環(huán)境存在時，促進微生態(tài)向致病性轉(zhuǎn)化，可能與ECC的發(fā)生發(fā)展存在協(xié)同作用。可見，韋榮球菌與ECC之間究竟存在何種關(guān)系目前尚不清楚，其可能是由于不同細(xì)菌物種在ECC 的發(fā)展中扮演著不同的角色。以往有研究認(rèn)為在口腔生物膜形成過程中，韋榮球菌是早期定植菌，但其如何在齲病早期階段發(fā)揮致齲作用仍需更深入的研究來了解其具體機制。QUDEIMAT 等［23］采用第二代測序技術(shù)對128 例兒童牙菌斑進行測序，結(jié)果表明細(xì)小韋榮球菌在齲齒活躍的兒童中相對豐度較高并占主導(dǎo)地位。一項為期2 年的縱向研究［27］結(jié)果表明，小韋榮球菌可作為ECC 發(fā)病風(fēng)險的生物標(biāo)志物，其在ECC 發(fā)生發(fā)展中具有一定的作用。變形鏈球菌作為口腔中常見的致齲菌之一［4］，致齲性取決于其產(chǎn)酸性和耐酸性，能夠迅速發(fā)酵多種碳水化合物產(chǎn)生大量酸，使局部pH下降至5.5以下，促進菌斑的形成。LIU等［28］研究表明變形鏈球菌在與韋榮球菌共同培養(yǎng)時，雙菌種生物膜中變形鏈球菌的數(shù)量較單獨培養(yǎng)時增加，而在多菌種生物膜中，仍可見韋榮球菌對變形鏈球菌的協(xié)同促進作用。韋榮球菌只在有鏈球菌存在時生長，鏈球菌發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生的有機酸可作為韋榮球菌的碳源，韋榮球菌不能直接代謝糖類，具有把代謝較強的、非揮發(fā)性的乳酸轉(zhuǎn)化成為較弱的、揮發(fā)性的乙酸和丙酸的能力。酸和丙酸的能力。鏈球菌為韋榮球菌提供黏附位點和營養(yǎng)來源，而韋榮球菌可促進鏈球菌生長和生物膜抵抗能力。韋榮球菌作為口腔微生物中高豐度菌屬之一，其高耐酸能力及在牙菌斑形成中的作用，提示韋榮球菌在致齲過程中的地位不可忽視，但其在ECC發(fā)生中的機制作用尚不明確。

3 奈瑟氏菌屬生物學(xué)特點及其在ECC 發(fā)生發(fā)展中的作用和作用機制

3.1 奈瑟氏菌的生物學(xué)特點 奈瑟氏菌［29］為直徑0.6～1.0 μm 的需氧革蘭陰性球菌，單個或成對排列，且相鄰的一面扁平，按彼此互相垂直的兩個平面分裂，有時導(dǎo)致四聯(lián)球菌，不形成內(nèi)生芽孢，無鞭毛但可有纖毛，不運動，其最適生長溫度為35～37 ℃，對干燥敏感，初次分離需要濕度。口腔奈瑟氏菌需氧酶和過氧化氫酶均為陽性，產(chǎn)生H2S，亞硝酸鹽還原陽性。奈瑟氏菌屬是一類β 變形桿菌，是人和動物的專性共生體，至少有8 種共生奈瑟氏菌在人類黏膜表面定居［30］，人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的奈瑟氏菌有淋球菌、腦膜炎球菌、解乳糖奈瑟氏菌、干燥奈瑟氏菌、微黃奈瑟氏菌、金黃奈瑟氏菌、黏液奈瑟氏菌等，正常人口腔中常見者為干燥奈瑟氏菌、微黃奈瑟氏菌和黏液奈瑟氏菌［29］。其在出生一周的新生兒口腔中無法檢測到，但到八個月后，幾乎所有嬰兒口腔中均能檢測到該菌，7～12 歲兒童中80%唾液內(nèi)可檢到奈瑟氏菌，為唾液中數(shù)量僅次于α—溶血性鏈球菌的細(xì)菌，約為5×106/mL。

傳統(tǒng)的奈瑟氏菌表型分類法可鑒別出腦膜炎奈瑟菌、淋球菌和乳鏈球菌，但此方法對于定義和識別其他奈瑟氏菌相關(guān)物種具有一定的難度［31］，因此諸如DNA-DNA 雜交和16S 核糖體基因的核苷酸序列數(shù)據(jù)的系統(tǒng)發(fā)育分析等分子方法的應(yīng)用解決了該問題，基于多基因座序列分析的系統(tǒng)發(fā)育，導(dǎo)致了一些奈瑟氏菌屬的重新分類，將其合并為亞黃酮亞變種、全黃菌和黃奈瑟氏菌。也有研究報道可利用16S rRNA 基因的高通量測序和元基因組學(xué)來鑒定奈瑟氏菌與齲病相關(guān)的潛在屬［32］。

3.2 奈瑟氏菌在ECC 發(fā)生發(fā)展中的作用及作用機制 奈瑟氏菌為兒童出生后口腔的首批定植者，被證明是來源于健康個體的早期生物膜內(nèi)細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的重要介質(zhì)，其可能在維持與健康相關(guān)的口腔微生物組中發(fā)揮關(guān)鍵作用［33］。LEE 等［34］采集120 例韓國12 歲以下兒童的唾液和牙菌斑樣本，用Illumina HiSeq 測序鑒定其口腔細(xì)菌組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：6 歲以下無齲兒童牙菌斑中口腔奈瑟氏菌含量較高，奈瑟氏菌與ECC 可能并無明顯的相關(guān)性。對健康兒童口腔正常菌群的研究也發(fā)現(xiàn)，在唾液、菌斑窩溝、齦上菌斑、齦下菌斑中，奈瑟氏菌的檢出率為100%。但XIAO 等［32］學(xué)者通過收集96 例3～6 歲無齲、ECC、SECC 兒童的牙菌斑，利用16S rRNA 基因的高通量測序和元基因組學(xué)鑒定，表明桿狀奈瑟菌ATCC BAA-1200 菌株在兒童齲病的發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用，其與齲失補牙面數(shù)及葡萄糖相關(guān)代謝途徑呈正相關(guān)，具有發(fā)酵產(chǎn)酸能力。奈瑟氏菌在SECC 兒童唾液微生物群中豐度最高，但也有表明低齲齒經(jīng)歷的健康兒童與奈瑟氏菌屬、嗜血桿菌屬和梭桿菌屬的豐度較高有關(guān)，而這些屬中的大多數(shù)物種僅輕微發(fā)酵蔗糖，可見不同的奈瑟氏菌菌株與ECC 的相關(guān)性并不完全一致，一些特異性菌株可能具有較強的產(chǎn)酸性和耐酸性，在ECC 的進展中存在潛在的致齲性。

奈瑟氏菌在牙菌斑生物膜中的作用表現(xiàn)為對牙表面黏附能力很弱，但卻是與血鏈球菌一起最早定植于干凈牙面的細(xì)菌［35］，其主要存在于菌斑外層和早期菌斑中，可能因為奈瑟氏菌是需氧菌，菌斑早期的高氧壓有利于它生長，而隨著菌斑的成熟，氧壓降低，奈瑟氏菌數(shù)量也減少。奈瑟氏菌在分解各種糖時會形成數(shù)量不等的酸，其中分解麥芽糖產(chǎn)生的酸最多，且各種奈瑟氏菌產(chǎn)酸的能力也不同，產(chǎn)生酸類最強的是干燥奈瑟氏菌，其次是微黃奈瑟氏菌。干燥奈瑟氏菌在含蔗糖的培養(yǎng)基中產(chǎn)生的多糖莢膜能使無莢膜的細(xì)菌聚集，并且這種聚集不因葡聚糖的消化而分解，莢膜還可被其他微生物的生長所利用，促進菌斑形成。微黃奈瑟氏菌中的深黃奈瑟氏菌在含蔗糖的培養(yǎng)基中能產(chǎn)生大量支鏈淀粉，比蔗糖還容易迅速被鏈球菌和乳桿菌所利用。有研究發(fā)現(xiàn)腦膜炎奈瑟氏菌可以利用乳酸，從牙菌斑中分離的奈瑟氏菌菌株也已被證明能將乳酸降解為醋酸，表明奈瑟氏菌具有雙向作用，在有蔗糖的條件下可合成胞外多糖并可酵解糖，其具有代謝葡萄糖、產(chǎn)生有機酸的能力，在糖缺少或無糖時，奈瑟氏菌可降解菌斑中產(chǎn)酸菌所產(chǎn)生的乳酸成為弱酸和揮發(fā)性酸，其又有利用乳酸的能力［36］。可見奈瑟氏菌在口腔中的扮演的角色是是復(fù)雜的，其在低齡兒童致齲過程中所發(fā)揮的作用仍然未知，因此未來對奈瑟氏菌的深入研究具有一定的必要性。

綜上所述，ECC 是一種慢性感染性疾病?？谇恢胁糠旨?xì)菌如雙歧桿菌、韋榮球菌、奈瑟氏菌與ECC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。產(chǎn)酸性較強的雙歧桿菌可導(dǎo)致牙釉質(zhì)脫礦，促進或加速其他口腔致病菌在牙面的定植，促進ECC 的發(fā)生發(fā)展。韋榮球菌是牙菌斑形成過程中的早期定植菌之一，促進口腔致病菌變形鏈球菌的生長，提高變形鏈球菌的生物膜抵抗能力，促進ECC 的發(fā)生發(fā)展。奈瑟氏菌是人體口腔的常見菌，是生物膜內(nèi)細(xì)胞—細(xì)胞相互作用間的重要介質(zhì)，可能通過發(fā)酵產(chǎn)酸途徑促進ECC 的發(fā)生發(fā)展。齲易感兒童非致齲性菌斑轉(zhuǎn)變?yōu)橹慢x性菌斑的過程中口腔微生物的生理結(jié)構(gòu)、數(shù)量種類的變化仍然未知，且細(xì)菌酸堿代謝與基于16S 的物種分配的關(guān)系似乎也很復(fù)雜，但是隨著分子生物學(xué)及其技術(shù)的不斷發(fā)展，在未來的研究中，對整個基因組進行功能描述的元基因組方法、多組學(xué)聯(lián)合應(yīng)用等將有助于闡明齲病的微生物發(fā)病機制，更好地為ECC 的預(yù)防及微生物靶向阻斷提供科學(xué)依據(jù)。