孫 玥 耿林玉 黃賽賽 王 紅 丁從珠
間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSC)是中胚層系的起源細胞,具有自我更新、多向分化、支持造血和組織修復的潛能。同時,MSC具有強大的免疫抑制功能,可以對體內多種免疫細胞發(fā)揮調節(jié)作用[1]。因此,在自身免疫性疾病的治療方面,MSC具有潛在的治療價值與廣闊的應用前景。
許多體內外實驗均證實MSC的免疫調節(jié)功能受外源性刺激的影響[2]。在某些情況下,由于機體內環(huán)境因子的不適刺激,MSC可能并不能有效發(fā)揮免疫調節(jié)功能。在機體內環(huán)境中,Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)刺激信號會影響MSC的免疫調節(jié)功能[3]。MSC表達多種功能性的TLR,很多研究證實TLR及其配體可以影響MSC的多種細胞功能包括細胞增殖、分化、遷移和免疫調節(jié)等[4]。有研究顯示,TLR4或TLR3的激活通過下調Jagged1表達,降低骨髓MSC對淋巴細胞增殖的免疫調節(jié)作用[5]。但是也有研究發(fā)現,通過誘導吲哚胺-2,3-雙加氧酶(indoleamine-2,3-dioxygenase,IDO)產生,TLR3或TLR4激活增強了骨髓MSC的免疫調節(jié)功能[6]。
近年來研究顯示,與骨髓MSC比較,臍帶來源的MSC在臨床治療方面可能更有優(yōu)勢[7]。本研究觀察了TLR4或TLR3激活對臍帶、骨髓兩種不同來源MSC免疫調節(jié)功能的影響,同時分析了兩種MSC中TLR4和TLR3的基礎表達情況。
1.試劑及儀器:DMEM-F12培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基與胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自美國Gibco公司。人外周血淋巴細胞分離液購自挪威Axis-Shield公司。TLR4、TLR3流式抗體與熒光染料CFSE購自美國eBioscience公司。TLR4激動劑脂多糖(LPS)、TLR3激動劑聚肌胞苷酸[polyinosinic-polycytidylic acid, Poly(I:C)]購自美國Sigma公司??谷薈D3、CD28抗體購自美國eBioscience公司。Trizol、PrimeScriptTMRT與SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒購自日本TaKaRa公司。CO2培養(yǎng)箱購自美國Sheldon公司。CIMO超凈工作臺購自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。倒置顯微鏡(CKX53)購自日本Olympus公司。FACSCalibur型流式細胞儀購自美國BD公司。Step-one PlusTM熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。
2.MSC分離培養(yǎng):實驗中骨髓來自南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院骨科關節(jié)置換術患者,臍帶來自南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院婦產科健康產婦。實驗中所需外周血來自于健康志愿者。所有實驗均得到南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準(倫理學審批號:2021-544-01),本研究獲得研究對象的知情同意。將關節(jié)置換術中所得松質骨碎片及骨髓液,用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)充分沖洗,離心后用紅細胞裂解液裂解,裂解充分后加入PBS混勻,有效離心半徑15cm,1500r/min離心5min,棄上清,PBS重復洗滌1次,完畢后將細胞用含10%FBS的DMEM-F12完全培養(yǎng)基混勻,以105個/毫升的密度種植。細胞放置于37℃的5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),待細胞長到80%左右融合時傳代。實驗中所用3例骨髓MSC為P3代。臍帶無菌采集后,于DMEM-F12完全培養(yǎng)基4℃保存,在24h內處理。無菌狀態(tài)下,采用無菌器械去除靜脈及動脈,分離剝取臍帶中的華通氏膠。采用貼壁法,將膠組織剪成約1mm3的小塊接種入10cm培養(yǎng)皿中,靜置5min至組織塊黏合培養(yǎng)瓶/皿壁充分時,緩慢加入DMEM-F12完全培養(yǎng)基,置于溫度37℃、5% CO2的孵箱中。倒置顯微鏡下觀察細胞生長至80%融合時傳代。實驗中所用3例臍帶MSC為P3代。
3.細胞處理:本實驗中,將臍帶或者骨髓MSC以每孔5×104個的密度種植于24孔板,培養(yǎng)上清均為500μl,細胞貼壁后分別加入LPS、Poly(I:C)刺激處理,LPS刺激濃度為10ng/ml,Poly(I:C)刺激濃度為1μg/ml,處理時間為24h,同時留取未刺激處理的MSC組。細胞實驗分組為:①外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)單獨組(PBMC);②MSC與PBMC共培養(yǎng)組(+MSC);③LPS預處理MSC與PBMC共培養(yǎng)組(+LPS預處理MSC);④Poly(I:C)預處理MSC與PBMC共培養(yǎng)組[+Poly(I:C)預處理MSC]。
4.MSC調節(jié)PBMC增殖實驗:LPS、Poly(I:C)刺激實驗結束后PBS洗滌MSC,然后接種PBMC細胞懸液共培養(yǎng)。人淋巴細胞分離液(1.077g/ml)分離健康志愿者外周血PBMC,5μmol/L CFSE 37℃染色10min后,用4℃的RPMI 1640完全培養(yǎng)基終止反應5min,1500r/min離心10min,棄上清。RPMI 1640完全培養(yǎng)基混勻PBMC,加入2μg/ml的抗CD3/CD28抗體刺激淋巴細胞增殖,PBMC以每孔5×105個的細胞數量與MSC共培養(yǎng)。共培養(yǎng)4天后收集PBMC,流式細胞術檢測CFSE熒光衰減的百分率,即為細胞增殖百分率。
5.PCR檢測TLR4、TLR3基因水平:將臍帶MSC、骨髓MSC接種到6孔板,待細胞80%融合,胰酶消化,PBS洗滌收集細胞。用Trizol裂解液提取RNA后,用日本TaKaRa公司PrimeScriptTMRT試劑盒進行反轉錄。在Step-one PlusTM熒光定量PCR儀上進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)。計算標準化后的2-ΔΔCt值表示mRNA的相對表達量。
6.流式細胞術檢測TLR4、TLR3蛋白水平:將臍帶MSC、骨髓MSC接種到6孔板,待細胞80%融合,胰酶消化,PBS洗滌收集細胞。流式細胞術檢測TLR4、TLR3的蛋白水平,以幾何平均熒光強度(mean fluorescence intensity, MFI)分析統(tǒng)計。
1.LPS或Poly(I:C)預處理對骨髓MSC免疫調節(jié)功能的影響:分別以TLR4激動劑LPS、TLR3激動劑Poly(I:C)預處理骨髓MSC 24h,觀察TLR激活對骨髓MSC調節(jié)PBMC增殖的影響。結果顯示,與單獨培養(yǎng)的PBMC增殖情況比較,未處理的骨髓MSC、Poly(I:C)預處理的骨髓MSC均可以顯著抑制PBMC增殖(P<0.05),但是LPS預處理的骨髓MSC并不能有效抑制PBMC增殖(P>0.05)。與未處理的骨髓MSC比較,LPS預處理的骨髓MSC抑制PBMC增殖的能力顯著下降(P<0.05),詳見圖1。
圖1 LPS或Poly(I:C)預處理對骨髓MSC免疫調節(jié)功能的影響A.各組PBMC增殖的流式圖;B.各組PBMC增殖百分率比較。*P<0.05,n=3
2.LPS或Poly(I:C)預處理對臍帶MSC免疫調節(jié)功能的影響:除了骨髓來源的MSC,臍帶來源的MSC也具有強大的免疫調節(jié)功能,可以抑制淋巴細胞增殖。本實驗以臍帶MSC為研究對象,繼續(xù)觀察LPS、Poly(I:C)激活TLR對臍帶MSC調節(jié)PBMC增殖的影響。結果顯示,與單獨培養(yǎng)的PBMC比較,未處理的臍帶MSC、LPS預處理的臍帶MSC與Poly(I:C)預處理的臍帶MSC均可以顯著抑制PBMC增殖(P<0.05)。同時,與未處理的臍帶MSC比較,LPS或者Poly(I:C)預處理的骨髓MSC抑制PBMC增殖的能力比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),詳見圖2。
3.臍帶MSC與骨髓MSC的TLR表達水平:本研究進一步比較了骨髓和臍帶兩種不同來源MSC中TLR4和TLR3的基礎表達量。RT-qPCR檢測結果顯示,與骨髓MSC比較,臍帶MSC中TLR4、TLR3的基因相對表達量較低(P<0.05),詳見圖3中A、B。本研究通過流式細胞術檢測MFI,分析臍帶MSC與骨髓MSC中TLR4、TLR3的蛋白表達水平。與基因檢測結果一致,流式細胞術檢測結果顯示,與骨髓MSC比較,臍帶MSC中TLR4、TLR3的蛋白表達水平明顯更低(P<0.05),詳見圖3中C、D。
圖3 臍帶MSC與骨髓MSC的TLR表達水平A.TLR4基因表達;B.TLR3基因表達;C.TLR4蛋白表達;D.TLR3蛋白表達。*P<0.05,n=3
MSC具有多種特征,這些特征使其成為免疫治療的理想候選細胞[8]。MSC表達低水平的人類白細胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)Ⅰ類分子,不表達HLA Ⅱ類分子和共刺激分子,因此,MSC適用于異基因移植治療,大大拓寬了MSC的應用范圍。MSC的另一個主要特征是其具有強大的免疫調節(jié)作用,因而很多研究將MSC用于移植物抗宿主病、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風濕關節(jié)炎等免疫相關疾病的治療[9]。
MSC可作用于固有免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng),可抑制絲裂原(如植物凝集素、刀豆蛋白)或抗體(如抗CD2、抗CD3、抗CD28)刺激的淋巴細胞增殖[10]。MSC能夠通過直接細胞接觸或旁分泌效應釋放可溶性因子,如肝細胞生長因子、前列腺素E2、轉化生長因子、吲哚胺-2,3-雙加氧酶、一氧化氮、jagged1和白細胞介素-10(interleukin-10, IL-10)等,抑制淋巴細胞增殖[11]。
研究顯示,TLR刺激信號包括病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)和損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMP),可能會極大地影響MSC的免疫調節(jié)特性,從而影響MSC的治療結果[4]。TLR是機體固有免疫系統(tǒng)的重要識別受體,是激活機體免疫反應的第一線,它可存在于細胞表面和細胞內部,識別PAMP或DAMP,引發(fā)后續(xù)的適應性免疫反應。MSC表達多種功能性的TLR亞型包括TLR1~TLR10,其中TLR3和TLR4在人類MSC中表達量相對較高[12]。研究發(fā)現,在實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)模型中,TLR4激活后的骨髓MSC產生一氧化氮的能力降低,從而影響了骨髓MSC對EAE的治療效果[13]。另有文獻報道,LPS刺激骨髓MSC可增加其產生IL-6、IL-8等,并減弱骨髓MSC對淋巴細胞的抑制效應,但是Poly(I:C)刺激骨髓MSC卻可使其免疫抑制效應增強[14]。
與骨髓來源的MSC比較,臍帶MSC更容易獲得,并表現出更高的增殖效率,所以臍帶MSC已被越來越多的研究人員考慮使用。本研究評估了TLR激動劑LPS或Poly(I:C)預處理,是否會導致骨髓或臍帶MSC免疫調節(jié)功能的異常,同時還評估了臍帶MSC和骨髓MSC之間TLR3和TLR4的表達是否存在顯著差異。實驗結果表明,與骨髓MSC比較,臍帶MSC對LPS或Poly(I:C)的刺激存在明顯的“抗性”,即LPS或Poly(I:C)刺激后對臍帶MSC抑制淋巴細胞增殖的影響并不顯著。本研究進一步分析顯示,臍帶MSC中,TLR3、TLR4的基因和蛋白表達水平均明顯低于骨髓MSC。這一結果與之前文獻報道的一致[15]。這部分解釋了兩種MSC對TLR刺激信號的不同反應。
既往文獻報道,骨髓MSC在骨髓細胞總量中占有的比例極低(0.001%~0.010%),并且骨髓MSC的細胞數量和增殖能力受年齡因素影響很大,隨著年齡增長其增殖能力明顯降低。臍帶MSC與骨髓MSC類似,同樣具有多向分化和免疫調節(jié)的功能,但是臍帶易于獲取而且資源豐富,細胞數量大,屬于醫(yī)療廢棄物,規(guī)避創(chuàng)傷性操作和倫理的束縛。目前MSC在動物實驗和臨床試驗中未達到穩(wěn)定的免疫治療效果,可能與選取移植的MSC細胞來源相關。有些個案報道臍帶MSC的免疫調節(jié)功能可能優(yōu)于同一個體的骨髓MSC[16]。臨床試驗也證實,在造血干細胞移植時合并臍帶MSC移植,與合并骨髓MSC移植比較,移植排斥事件的發(fā)生率更低。
綜上所述,本研究表明,與臍帶MSC比較,骨髓MSC的免疫調節(jié)功能更容易受到TLR激動劑刺激的影響,并且臍帶MSC中TLR的基礎表達量明顯低于骨髓MSC。因此,筆者團隊推測在MSC的免疫治療方面,臍帶MSC可能較骨髓MSC更有優(yōu)勢,但仍然需要大規(guī)模的臨床試驗以進一步證實,從而優(yōu)化MSC移植治療免疫相關疾病的策略。