李 文 宋楊一嫣 宋金春

由敗血癥、細菌感染和病毒性肺炎以及外傷引起的急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)的主要原因,其特征是嚴重的低氧血癥和雙側(cè)肺滲透性損傷[1]。在ARDS的發(fā)生、發(fā)展過程中,肺泡毛細血管內(nèi)皮細胞損傷導致屏障通透性增加,引起大量水腫和炎性液體滲入肺泡腔,減弱氣體交換,最終導致呼吸衰竭[2, 3]。雖然肺保護性通氣策略的應用降低了ALI的病死率,但目前臨床上還沒有治療ALI的有效藥物。因此,深入了解ALI的病理學、尋找新的治療靶點具有重要意義。

多項研究證實,植物甾醇具有抗炎、保肝、降脂等作用[4]。23-乙酰澤瀉醇是植物甾醇的衍生物,從藥用植物Alisson中提取和分離[4]。23-乙酰澤瀉醇可降低脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導的心功能不全小鼠血漿中白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、白細胞介素-1(interleukin-1, IL-1)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)的水平,減輕心肌炎癥和浸潤,改善模型小鼠的存活率[5]。23-乙酰澤瀉醇可通過預防小鼠非酒精性脂肪性肝炎和膽汁淤積性肝損傷[6]。然而,23-乙酰澤瀉醇在調(diào)節(jié)肺損傷中的作用方式和機制尚未完全闡明。為了進一步探索23-乙酰澤瀉醇的藥理作用和潛在機制,本研究通過LPS氣管內(nèi)注射建立ALI模型,并研究23-乙酰澤瀉醇對肺損傷的作用機制。

材料與方法

1.材料:TNF-α、IL-1和IL-6的酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒購自英國Abcam公司。LPS購自美國Sigma-Aldrich公司。針對JNK1/2、磷酸化(P-)ERK1/2、總(T-) ERK1/2和GAPDH的抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。C57BL6J小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司。23-乙酰澤瀉醇購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司。

2.實驗動物:8～10周齡C57BL6J雄性小鼠24只(體質(zhì)量為23.5～27.5g)購自中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院。動物實驗按照武漢大學人民醫(yī)院動物護理和使用委員會批準(許可證號:WHDX-RM20191203)。將其按照隨機數(shù)字表法分為4組,每組各6只。(1)對照組:支氣管注射20μl無菌0.9%氯化鈉溶液。(2)23-乙酰澤瀉醇組:在模型建立前3天,小鼠灌胃接受30mg/kg 23-乙酰澤瀉醇,每天1次,共3次。隨后接受單次支氣管注射20μl無菌0.9%氯化鈉溶液,48h后取材。(3)LPS組:接受單次支氣管注射20μl 100μg LPS,48h后取材。(4)LPS+23-乙酰澤瀉醇組:在模型建立前3天,小鼠灌胃接受30mg/kg 23-乙酰澤瀉醇,每天1次。隨后接受單次支氣管注射20μl 100μg LPS,48h后取材。LPS組和LPS+23-乙酰澤瀉醇組小鼠LPS注射48h后,用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)灌注肺3次,并收集灌注溶液。

3.蘇木精-伊紅(HE)染色:LPS注射48h后取出肺組織,10%甲醛溶液固定,石蠟包埋,切成25μm的切片。進行HE染色后,使用顯微鏡(Olympus BX53,日本產(chǎn),購自上海賴氏電子科技有限公司)進行觀察肺組織的病理變化。為了評估肺炎性指數(shù),每只小鼠評估7個獨立的隨機肺野并計數(shù)下列指標:A:肺泡空間中的中性粒細胞;B:間隙中的中性粒細胞;C:透明膜;D:充滿肺泡的蛋白質(zhì)碎片;E:根據(jù)美國胸科學會官方研討會報告關(guān)于動物實驗性ALI的特征和測量的相關(guān)性,肺炎性指數(shù)=[(20×A)+(14×B)+(7×C)+(7×D)+(2×E)]/(肺野數(shù)×100)[9]。

4.肺水腫的測定:收集左肺并稱重以記錄濕重。肺在80℃下烘烤48h后記錄干重。濕重/干重(%)=濕重/干重×100%。

5.ELISA檢測肺泡灌洗液中的炎性細胞因子:通過使用ELISA試劑盒對TNF-α、IL-1和IL-6進行定量測定(均購自美國Biolegend公司),檢測ALI小鼠支氣管肺泡灌洗液中促炎性細胞因子水平。裂解組織樣品和細胞樣品。然后將裂解物在相應的板中溫育。洗滌后,加入抗體,樣品在室溫下孵育1h。洗滌后,加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的IgG并在室溫下孵育1h。加入150μl底物,采用酶標儀(美國BioTek Synergy HT公司)測定405nm處的吸光度值。

6. 氧化應激測定:采用2′,7′-二氯二氫熒光素(DCFH-DA)探針(上海Beyotime公司)測定活性氧(reactive oxygen species, ROS)的水平,采用酶標儀檢測450nm處的光密度值。使用試劑盒檢測丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平,超氧化物歧化酶(mitochondrial superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, Gpx)的活性(上海Beyotime公司)。

7.Western blot法檢測:采用放射免疫沉淀測定裂解緩沖液(radio immunoprecipitation assay, RIPA)裂解細胞,檢測總蛋白濃度,然后將樣品加載到聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠上。將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(HATF00010,美國Millipore公司)后,將膜與磷酸化的(P-)和總的(T-)應激活化蛋白激酶1/2(Jun N-terminal kinase,JNK1/2)、磷酸化的細胞外調(diào)節(jié)激酶1/2(phosphorylation extracellular signal-regulated-kinase1/2, P-ERK1/2)、總的ERK1/2(T-ERK1/2)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)一抗孵育過夜(均以1∶1000稀釋)。用增強化學發(fā)光試劑(美國Bio-Rad公司),并由ChemiDoc MP成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)捕獲信號。采用GAPDH作為內(nèi)參。

結(jié) 果

1.23-乙酰澤瀉醇減少LPS誘導的肺損傷:HE染色結(jié)果顯示,與對照組比較,LPS組小鼠肺組織損傷表現(xiàn)為充血、炎性細胞浸潤水腫和肺泡間隔增厚。LPS+23-乙酰澤瀉醇組小鼠肺組織損傷程度低于LPS組,表現(xiàn)為炎性細胞浸潤、間隙增厚明顯緩解(圖1)。

2.23-乙酰澤瀉醇減少LPS誘導的肺水腫和炎癥損傷:LPS組小鼠肺臟濕重/干重明顯高于對照組(P<0.05),而LPS+23-乙酰澤瀉醇組小鼠肺組織濕重/干重比值低于LPS組(P<0.05),提示肺水腫程度低于模型組。LPS組小鼠肺臟炎性指數(shù)高于對照組(P<0.05);LPS+23-乙酰澤瀉醇組小鼠肺組織炎性指數(shù)低于LPS組(P<0.05,圖2)。對照組和23-乙酰澤瀉醇組小鼠肺組織濕重/干重比值和炎性指數(shù)比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖2 23-乙酰澤瀉醇減少LPS誘導的肺水腫和炎癥損傷與對照組比較,*P<0.05;與LPS組比較,#P<0.05

3.23-乙酰澤瀉醇減少肺泡灌洗液中炎性細胞因子的分泌:ELISA檢測肺泡灌洗液中炎性細胞因子的水平發(fā)現(xiàn),LPS組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1、IL-6含量高于對照組(P<0.05),而LPS+23-乙酰澤瀉醇組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1、IL-6低于LPS組(P<0.05,圖3)。對照組和23-乙酰澤瀉醇組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1、IL-6含量比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖3 23-乙酰澤瀉醇減少肺泡灌洗液中炎性細胞因子的分泌與對照組比較,*P<0.05;與LPS組比較,#P<0.05

4.23-乙酰澤瀉醇減少LPS誘導的氧化應激:LPS組小鼠ROS水平和MDA含量高于對照組(P<0.05),而LPS+23-乙酰澤瀉醇組小鼠肺組織中ROS水平和MDA低于LPS組(P<0.05)。LPS組小鼠肺臟SOD2和Gpx活性低于對照組(P<0.05);LPS+23-乙酰澤瀉醇組小鼠肺組織中SOD2和Gpx活性高于LPS組(P<0.05,圖4)。對照組和23-乙酰澤瀉醇組小鼠上述氧化應激指標比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

5.23-乙酰澤瀉醇抑制JNK1/2和ERK1/2通路:Western blot法檢測結(jié)果顯示,LPS組小鼠P-JNK1/2表達水平和P-ERK1/2表達水平高于對照組(P<0.05),而LPS+23-乙酰澤瀉醇組小鼠肺組織中P-JNK1/2和P-ERK1/2低于LPS組(P<0.05)。對照組和23-乙酰澤瀉醇組P-JNK1/2和P-ERK1/2的表達比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,圖5、表1)。

表1 23-乙酰澤瀉醇抑制JNK1/2和ERK1/2通路

圖5 23-乙酰澤瀉醇抑制JNK1/2和ERK1/2通路

結(jié) 果

細胞損傷、炎癥激活等復雜因素共同促進ALI/ARDS的發(fā)病[2]。這一過程涉及多種細胞,包括肺泡上皮細胞、肺內(nèi)皮細胞以及各種炎性細胞,如中性粒細胞和肺泡巨噬細胞[3]。肺血管內(nèi)皮細胞在肺組織發(fā)育、肺組織免疫、維持肺血管張力和屏障完整性中起關(guān)鍵作用[1]。在ALI/ARDS病理過程中,肺血管內(nèi)皮是最先暴露于病理刺激的基礎(chǔ)細胞。肺血管內(nèi)皮損傷導致ALI/ARDS的發(fā)生和進一步發(fā)展[1]。既往研究報道,23-乙酰澤瀉醇可降低LPS誘導的心功能不全小鼠血漿中IL-6、IL-1和TNF-α的水平,減輕心肌炎癥和浸潤,改善模型小鼠的存活率[5]。23-乙酰澤瀉醇可通過預防小鼠非酒精性脂肪性肝炎和膽汁淤積性肝損傷[6]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),23-乙酰澤瀉醇可抑制ALI的進展。23-乙酰澤瀉醇保護LPS刺激的肺損傷,減輕炎性反應和氧化應激。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)被生長因子、促炎性細胞因子和壓力等多種因素激活,在細胞發(fā)育、存活、死亡、炎癥等方面發(fā)揮著重要作用[10]。MAPK包含ERK1/2、JNK1/2、P38和ERK5。MAPK通路可介導炎癥、細胞死亡和氧化應激[11]。在ALI中,ERK1/2在肺泡內(nèi)皮細胞中的表達上調(diào),導致ROS的產(chǎn)生增加[12]。此外,一旦ERK1/2被磷酸化激活,可不斷誘導促凋亡蛋白Bax和caspase-3的表達和激活,促進細胞凋亡的發(fā)生[12]。研究還發(fā)現(xiàn),ERK1/2的激活可以促進炎癥級聯(lián)反應,抑制ERK1/2可以減少ALI病理過程中炎性介質(zhì)的釋放[13, 14]。JNK主要由促炎性細胞因子以及應激通過凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1, ASK1)、轉(zhuǎn)化生長因子激酶1(transforming growth factor kinase 1, TAK1)自身的磷酸化激活[10, 15]。研究證明,抑制ALI小鼠中的MAPK可減輕炎癥和氧化應激[16]。既往研究發(fā)現(xiàn),23-乙酰澤瀉醇可以作用于Toll樣受體信號途徑[5, 17]。然而本研究發(fā)現(xiàn),23-乙酰澤瀉醇可同時作用于肺臟組織的ERK1/2和JNK1/2,抑制ERK1/2和JNK1/2的激活,從而改善LPS誘導的ALI。

綜上所述,23-乙酰澤瀉醇通過同時作用于ERK1/2和JNK1/2通路的激活來抑制和改善LPS誘導的ALI。23-乙酰澤瀉醇可能成為治療ALI/ARDS的新策略。