劉英苗 胡騰龍 李保蓉 于 洋

口腔癌是導(dǎo)致死亡最常見(jiàn)的的癌癥之一,其中超過(guò)90%的口腔惡性腫瘤是口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinomas, OSCC),盡管診斷和治療有所提高,但是5年生存率仍為50%左右[1,2]。眾所周知,癌癥和血栓是相互影響的,幾乎所有類型的癌癥與凝血的激活有關(guān),但原因不詳。據(jù)文獻(xiàn)記載,腫瘤患者比沒(méi)有腫瘤的患者靜脈血栓(venous thromboembolism, VTE)的發(fā)生率高,為其4～7倍,然而在晚期癌癥患者中VTE的發(fā)生率更高[3,4]。微粒(microparticles, MPs)是細(xì)胞激活后釋放出來(lái)的直徑為0.1～1.0μm的膜泡[5]。MPs在血栓與止血、炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖及腫瘤進(jìn)展等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[6]。近年來(lái)有研究表明,循環(huán)MPs數(shù)量的變化和OSCC進(jìn)展以及炎癥程度相關(guān)。也有研究表明,OSCC患者血漿中血小板源性微粒(platelet-derived MPs, PMPs)升高,然而關(guān)于其與腫瘤最大徑、腫瘤TNM分期、腫瘤分化程度、頸部轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)是否相關(guān)還不是很清楚[7]。本研究主要探討OSCC患者血漿中PMPs的水平與腫瘤最大徑、腫瘤TNM分期、腫瘤分化程度、頸部轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)是否有關(guān),并進(jìn)一步探討與凝血的關(guān)系,以期對(duì)OSCC患者的治療提供新思路。

材料與方法

1.材料:(1)臨床材料:選取2016年10月～2018年10月在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院住院的OSCC患者63例(OSCC組),其中男性36例,女性27例,患者中位年齡為54 (40,75)歲。筆者醫(yī)院體檢的健康人26例(正常對(duì)照組),其中男性14例,女性12例,中位年齡為51 (19,61)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):手術(shù)后病理確診、未經(jīng)過(guò)放化療的患者。排除標(biāo)準(zhǔn):①近3個(gè)月內(nèi)接受過(guò)抗凝和抗血小板治療的患者;②高血壓、糖尿病、妊娠、患急性和慢性疾病、其他腫瘤患者和全身性疾病患者。本研究通過(guò)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理學(xué)審批號(hào):HMUIRB20160026),所有研究對(duì)象均知情同意,并簽署知情同意書。(2)主要儀器和材料:流式細(xì)胞儀(FACSArial,美國(guó)BD公司),Eppendorf移液槍(德國(guó)Eppendorf公司),megamix標(biāo)準(zhǔn)微球試劑盒(法國(guó)BioCytex公司),含beads的Truecount的絕對(duì)計(jì)數(shù)管(美國(guó)BD公司),凝血酶定標(biāo)品(thrombin Calibrator,荷蘭BV公司),Fluck試劑盒、熒光讀數(shù)儀、低速離心機(jī)(美國(guó)BD公司),MPs反應(yīng)劑(荷蘭BV公司),乳黏素(Alexa Fluor 488)、Alexa Fluor 488-CD41a(美國(guó)BD公司)。

2.方法:(1)MPs懸液制備:取各組(正常對(duì)照組、OSCC組)靜脈血5ml。上述標(biāo)本200×g離心13min,獲得富血小板血漿,繼續(xù)1500×g離心20min,取上2/3即獲得乏血小板血漿,13000×g離心2min,取上層2/3獲得無(wú)血小板血漿;取無(wú)血小板血漿250μl,20000×g離心45min,棄掉上層225μl(動(dòng)作緩慢),余25μl即MPs,用Tyrode′s buffer洗1次,加225μl Tyrode′s buffer,即得到MPs懸液。(2)掃描電鏡實(shí)驗(yàn):在玻璃蓋玻片上準(zhǔn)備血小板。標(biāo)本置于2%戊二醛磷酸緩沖液(pH值約為7.2)中,將其固定并置于4℃冰箱中過(guò)夜。第2天沖洗用0.15%的同一緩沖溶液,再用不同濃度的乙醇分別進(jìn)行脫水,每次約15min。將上述制備的樣品置于臨界點(diǎn)干燥器中,使之進(jìn)行干燥,樣品表面噴涂10nm厚的鉑層。所有圖片用S-3400N掃描電鏡觀察。(3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)PMPs:用Alexa Fluor 488乳黏素檢測(cè)MPs,乳黏素顯示陽(yáng)性時(shí)為MPs[8]。用CD41a-Alexa Fluor 488+標(biāo)記為PMPs。(4)凝血酶生成試驗(yàn)(thrombin generation test, TGT):測(cè)定不同分組的OSCC患者血漿凝血酶生成。操作步驟:①采用96孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn);②將患者血漿加入到相應(yīng)的96孔板中;③再分別將凝血標(biāo)準(zhǔn)品和MPs反應(yīng)劑加入到相應(yīng)的孔中;④將孔板放到熒光讀數(shù)儀中,再于37℃下培養(yǎng)10min;⑤按要求進(jìn)行搖晃并在機(jī)器下檢測(cè)凝血酶的生成。

結(jié) 果

1.掃描電鏡觀察OSCC患者血漿中PMPs:掃描電鏡下觀察結(jié)果顯示,OSCC患者中血小板激活,血小板釋放PMPs為密度低的圓球形,邊界清楚,直徑為100～1000nm,而正常對(duì)照組中未見(jiàn)血小板激活及PMPs釋放,詳見(jiàn)圖1。

圖1 兩組血漿中血小板激活及PMPs釋放(×200)A.正常對(duì)照組;B.OSCC組。箭頭所示為PMPs,呈密度低的圓球形,邊界清楚,直徑為100～1000nm

2.OSCC組和正常對(duì)照組PMPs的水平:腫瘤最大徑≥4cm的OSCC患者血漿中PMPs水平(1748.97±464.53/μl)高于腫瘤最大徑<4cm的OSCC患者(1249.36±482.52/μl)和正常對(duì)照組(1040.15±272.26/μl,F=16.87,P<0.05)。TNM分期Ⅲ/Ⅳ期的OSCC患者血漿中PMPs水平(1894.44±401.42/μl)明顯高于Ⅰ/Ⅱ期的OSCC患者(1092.41±261.03/μl)和正常對(duì)照組(1040.15±272.26/μl ,F=25.33,P<0.05),而有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的OSCC患者血漿中PMPs水平(1945.66±375.58/μl)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的OSCC患者(1211.29±386.51/μl)和正常對(duì)照組(F=22.93,P<0.05)。高、中、低分化的OSCC患者血漿中PMPs水平分別為1491.94±488.40/μl、1572.31±578.97/μl、1567.33±484.94/μl,均高于正常對(duì)照組(F=7.221,P<0.05),然而,3組之間血漿中PMPs水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖2)。

圖2 不同分組中PMPs水平的比較A.腫瘤最大徑組PMPs水平;B.腫瘤TNM分期組PMPs水平;C.有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組PMPs水平;D.腫瘤分化程度組PMPs水平。*P<0.05

3.PMPs增加OSCC患者促凝活性:檢測(cè)凝血酶的生成主要包括延遲時(shí)間、凝血酶生成峰值、達(dá)峰時(shí)間和凝血酶生成潛力(endogenous thrombin potential,ETP)。不同OSCC組與正常對(duì)照組中凝血酶的生成詳見(jiàn)表1。腫瘤最大徑≥4cm的OSCC患者凝血酶生成峰值顯著高于正常對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.421,P<0.05),而兩組間其余凝血酶的生成參數(shù)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TNM分期Ⅲ/Ⅳ期的OSCC患者凝血酶生成峰值顯著高于正常對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.714,P<0.05),而兩組間其余凝血酶的生成參數(shù)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常對(duì)照組比較,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的OSCC患者凝血酶生成峰值水平顯著升高(t=4.852,P<0.05),而兩組間其余凝血酶的生成參數(shù)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高、中、低分化的OSCC患者與正常對(duì)照組各參數(shù)比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),且高、中、低分化OSCC患者3組間各參數(shù)比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?；颊咄庵苎狿MPs與活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time,APTT)、凝血酶原時(shí)間(prothrombin time,PT)、纖維蛋白原(fibrinogen,FIB)進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析,結(jié)果表明,FIB與PMPs水平呈正相關(guān)(P<0.05,圖3)。

表1 不同OSCC組患者與正常對(duì)照組凝血酶生成檢測(cè)結(jié)果

圖3 測(cè)定OSCC患者PMPs水平與不同凝血指標(biāo)的相關(guān)性A.PMPs水平與APTT的相關(guān)性;B.PMPs水平與PT的相關(guān)性;C.PMPs水平與FIB的相關(guān)性

討 論

OSCC是一種炎癥相關(guān)的疾病,而MPs是炎性反應(yīng)的產(chǎn)物,但同時(shí)也能促進(jìn)炎性反應(yīng)[9]。PMPs水平在OSCC患者血漿中是升高的,并且在TNM分期Ⅲ/Ⅳ期生成最多,表明PMPs可能參與OSCC的疾病進(jìn)展。越來(lái)越多的學(xué)者研究PMPs在癌癥中的作用。既往研究表明,晚期乳腺癌患者的PMPs水平升高,同時(shí)還有研究表明,皮膚的惡性黑色素瘤在Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ期PMPs水平升高,與本研究結(jié)果一致[10,11]。PMPs的釋放與炎性疾病、腫瘤及免疫性疾病有關(guān),許多炎性細(xì)胞因子可導(dǎo)致PMPs的釋放,而單核細(xì)胞又可分泌多種促炎性細(xì)胞因子(如腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-8、細(xì)胞黏附分子等)[12]。有研究表明,PMPs能誘導(dǎo)體內(nèi)其他的細(xì)胞如成纖維細(xì)胞分泌各種促炎性細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-8[13]。且血小板可通過(guò)其體內(nèi)的選擇素與促凝物質(zhì)結(jié)合生成血小板-纖維蛋白原復(fù)合物,從而加劇疾病的炎癥程度并促進(jìn)疾病進(jìn)展。

PMPs參與許多過(guò)程,包括炎癥、衰亡、細(xì)胞增殖、腫瘤進(jìn)展、凝血激活等。目前PMPs研究最多的是關(guān)于其凝血激活作用,而PMPs具有促凝作用,其促凝活性通常與兩種物質(zhì)有關(guān)[14]。帶負(fù)電荷的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)發(fā)揮較大作用。它在促凝過(guò)程中,與其中的陽(yáng)性基團(tuán)結(jié)合,繼而參與整個(gè)凝血過(guò)程。磷脂酰絲氨酸在PMPs中的研究已有很多,然而在OSCC患者中研究很少,需要進(jìn)一步闡明。第2種物質(zhì)是組織因子。它是啟動(dòng)凝血的外源性途徑的主要物質(zhì),它主要與Ⅶa形成復(fù)合物,從而激活整個(gè)外源性途徑。目前關(guān)于組織因子來(lái)源的PMPs在癌癥患者中已有很多研究。而在本研究中發(fā)現(xiàn)TNM分期Ⅲ/Ⅳ期的OSCC患者凝血酶生成峰值明顯高于正常對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明PMPs在TNM分期晚期的OSCC患者血漿中升高,并參與腫瘤的促凝血過(guò)程。腫瘤最大徑≥4cm的OSCC患者比正常對(duì)照組凝血酶生成峰值水平高,與正常對(duì)照組比較,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的OSCC患者凝血酶生成峰值水平顯著升高,表明OSCC促凝活性可能參與腫瘤進(jìn)展,對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用,而OSCC的高凝機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

MPs同時(shí)可以調(diào)節(jié)血管的再生[15]。已有研究證明,OSCC患者血漿中循環(huán)MPs可以促進(jìn)血管內(nèi)皮生成[16]。而PMPs是腫瘤患者外周血中檢測(cè)的最多的MPs,因此PMPs在促進(jìn)腫瘤內(nèi)皮再生中發(fā)揮巨大作用。Gaetani等[17]研究表明,PMPs可以通過(guò)多種機(jī)制共同刺激體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡和遷移等。

研究表明,腫瘤瘤體的直徑可以影響患者的預(yù)后,并且隨著腫瘤的增大,其頸部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移升高,與本研究結(jié)果一致[18]。有報(bào)道認(rèn)為,腫瘤患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移應(yīng)被視為重要的預(yù)后指標(biāo),然而本研究中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對(duì)于患者預(yù)后的影響至關(guān)重要[19]。本研究結(jié)果OSCC患者血漿中PMPs水平在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中高,并且與正常對(duì)照組比較,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的凝血酶生成峰值水平更高。此外,在腫瘤最大徑≥4cm組比腫瘤最大徑<4cm組和正常對(duì)照組血漿中PMPs水平和凝血酶生成峰值水平高,將患者外周血PMPs與凝血相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析表明FIB與PMPs水平相關(guān),表明PMPs增加OSCC患者促凝活性,參與OSCC患者的進(jìn)展,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞異常增殖,引起腫瘤生長(zhǎng)。臨床上常用TNM分期來(lái)判斷頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,而本研究結(jié)果表明,TNM分期Ⅲ/Ⅳ期OSCC患者血漿中的PMPs水平明顯高于Ⅰ/Ⅱ期,表明Ⅲ/Ⅳ期OSCC患者頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較多見(jiàn)。而在本研究中高、中、低分化的OSCC患者之間PMPs水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明腫瘤的惡性程度不能依據(jù)病理分期,因?yàn)椴±矸旨?jí)目前尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。然而之前也有研究表明,分化程度低的患者中頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者較常見(jiàn)[20]。既往研究與本研究結(jié)果一致。因此,腫瘤分化程度與腫瘤進(jìn)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究驗(yàn)證了PMPs在OSCC患者血漿中的水平升高,并增加了OSCC的促凝活性,并隨著腫瘤最大徑及腫瘤TNM分期的增加而升高,在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中更高。提示PMPs參與OSCC的發(fā)生、發(fā)展,并且有可能為OSCC的早期診斷以及早期治療提供依據(jù),然而關(guān)于PMPs促進(jìn)OSCC發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。