王 坤 朱傳龍 田健美 孔小行 成芳芳 李 嫣

急性肝衰竭(acute liver failur,ALF)是由各種病原體感染,各種物質(zhì)中毒等原因引起的肝細胞亞大片或大片凋亡、壞死,致使其各種生物學功能嚴重受損或失代償?shù)囊环N臨床癥候群,臨床病死率高[1]。由于缺乏理想的早期病情評估指標和有效的藥物治療方案,急性肝衰竭的臨床評估與有效治療仍然是世界性的難題[2]。目前急性肝衰竭常用的治療方法為內(nèi)科治療,包括保肝、呼吸循環(huán)支持、血漿置換等治療,但療效仍有限[3]。肝移植仍是當前該疾病最有效的治療方法,但由于供肝缺乏、醫(yī)療費用高昂等問題限制該方法的廣泛開展[4]。因此,進一步尋找一種新的方式早期診斷評估、治療急性肝衰竭至關(guān)重要。有研究表明,基因治療是一種很有前途的治療方式,可用于治療多種疾病,并且能提高治療的療效和患者的生存率[5]。

微小RNA(miRNA)是一類小分子非編碼單鏈RNA,由約22個核苷酸組成,它通過與mRNA的3′-非轉(zhuǎn)錄區(qū)域(3′-UTR)結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的功能,抑制靶基因的表達,在調(diào)控體內(nèi)的蛋白質(zhì)編碼基因的表達中發(fā)揮重要作用[6]。既往研究表明,miRNA不僅可以作為肝衰竭的早期診斷指標,也在肝衰竭炎性反應、肝細胞壞死、凋亡和肝細胞再生過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[7]。因此,通過探索這些miRNAs,可能會獲得疾病早期診斷和靶向治療的新線索。

材料與方法

1.實驗動物:雄性SD大鼠42只,6周齡,體質(zhì)量為200～220g,購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司,許可證號:SCXK(滬)2017-0005。本實驗中所有的實驗動物被飼養(yǎng)于蘇州大學動物實驗中心,SPF級飼養(yǎng)環(huán)境,動物實驗經(jīng)蘇州大學實驗動物倫理委員會批準進行,實驗動物使用許可證:SYXK(蘇)2017-0043。

2.主要實驗試劑:D-氨基半乳糖、脂多糖購自美國Sigma公司;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)檢測試劑盒、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)檢測試劑盒及總膽紅素(total bilirubin,TBIL)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;TRIzol購自美國Invitrogen公司;cDNA第一鏈合成試劑盒購自日本TaKaRa公司;全蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白含量檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;兔anti-BCL2L2、羊抗兔IgG-HRP購自江蘇親科生物研究中心有限公司;引物、miR-204-5p模擬物(miR-204-5p mimic)、pmirGLO-BCL2L2-WT、pmirGLO-BCL2L2-MUT報告載體均由江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司構(gòu)建完成。

3.急性肝衰竭大鼠模型建立、分組:取32只6周齡雄性SD大鼠,以隨機數(shù)字表法平均分成對照組(0h)、模型組(24h)、模型組(48h)、模型組(72h),每組各8只[模型組(72h)的大鼠在造模不足72h有死亡的情況,此時再隨機選取6周齡雄性SD大鼠補充入組,完成造模],對照組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液,模型組采用D-氨基半乳糖(D-GalN,劑量為950mg/kg)和脂多糖(LPS,劑量為10μg/kg)依次腹腔注射制造大鼠急性肝衰竭模型,分別取對照組及模型組造模完成后24、48、72h大鼠靜脈血及肝組織。另取10只6周齡雄性SD大鼠,行上述急性肝衰竭造模后,觀察大鼠生存情況。

4.酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清ALT、AST、TBIL值:內(nèi)眥靜脈采取4組大鼠靜脈血,采血完成后,置于離心機中,4℃、3000r/min離心10min。收集上層血清,嚴格按照試劑盒所附說明書的操作檢測。

5.蘇木精-伊紅(HE)染色觀察各組大鼠肝組織病理變化及行炎癥活動指數(shù)(histology activity index,HAI)評分:4組大鼠肝組織標本收集后,將其放入10%的甲醛溶液中固定72h,然后用乙醇脫水,石蠟包埋,切片,切片厚度為4μm。組織切片經(jīng)脫蠟,水化,行HE染色,封片后置于200倍光鏡顯微鏡下觀察肝臟病理變化并拍照,并采用HAI評分系統(tǒng)對各組肝臟組織炎癥壞死凋亡等情況進行評分。

6.實時熒光定量PCR(RT -PCR) 檢測miR-204-5p、BCL2L2表達水平:取出4組肝臟組織,使用Trizol法提取肝臟組織總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行RNA反轉(zhuǎn)錄合成互補DNA(cDNA),建立熒光定量PCR體系。以U6為miR-204-5p內(nèi)參,GADPH為BCL2L2內(nèi)參,采用2-Δ ΔCt計算miR-204-5p、BCL2L2相對表達量。miR-204-5p上游引物:5′-ACACTCCAGCTGGGUUCCCUUUGUCAUCCU-3′,下游引物:5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′;U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;BCL2L2上游引物:5′-AGTCTGTCATCCTTGCCCCTTT-3′,下游引物:5′-GCTCCACAGACATAACCCTTCT-3′;GADPH上游引物:5′-AGGTTGTCTCCTGTGACTTCAA-3′;下游引物:5′-CTGTTGCTGTAGCCATATTCATTG-3′。

7.Western blot法檢測4組大鼠肝組織中BCL2L2蛋白表達情況:采用RIPA裂解液裂解肝組織,離心后取上清液采用BCA法檢測樣本蛋白含量,用GADPH作為內(nèi)參,使用12% SDS-PAGE電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)膜封閉后加入一抗(兔anti-BCL2L2)孵育過夜,加入羊抗兔IgG-HRP二抗,室溫反應2h,TBsT洗膜后使用超敏ECL發(fā)光液孵育PVDF膜進行顯影,保存圖片,采用Imagel J軟件分析條帶灰度值。

8.TUNEL法檢測肝細胞凋亡:取4組肝臟組織石蠟切片,脫蠟水化后每張切片滴加蛋白激酶K及TdT酶反應液,避光反應1h,清洗后滴加Streptavadin-HRP,避光反應30min,洗滌后行DAB顯色及蘇木精復染,沖洗干凈,晾干后封片,選取5個400倍鏡下視野,每個高倍視野計數(shù)100個細胞,計數(shù)各視野的凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)(%)=各視野陽性細胞數(shù)/100×100%。

9.雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-204-5p與BCL2L2之間的靶向關(guān)系:通過Targetscan數(shù)據(jù)庫分析miR-204-5P的靶基因可能是BCL2L2,分別將BCL2L2-WT、BCL2L2-MUT質(zhì)粒與miR-204-5pmimics、mimics-NC共轉(zhuǎn)染至293T細胞中,轉(zhuǎn)染48h后,收集各組細胞并參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書步驟檢測各組細胞的熒光素酶活性。

結(jié) 果

1.4組大鼠血清ALT、AST、TBIL水平的變化:與對照組比較,行急性肝衰竭造模后的大鼠血清ALT、AST及TBIL值均隨造模時間延長逐漸升高,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),肝功能損傷明顯,詳見表1。

表1 4組大鼠血清ALT、AST及TBIL值水平

2.4組大鼠肝組織病理變化:大鼠行急性肝衰竭造模24h后,200倍光鏡視野下觀察肝組織病理可發(fā)現(xiàn)肝細胞水腫、點狀變性壞死及炎性滲出,隨著造模時間的延長,大鼠的肝臟壞死程度逐漸加重,在造模后72h觀察其肝臟病理可見肝細胞發(fā)生大片狀壞死,結(jié)構(gòu)遭到嚴重破壞及有大量炎性細胞浸潤,詳見圖1A。此外,隨著造模時間的延長,HAI評分逐漸升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),詳見圖1B。

圖1 4組大鼠肝組織病理情況A.4組大鼠肝組織病理變化(HE,×200);B.4組大鼠肝組織相應HAI評分

3.大鼠行急性肝衰竭造模后生存率:取10只SD大鼠行急性肝衰竭造模,研究發(fā)現(xiàn),造模12h后大鼠的活力下降,活動度減少;24h后部分大鼠出現(xiàn)精神萎靡、食納減少、觸碰反應差等表現(xiàn),造模48h內(nèi)即有大鼠出現(xiàn)死亡,后大鼠陸續(xù)出現(xiàn)死亡,所有造模大鼠均在5天內(nèi)死亡,詳見圖2。

圖2 急性肝衰竭大鼠造模后生存情況

4.4組大鼠肝組織中miR-204-5p、BCL2L2的表達情況:RT-PCR檢測顯示,模型組大鼠肝組織中miR-204-5p的相對表達水平顯著高于對照組,且隨著大鼠行急性肝衰竭造模后時間推移,肝組織中miR-204-5p基因的相對表達水平逐漸升高(各組表達量分別為1.26±0.29、1.76±0.21、2.99±0.32、4.30±0.88),詳見圖3A;而肝組織中BCL2L2基因的相對表達水平逐漸降低(各組表達量分別為0.95±0.10、0.56±0.07、0.34±0.07、0.13±0.06),詳見圖3B。Western blot法檢測結(jié)果顯示,肝組織中BCL2L2蛋白表達亦逐漸降低,詳見圖3C,差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

圖3 4組大鼠肝組織中miR-204-5p、BCL2L2表達情況A.4組大鼠肝組織中miR-204-5p基因的相對表達水平;B.4組大鼠肝組織中BCL2L2基因的相對表達水平;C:4組大鼠肝組織中BCL2L2蛋白表達情況

5.4組大鼠肝細胞凋亡情況:通過TUNNEL法檢測各組肝細胞的凋亡情況,結(jié)果顯示,隨著造模時間的延長,肝組織中凋亡的肝細胞顯著增多,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),詳見圖4。

6.miR-204-5p靶向BCL2L2:miR-204-5p表達水平與BCL2L2表達水平呈負相關(guān)(R2=0.752,P<0.001),詳見圖5A。生物信息學預測顯示,miR-204-5p與BCL2L2之間存在互補的結(jié)合位點,詳見圖5B。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測結(jié)果顯示,與陰性對照mimics-NC組比較,miR-204-5p mimics與BCL2L2-WT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后細胞的相對熒光素酶活性明顯降低(P<0.001),詳見圖5C。

結(jié) 果

急性肝衰竭是臨床上導致高病死率的嚴重臨床綜合征,既往研究指出,肝細胞凋亡與急性肝衰竭關(guān)系十分密切,大量肝細胞凋亡在急性肝衰竭疾病發(fā)展過程中起了重要的作用[8]。因此,抑制肝細胞凋亡是防治急性肝衰竭的重要途徑。在本研究中,大鼠行急性肝衰竭模型造模,造模完成后,可見隨造模時間的延長,大鼠肝功能急劇惡化;且完善肝組織病理檢測可見隨著造模時間的延長,大鼠的肝臟壞死程度逐漸加重,在造模后72h即可發(fā)現(xiàn)肝細胞發(fā)生大片狀壞死,肝組織結(jié)構(gòu)遭到嚴重破壞及有大量炎性細胞浸潤。行大鼠急性肝衰竭造模后生存率分析顯示,所有造模大鼠均在5天內(nèi)死亡,上述結(jié)果均提示大鼠急性肝衰竭模型造模成功。

既往研究表明,miRNA參與急性肝衰竭的發(fā)生、發(fā)展[9]。miR-204-5p定位于人類第9號染色體73424891～73425000位之間,且該基因已被證實在許多癌癥中具有腫瘤抑制作用,如結(jié)直腸癌和胃癌,以及在多種疾病中具有調(diào)節(jié)炎性反應及氧化應激的作用,促進疾病發(fā)生、發(fā)展[10～13]。多項研究發(fā)現(xiàn),miR-204-5p參與細胞凋亡和炎癥損傷的調(diào)節(jié),被認為是細胞凋亡的正調(diào)控因子[14,15]。本研究成功制造急性肝衰竭大鼠模型,并發(fā)現(xiàn)隨著急性肝衰竭的發(fā)生、發(fā)展,急性肝衰竭大鼠肝功能損傷及肝細胞凋亡、壞死越重,其肝組織中miR-204-5P的相對表達水平逐漸升高。因此,miR-204-5p可能是急性肝衰竭發(fā)病機制中重要的調(diào)節(jié)因子,成為診斷及治療急性肝衰竭的新的潛在靶點,可作為評估急性肝衰竭嚴重程度的指標,有助于早期評估患者病情,預測急性肝衰竭的發(fā)生、發(fā)展。

如前所述,miRNA通過調(diào)控靶基因的表達發(fā)揮作用。Bcl-2樣蛋白2(Bcl-2 like protein 2,BCL2L2)屬于Bcl-2蛋白家族成員,是一種控制細胞存活的抗凋亡蛋白,是細胞活力的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。BCL2L2蛋白對于內(nèi)在的凋亡途徑至關(guān)重要,在caspase依賴的細胞凋亡的調(diào)控中起著調(diào)節(jié)作用,BCL2L2通過抑制線粒體細胞色素c和caspase-3依賴的蛋白水解級聯(lián)反應,維持線粒體膜的完整性,保護細胞免于凋亡[16,17]。近年來,越來越多的研究集中在miRNA對BCL2L2的調(diào)控上,通過抑制BCL2L2的表達,促進細胞凋亡[18,19]。本研究中,急性肝衰竭大鼠肝組織中BCL2L2的表達水平顯著低于正常大鼠肝組織,且隨著大鼠急性肝衰竭造模后時間的推移,肝組織中BCL2L2基因的表達水平逐漸降低,且肝組織中凋亡的肝細胞逐漸增加。miR-204-5p表達水平與BCL2L2表達水平呈負相關(guān),且通過生物信息學分析提示了miR-204-5p和BCL2L2的靶向結(jié)合關(guān)系,并采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M一步證實了miR-204-5p和BCL2L2之間存在靶向關(guān)系。因此,miR-204-5p可與BCL2L2mRNA的 3′非編碼區(qū)結(jié)合,抑制BCL2L2表達,進而促進肝細胞凋亡,促進急性肝衰竭的發(fā)生及病情進展。

本研究也存在一定的局限性,首先,本實驗的樣本量較小,其次本實驗未設(shè)置miR-204-5p 抑制劑組(miR-204-5p inhibitor)、miR-204-5p模擬物組(miR-204-5p mimic)等尾靜脈注射急性肝衰竭大鼠,進一步驗證miR-204-5p靶向調(diào)控BCL2L2的關(guān)系。因此,在后續(xù)的工作中,將加大實驗大鼠樣本量及完善上述相關(guān)實驗,進一步評估驗證miR-204-5p靶向調(diào)控BCL2L2促進急性肝衰竭大鼠肝細胞凋亡的機制。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),急性肝衰竭大鼠肝組織中miR-204-5p的相對表達水平隨著造模時間的延長逐漸升高,miR-204-5p通過靶向調(diào)控BCL2L2促進肝細胞凋亡,進而促進急性肝衰竭疾病的發(fā)生、發(fā)展。因此,miR-204-5p可成為早期診斷、評估及治療急性肝衰竭的新的潛在靶點。