易 波 蘇 可 蔡玉立 李俊峰 陳小琳 包 艷 文重遠(yuǎn)

糖尿病是遺傳和環(huán)境因素共同引起的慢性代謝性疾病,嚴(yán)重影響我國(guó)居民健康水平。我國(guó)成人糖尿病患病率已增加至12.8%,預(yù)計(jì)2030年患病人數(shù)將達(dá)到1.4億,其中90%以上為2型糖尿病(type 2diabetes, T2DM)[1]。腸道菌群通過(guò)調(diào)控短鏈脂肪酸和炎性細(xì)胞因子表達(dá)、改變腸道滲透性、影響宿主免疫系統(tǒng)的成熟和調(diào)控功能等多種機(jī)制參與T2DM的發(fā)生、發(fā)展[2, 3]。但上述研究主要針對(duì)糖尿病發(fā)病后的人群和動(dòng)物進(jìn)行比較分析,很少在動(dòng)物模型中探討T2DM發(fā)病前后腸道微生物的結(jié)構(gòu)、組成、豐度等變化情況,不能完整地解釋腸道菌群在T2DM發(fā)病早期的作用。

高脂飲食聯(lián)合低劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)的T2DM大鼠模型能夠模擬大多數(shù)T2DM患者早期的病理生理過(guò)程[4]。因此,本研究擬在該模型中,采用16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)分析高脂喂養(yǎng)后和STZ注射后腸道菌群結(jié)構(gòu)、組成、豐度的變化,既是為了從腸道菌群的角度評(píng)價(jià)該模型的實(shí)用性,也是為探索腸道菌群在T2DM發(fā)病早期中的作用提供參考。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:武漢大學(xué)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠,體質(zhì)量為200～250g,本研究通過(guò)武漢大學(xué)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)[倫理學(xué)審批號(hào):WDRM(福)第20180407號(hào)]。

2.主要試劑與儀器:STZ購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司,溶解于0.1mmol/L枸櫞酸鈉緩沖液中。高脂飼料D12492由鼠來(lái)寶(武漢)生物科技有限公司提供。大鼠血清胰島素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunoadsordent assay, ELISA)試劑盒購(gòu)自瑞士MERCODIA公司,血糖檢測(cè)儀(MS*GR102B)購(gòu)自日本泰爾茂公司。QIAmap糞便DNA試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司,擴(kuò)增聚合酶為Q5?High-Fidelity DNA Polymerase(美國(guó)New England Biolabs公司),凝膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)AXYGEN公司。DNA純度測(cè)定使用Nanodrop One紫外分光光度計(jì)(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)。文庫(kù)構(gòu)建試劑盒為T(mén)ruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit(美國(guó)Illumina公司)。Illumina MiSeq測(cè)序儀購(gòu)自上海派森諾生物科技有限公司。

3.動(dòng)物模型建立[5]:適應(yīng)性喂養(yǎng)1周的大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組(C組,n=5)和T2DM組(D組,n=5)。隨后,C組大鼠給予常規(guī)飼料喂養(yǎng),D組大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)。4周后,于禁食12h后測(cè)量大鼠體質(zhì)量,收集大鼠24h尿量,血糖儀檢測(cè)尾部毛細(xì)血管葡萄糖濃度,記為T(mén)0。接著單次腹腔注射35mg/kg STZ(D組)和0.1mmol/L枸櫞酸鈉緩沖液(C組),72h和1周后2次測(cè)量尾部毛細(xì)血管空腹血糖(fasting plasma glucose, FPG),以FPG≥13.9mmol/L為糖尿病模型成立,此時(shí)記為T(mén)1。采集大鼠尾靜脈血清用于檢測(cè)胰島素水平,計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)[HOMA-IR=空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(μIU/ml)/22.5],其中胰島素單位換算關(guān)系為1ng/ml=24.7968μIU/ml。

4.糞便采集:在T0和T1期,從C組和D組大鼠中收集新鮮直腸糞便樣本(>0.2g)并放入-80℃冰箱內(nèi)保存。

5.糞便DNA提取和檢測(cè):提取大鼠糞便DNA,以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量,以Nanodrop紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度后,用無(wú)菌水將標(biāo)本調(diào)整至20ng/μl。

6.16S rDNA-V3V4區(qū)PCR擴(kuò)增:以稀釋后的DNA樣本為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其中上游引物序列為5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′,下游引物序列為5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR反應(yīng)條件為98℃預(yù)變性2min,98℃變性15s,55℃退火30s,72℃延伸30s,共25～30個(gè)循環(huán),最后72℃擴(kuò)展延伸5min。對(duì)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收純化和熒光定量。

7.文庫(kù)構(gòu)建與高通量測(cè)序:首先在DNA序列3′端添加A堿基,在序列5′端添加Index序列的測(cè)序接頭,以磁珠篩選法去除自連片段。隨后將純化的DNA片段再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到合格的測(cè)序文庫(kù),按比例混合后經(jīng)NaOH變性為單鏈,使用Illumina MiSeq測(cè)序儀進(jìn)行2×300bp的雙端測(cè)序。

8.生物信息學(xué)分析:對(duì)測(cè)序的原始數(shù)據(jù)按照引物和Barcode信息識(shí)別樣本,去除嵌合體等疑問(wèn)序列。接著進(jìn)行操作分類(lèi)單元(operational taxonomic units, OUTs)歸并和劃分,評(píng)估樣本的α多樣性水平,以Metastats法和基于線性判別分析法(linear discriminant analysis, LDA)的LEfSe進(jìn)行差異分析,Mothur軟件和Cytoscape軟件進(jìn)行優(yōu)勢(shì)菌群互作Spearman關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析,以PICRUSt預(yù)測(cè)優(yōu)勢(shì)菌群對(duì)第2級(jí)水平物質(zhì)代謝功能的影響。

結(jié) 果

1. T2DM大鼠模型的評(píng)價(jià):在T0期,與C組比較,D組大鼠平均FPG升高,但未達(dá)到糖尿病的標(biāo)準(zhǔn)。在STZ干預(yù)后(T1),D組大鼠體質(zhì)量下降,尿量增多,FPG均超過(guò)13.9mmol/L,空腹胰島素水平降低,HOMA-IR指數(shù)增高(P均<0.05,表1)。

表1 高脂飲食和STZ干預(yù)對(duì)大鼠生理指標(biāo)的影響

2.腸道菌群多樣性分析:兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)20個(gè)樣本共得到684835個(gè)高質(zhì)量序列。與數(shù)據(jù)庫(kù)Greengenes比對(duì)后鑒定出87047個(gè)OTUs,其中,T0期C組獨(dú)有OTUs 1414個(gè),T0期D組獨(dú)有2199個(gè),T1期C組有2123個(gè),T1期D組有1731個(gè)。α多樣性分析主要關(guān)注生態(tài)系統(tǒng)的物種多樣性程度,對(duì)某個(gè)樣品或多個(gè)樣品進(jìn)行物種豐富度和群落中個(gè)體分配的均勻度兩個(gè)方面的研究。本研究選擇Chao1、Ace、Shannon、Simpson指數(shù)對(duì)菌群進(jìn)行豐富度和均勻度的研究。與菌落豐富度有關(guān)的指數(shù)Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)在T1期D組中下降,但反映菌落多樣性的指數(shù)Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

圖1 兩組大鼠腸道菌群多樣性比較

3.群落結(jié)構(gòu)分析:圖2A發(fā)現(xiàn)與相應(yīng)時(shí)點(diǎn)的C組比較,D組菌落數(shù)量增多。在門(mén)水平,T0期D組大鼠厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)和變形菌門(mén)增多,擬桿菌門(mén)減少;T1期D組大鼠菌落呈類(lèi)似變化,但變形菌門(mén)相對(duì)更豐富(圖2B)。在屬水平,T0期D組大鼠乳桿菌屬和普雷沃菌屬豐度減少,柯林斯菌屬、布勞特菌屬、Allobaculum菌和擬桿菌屬含量相對(duì)更豐富;T1期D組大鼠棒狀桿菌屬、顫螺菌屬和多爾菌屬的相對(duì)豐度進(jìn)一步增多(圖2中C、D)。

4.差異菌種篩選:與C組比較,T0期D組大鼠在屬水平變化的菌群按增高倍數(shù)由高到低依次為克里斯滕森菌屬、柯林斯菌屬、Allobaculum菌、布勞特菌屬、擬桿菌屬、螺桿菌屬、顫螺菌屬、厭氧芽胞梭菌屬、優(yōu)桿菌屬和Mucispirillum菌;而豐度下降的菌種依次為羅伊乳桿菌屬、普雷沃菌屬和Turcibacter菌(圖3)。T1期D組大鼠在屬水平增高的菌群依次為布勞特菌屬、顫螺菌屬、多爾菌屬、副擬桿菌屬、厭氧棍狀菌屬、優(yōu)桿菌屬和葡萄球菌屬;豐度下降的菌種為普雷沃菌屬、Lachnosipra菌和羅伊乳桿菌屬(圖4)。

圖4 T1期大鼠差異最顯著的前17個(gè)菌落分布圖

5.優(yōu)勢(shì)菌群關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析:在T0期形成以乳桿菌和普雷沃菌屬為核心的負(fù)相關(guān)優(yōu)勢(shì)屬,即彼此排斥(co-exclusion)的相互作用模式;以顫螺菌屬、克里斯滕森菌屬和優(yōu)桿菌屬為核心的正相關(guān)優(yōu)勢(shì)屬,即共同出現(xiàn)(co-occurrence)模式。在T1期形成以普雷沃菌屬為核心的負(fù)相關(guān)網(wǎng)絡(luò),以葡萄球菌屬、副擬桿菌屬、多爾菌屬和優(yōu)桿菌屬為核心的正相關(guān)網(wǎng)絡(luò)。

6.差異菌群代謝功能富集分析:KEGG預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)無(wú)論是T0還是T1期,D組均表現(xiàn)為碳水化合物代謝相關(guān)的菌落富集,而C組則富集核酸代謝和多糖合成與代謝相關(guān)的腸道菌群(圖5)。

圖5 腸道菌群第2級(jí)水平物質(zhì)代謝功能預(yù)測(cè)分析A和B分別為T(mén)0期和T1期兩組大鼠體內(nèi)腸道菌群代謝功能預(yù)測(cè)圖

討 論

T2DM是一種慢性進(jìn)展性疾病,早期表現(xiàn)是血糖從正常逐步升高到糖尿病前期狀態(tài),再到出現(xiàn)顯性糖尿病,直至后期出現(xiàn)各種并發(fā)癥。其核心機(jī)制是胰島素抵抗伴有胰島素的分泌能力逐漸降低。飲食和腸道菌群失衡是啟動(dòng)上述過(guò)程的重要原因[6]。

嚙齒類(lèi)動(dòng)物是糖尿病領(lǐng)域最常用的模式動(dòng)物。早期研究表明,在大鼠和小鼠中,單獨(dú)使用高脂飲食或STZ均不能有效誘導(dǎo)T2DM模型,而高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ(30～45mg/kg)注射4周后T2DM成模率超過(guò)85%[4]。本研究在8周齡SD大鼠中利用高脂飲食喂養(yǎng)4周聯(lián)合35mg/kg STZ單次腹腔注射成功誘導(dǎo)出T2DM模型。該模型在高脂喂養(yǎng)4周后出現(xiàn)血糖升高但未達(dá)到糖尿病標(biāo)準(zhǔn)(T0),而STZ干預(yù)2周后(T1)大鼠表現(xiàn)為多尿、消瘦、血糖升高、胰島素水平降低、HOMA-IR升高的特征,證明本研究已經(jīng)模擬出大多數(shù)T2DM患者早期的病理生理過(guò)程。

本研究利用16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn),在T2DM發(fā)病早期,Shannon和Simpson在各組之間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而Chao1和ACE在T1期D組中下降,說(shuō)明T2DM早期雖然菌落多樣無(wú)明顯改變,但菌群的豐度下降。在相對(duì)豐度分析中,T2DM組大鼠厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)和變形菌門(mén)的相對(duì)豐度增多,擬桿菌門(mén)豐度減少(圖3)。然而,與本研究不一致的是,STZ單獨(dú)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠成模后4周和12周,糖尿病組菌落多樣性和豐度均較對(duì)照組降低,尤其是變形菌門(mén)和放線菌門(mén)豐度降低;在T2DM男性成人患者中,變形菌門(mén)豐度增加,但擬桿菌門(mén)與厚壁菌門(mén)比值升高[7,8]。類(lèi)似地,在肥胖人群中也存在腸道菌群變化趨勢(shì)完全相反的結(jié)果[9]。這種菌落豐度變化的不一致性既是年齡增加的結(jié)果,也有可能是糖尿病不同階段的特征性改變,更有可能是不同T2DM模型所帶來(lái)的差異[7]。

本研究發(fā)現(xiàn),高脂飲食喂養(yǎng)(T0)的大鼠以乳桿菌和普雷沃菌屬為核心的優(yōu)勢(shì)屬表現(xiàn)為菌落豐度下降,而以顫螺菌屬、克里斯滕森菌屬和優(yōu)桿菌屬為核心的優(yōu)勢(shì)屬表現(xiàn)為菌落豐度增加。該結(jié)果與既往高脂喂養(yǎng)的動(dòng)物模型的結(jié)論基本一致[10,11]。在STZ誘導(dǎo)T2DM的T1期,形成以普雷沃菌屬為核心的負(fù)相關(guān)網(wǎng)絡(luò),以葡萄球菌屬、副擬桿菌屬、多爾菌屬和優(yōu)桿菌屬為核心的正相關(guān)網(wǎng)絡(luò)。實(shí)際上,動(dòng)物試驗(yàn)研究證實(shí),普雷沃菌屬豐度可以顯著改善糖代謝狀況,其機(jī)制可能是增加支鏈氨基酸代謝,誘導(dǎo)腸道分泌腸促胰素,減少饑餓感等[12～14]。在T2DM患者中優(yōu)桿菌屬相對(duì)豐度下降,且與HOMA-IR呈負(fù)相關(guān),而增加優(yōu)桿菌屬的豐度可改善db/db小鼠胰島素抵抗[14～16]。

雖然腸道菌群可以通過(guò)調(diào)控短鏈脂肪酸代謝、膽汁酸代謝、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、蛋白水解產(chǎn)物等參與糖尿病的病理生理過(guò)程,但本研究發(fā)現(xiàn),減弱的核酸代謝和多糖合成與代謝相關(guān)聯(lián)同增加碳水化合物代謝也可能是T2DM的主要表現(xiàn)[14,15,17,18]。實(shí)際上,高脂飲食后腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變,導(dǎo)致其對(duì)食物中多糖的消化作用減弱,進(jìn)而減少短鏈脂肪酸的合成,參與糖尿病的發(fā)生[15,19]。此外,厚壁菌門(mén)的增加可以通過(guò)三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(ATP binding cassette transporter, ABC transporter)將碳水化合物運(yùn)送至微生物體內(nèi)以提升碳水化合物的代謝水平,進(jìn)而影響宿主的血糖平衡[19, 20]。

本研究在高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ誘導(dǎo)的T2DM大鼠模型中,發(fā)現(xiàn)T2DM發(fā)病前后存在顯著的腸道菌群結(jié)構(gòu)、豐度和代謝功能的改變,尤其是擬桿菌門(mén)普雷沃菌屬的下降和厚壁菌門(mén)優(yōu)桿菌屬的豐度升高。這提示擬桿菌門(mén)普雷沃菌屬和厚壁菌門(mén)優(yōu)桿菌屬在高脂聯(lián)合STZ誘導(dǎo)T2DM的早期病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。盡管本結(jié)論僅來(lái)源于動(dòng)物研究,缺乏大樣本量人群的數(shù)據(jù)支持,但仍為深入研究腸道菌群在T2DM中的作用提供了參考依據(jù)。