喬 軒 楊 勇 許 濤 歐陽(yáng)長(zhǎng)理 王人灝 宋 軍 張 斌 楊 軍

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球癌癥相關(guān)的第二大死亡原因,有研究表明,在中國(guó)其致死率已位居所有腫瘤的第2位[1,2]。HCC通常在早期沒(méi)有臨床癥狀,而在中晚期僅有2/3的病例出現(xiàn)不同表現(xiàn),并且中晚期患者僅有約20%的患者適合手術(shù)[3]。據(jù)估計(jì),我國(guó)是乙肝大國(guó),HCC病死率位居惡性腫瘤第2位,且處于上升趨勢(shì)。因此,HCC的早期診斷對(duì)于提高HCC患者的生存率至關(guān)重要[4]。

許多醫(yī)生在臨床實(shí)踐中使用甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)的水平來(lái)診斷HCC,然而,高達(dá)40%的HCC患者,尤其是在疾病早期,AFP水平正常或輕度升高,這反映了AFP單獨(dú)檢測(cè)早期HCC的敏感度較低,因此需要確定更可靠的血清生物學(xué)標(biāo)志物[5～8]。異常凝血酶原即維生素K缺乏或拮抗劑Ⅱ誘導(dǎo)蛋白(protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ, PIVKA-Ⅱ),被認(rèn)定為HCC患者高度特異性標(biāo)志物[9]。有文獻(xiàn)表明,甲胎蛋白異質(zhì)體(alpha fetoprotein-L3, AFP-L3)是一種特異AFP,只產(chǎn)生于腫瘤細(xì)胞中,并隨著病情變化而升高[10,11]。目前日本肝病協(xié)會(huì)指南已建議HCC進(jìn)行AFP-L3的檢測(cè)[12]。本研究調(diào)查了不同患者血清內(nèi)這些腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)水平,通過(guò)比較新診斷的HCC患者單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)這些標(biāo)志物的敏感度、特異性和受試者工作特征(receiver operator characteristic,ROC)曲線,來(lái)檢測(cè)不同指標(biāo)對(duì)HCC的診斷價(jià)值。

資料與方法

1.臨床資料:回顧性選擇2021年4月～2022年5月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的門診或住院的55例HCC患者作為HCC組,其中男性45例,患者年齡33～80歲,平均年齡為60.91±9.61歲;女性10例,患者年齡50～83歲,平均年齡為61.30±10.61歲。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合中國(guó)《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》,同時(shí)根據(jù)CNLC分期將HCC患者分為早期(Ⅰ期)和中晚期HCC(Ⅱ、Ⅲ期)[13];②未接受手術(shù)、放療、化療和其他治療;③未合并其他嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病。排除標(biāo)準(zhǔn):①實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)數(shù)據(jù)缺失;②嚴(yán)重溶血、微生物污染或黃疸;③合并其他惡性腫瘤。選擇同期住院的肝臟良性病變(benign liver disease, BLD)患者54例作為BLD組,其中男性28例,患者年齡27～79歲,平均年齡為59.96±11.89歲;女性26例,患者年齡33～85歲,平均年齡為61.81±11.37歲。另選擇在徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院體檢的43例健康人作為對(duì)照組,其中男性21例,年齡35～85歲,平均年齡為57.00±10.47歲;女性22例,年齡24～86歲,平均年齡為54.95±17.52歲。所有檢查者抽血前均簽署知情同意書,本研究通過(guò)徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審批(倫理學(xué)審批號(hào):xXYFY2019-KL129-01)。3組研究對(duì)象性別、年齡比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.方法:檢測(cè)3組研究對(duì)象的AFP、AFP-L3和PIVKA-Ⅱ水平。采集所有研究對(duì)象入院后早晨空腹靜脈血5ml,3500r/min離心5min,分離血漿,貯藏于-40℃低溫冰箱保存待檢。3種生物學(xué)標(biāo)志物的陽(yáng)性參考值范圍如下:AFP>9.00ng/ml,AFP-L3>10.00%,PIVKA-Ⅱ>40.00mAU/ml。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn),不符合正態(tài)分布的以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)[M(Q1,Q3)]表示,多組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn),兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。繪制AFP、AFP-L3和PIVKA-Ⅱ單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)ROC曲線,計(jì)算曲線下面積(area under the curve, AUC)來(lái)評(píng)價(jià)不同指標(biāo)對(duì)HCC的診斷效能,運(yùn)用MedCalc軟件比較不同分組ROC曲線的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.各組血清AFP、AFP-L3和PIVKA-Ⅱ水平比較:HCC組患者AFP、AFP-L3和PIVKA-Ⅱ的表達(dá)最高,中位水平分別為19.91ng/ml、16.00%、364.00mAU/ml,表達(dá)水平均明顯高于BLD組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),與對(duì)照組比較,BLD組患者的AFP及AFP-L3水平增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),詳見(jiàn)表1。

表1 各組血清AFP、AFP-L3、PIVKA-Ⅱ水平比較[M(Q1,Q3)]

2.AFP、AFP-L3和PIVKA-Ⅱ與HCC患者病理特征的關(guān)系:觀察HCC患者AFP、AFP-L3和PIVKA-Ⅱ表達(dá)水平,在年齡上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),在腫瘤個(gè)數(shù)、最大徑、TNM分期及門靜脈癌栓是否發(fā)生轉(zhuǎn)移上比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見(jiàn)表2。

表2 不同病理指標(biāo)下AFP、AFP-L3和PIVKA-Ⅱ水平比較[M(Q1,Q3)]

3.血清AFP、AFP-L3和PIVKA-Ⅱ單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)在早期HCC中的診斷價(jià)值:在3種腫瘤標(biāo)志物中,單獨(dú)檢測(cè)PIVKA-Ⅱ的AUC最大為0.896,95% CI:0.834～0.957,均高于單獨(dú)檢測(cè)AFP,由此ROC曲線將PIVKA-Ⅱ的截?cái)嘀翟O(shè)為42.500mAU/ml,AFP的診斷效能(敏感度、特異性)分別為63.60%、90.70%,聯(lián)合檢測(cè)時(shí)AFP、AFP-L3和PIVKA-Ⅱ的AUC最高為0.937,95% CI:0.894～0.980,各分組間AUC兩兩比較,P均<0.05,詳見(jiàn)圖1和表3。

圖1 血清AFP、AFP-L3和PIVKA-Ⅱ單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)診斷HCC的ROC曲線

表3 血清AFP、AFP-L3和PIVKA-Ⅱ診斷肝癌的ROC曲線分析

4.血清AFP、AFP-L3和PIVKA-Ⅱ單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)HCC的診斷價(jià)值比較:單項(xiàng)檢測(cè)時(shí),PIVKA-Ⅱ的敏感度、特異性及準(zhǔn)確度均高于其他兩項(xiàng)指標(biāo),系列實(shí)驗(yàn)中AFP+AFP-L3+PIVKA-Ⅱ和AFP-L3+PIVKA-Ⅱ組合的特異性最高,為94.40%,均高于其他組合,平行實(shí)驗(yàn)中AFP+AFP-L3+PIVKA-Ⅱ的敏感度最高,為98.20%,AFP/PIVKA-Ⅱ的特異性最高為77.80%,詳見(jiàn)表4。

表4 血清AFP、AFP-L3和PIVKA-Ⅱ單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)對(duì)HCC的診斷價(jià)值(%)

結(jié) 果

HCC是一種致死率極高的惡性腫瘤,由于早期HCC缺乏典型臨床癥狀,部分患者確診時(shí)已進(jìn)入中晚期,錯(cuò)過(guò)最佳手術(shù)時(shí)間。據(jù)報(bào)道,此類患者5年生存率僅為12.1%,HCC的早期診斷對(duì)于能否實(shí)施治療干預(yù)以改善患者的預(yù)后和長(zhǎng)期生存至關(guān)重要[14～16]。AFP是由卵黃囊及胚胎時(shí)期肝細(xì)胞合成的一種糖蛋白,是HCC患者最早確定的一種檢測(cè)指標(biāo),目前廣泛應(yīng)用于肝癌的診斷與篩查,AFP除在肝癌患者中升高以外,也在部分BLD患者體內(nèi)升高,易造成漏診和誤診[17,18]。Giannini等[19]研究表明,肝癌的發(fā)生與AFP升高相關(guān),本研究發(fā)現(xiàn),AFP的AUC為0.809,低于AFP-L3和PIVKA-Ⅱ。因此,血清AFP單獨(dú)檢測(cè)對(duì)HCC的診斷具有一定意義,但準(zhǔn)確度不夠,需聯(lián)合其他指標(biāo)。

AFP根據(jù)與小扁豆凝集素的集合能力不同,可分為AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3 3種異質(zhì)體,其中AFP-L1主要存在于肝臟良性疾病中,AFP-L2在卵黃囊瘤中的表達(dá)會(huì)明顯上升,AFP的糖基化異構(gòu)體AFP-L3作為L(zhǎng)CA的結(jié)合型,主要由肝癌細(xì)胞所分泌,研究稱其特異性高于AFP,被認(rèn)為是早期檢測(cè)HCC的生物學(xué)標(biāo)志物之一[20]。本研究結(jié)果顯示,HCC患者血清AFP-L3水平較BLD組明顯升高,單獨(dú)檢測(cè)AFP-L3時(shí),其AUC和敏感度都高于AFP,分別為0.828、74.5%,這與文獻(xiàn)報(bào)道一致,此時(shí)最佳截?cái)嘀禐?.25[21]。PIVKA-Ⅱ是一種異常的凝血酶原蛋白,是由于翻譯后羧基化獲得性缺陷而產(chǎn)生的,PIVKA-Ⅱ有助于早期小肝癌的診斷[22～24]。有文獻(xiàn)報(bào)道顯示,聯(lián)合檢測(cè)AFP和PIVKA-Ⅱ可提高肝癌的診斷效能[25]。本研究中當(dāng)PIVKA-Ⅱ的截?cái)嘀禐?2.500mAU/ml時(shí),其AUC和敏感度分別為0.896、82.8%,均高于AFP,表明PIVKA-Ⅱ可作為一種新的腫瘤標(biāo)志物用于早期HCC的診斷。

本研究通過(guò)比較患者臨床病理指標(biāo)發(fā)現(xiàn),AFP、AFP-L3和PIVKA-Ⅱ與HCC患者的年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與腫瘤的最大徑、數(shù)量、TNM分期和門靜脈是否發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān),這與Toader等[26]的研究結(jié)果相一致,同時(shí)對(duì)AFP、AFP-L3及PIVKA-Ⅱ 3種指標(biāo)單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能進(jìn)行評(píng)估,發(fā)現(xiàn)與BLD患者比較,HCC患者的3種指標(biāo)均明顯上升,單獨(dú)檢測(cè)時(shí)PIVKA-Ⅱ的AUC最高(0.896),此時(shí)最佳截?cái)嘀禐?2.500mAU/ml,其診斷HCC的敏感度、特異性分別為81.80%、88.90%,當(dāng)這些腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合使用時(shí),AFP+AFP-L3+PIVKA-Ⅱ的AUC最大(0.937),高于3種指標(biāo)單獨(dú)及相互兩聯(lián)檢測(cè),可提高早期HCC的診斷效能。系列實(shí)驗(yàn)可提高檢測(cè)診斷的特異性,AFP+AFP-L3+PIVKA-Ⅱ組合的特異性最高(94.4%)。平行實(shí)驗(yàn)可提升確診的敏感度,AFP+AFP-L3+PIVKA-Ⅱ組合的敏感度最高(98.2%)。由此可見(jiàn),相比于單獨(dú)檢測(cè)某一項(xiàng)指標(biāo),聯(lián)合檢測(cè)具有更高的敏感度和準(zhǔn)確度。

本研究結(jié)果顯示,在區(qū)分HCC和BLD時(shí),單獨(dú)檢測(cè)時(shí)PIVKA-Ⅱ的診斷價(jià)值最高,聯(lián)合使用AFP、AFP-L3和PIVKA-Ⅱ 3種指標(biāo)比單獨(dú)使用任何一種腫瘤標(biāo)志物都具有更高的診斷效能。該檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、穩(wěn)定,適合各級(jí)醫(yī)院使用。本研究具有一定的局限性,由于本研究采用回顧性分析,數(shù)據(jù)來(lái)源較為單一,研究樣本量小,入組患者病因差異顯著,未對(duì)患者生化指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分等。今后還需開展大樣本量研究,從而進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)果的可靠性,為早期HCC的診斷提供更為可靠的臨床指標(biāo)。