賈蕓菁，鐘 斌，李晨羽，甘玨方，廉春容，李莎莎，凌雁武

（右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000）

鋁（aluminum，Al）是一種人體內(nèi)的非必需元素，但由于它的豐富性，加上人類的廣泛使用，使得與Al 相關(guān)的毒性與人類健康特別相關(guān)。隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展及廣西鋁礦的開發(fā)規(guī)模不斷擴大，鋁礦區(qū)人群高鋁暴露的壓力不斷增大。根據(jù)流行病學(xué)資料顯示，長期接觸Al 可導(dǎo)致認知功能障礙（mild cognitive dysfunction，MCD）。輕度認知功能障礙是大腦正常老年性改變與癡呆的中間階段，被廣泛認為是阿爾茲海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）的前驅(qū)期，了解輕度認知功能障礙發(fā)病機制對于早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)AD 具有重要意義［1］。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼RNA，其廣泛分布于真核生物中。已被證明具有發(fā)育、生長、分化和神經(jīng)退行性過程的調(diào)節(jié)作用［2］，單個miRNA 分子可以調(diào)節(jié)各種基因，使miRNA 成為多因素疾?。ㄈ缒X部疾病）的潛在治療靶點。

本研究探究在Al 致大鼠認知功能障礙中miR-9-5p、RHOA 的表達。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級Wistar 大鼠48 只，雌雄各半，體重160～220 g，周齡6～8 周（購自湖南省長沙天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（湘）2022-0011）。

1.2 主要試劑

AlCl3（廣東光華化學(xué)廠有限公司）；BCA 試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；RHOA、BDNF 抗體（杭州華安生物技術(shù)有限公司）；ECL 顯影試劑盒（莫納生物科技有限公司）；PCR 引物（上海生工生物股份工程有限公司、廣州復(fù)能基因有限公司）；總RNA 提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；實時熒光定量PCR（莫納生物科技有限公司）；cDNA 合成試劑盒（莫納生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 分組與動物模型構(gòu)建 大鼠編號，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，根據(jù)隨機數(shù)表的方法將48 只大鼠分為4組，即對照組（n=12）、低劑量組（n=12）、中劑量組（n=12）、高劑量組（n=12），按照參考文獻造模方法［3，4］，用生理鹽水配置10 g/L 的AlCl3溶液，按照25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg 分別給低劑量組、中劑量組、高劑量組灌胃3 個月，建立認知障礙模型。

1.3.2 Morris 水迷宮定位航行試驗 大鼠染毒結(jié)束后，開始進行水迷宮定位航行試驗，水迷宮中加滿沒過平臺的水，水中加入墨水。正式實驗開始前一天，將每只大鼠放入水迷宮中游泳來提前適應(yīng)水中環(huán)境。正式實驗開始后，將每只大鼠分別從4 個象限沿邊緣放入水中，并開始計時，大鼠游上平臺后計時結(jié)束，游上平臺的時間即潛伏期（s）。對于沒有游上平臺的大鼠，1 min 后將其放在平臺休息20 s來形成記憶，共5 d。根據(jù)潛伏期，可檢測大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

1.3.3 HE 染色及尼氏染色 用3%戊巴比妥鈉腹腔注射來麻醉大鼠，先從心尖處灌注生理鹽水，然后滴注4%多聚甲醛固定大鼠組織，結(jié)束后立即斷頭開顱，取出腦組織，放入4%多聚甲醛固定48 h 后開始梯度脫水、包埋制作蠟塊、切片（4 μm）、鋪片、烤片、脫蠟后進行蘇木精-伊紅、尼氏染色，然后進行200 倍光鏡下觀察。

1.3.4 RT-qPCR 麻醉處死大鼠后立即斷頭，提取新鮮海馬組織，使用低溫高速研磨儀研磨后，用總RNA 試劑盒提取總RNA，使用分光光度計檢測其濃度和純度，用cDNA 合成試劑盒以總RNA 為模板合成cDNA 后，進行擴增。miR-9-5p 以U6 為內(nèi)參（U6 驗證引物購于復(fù)能基因公司，貨號RmiRQP9003），反向引物為cDNA 合成試劑盒中的Universal-qPCR-3' primer（購買于莫納生物科技有限公司，貨號MR05301S），RHOA、BDNF 以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-△△Ct分析miR-9-5p、RHOA、BDNF 表達水平。引物名稱及序列見表1。

表1 引物名稱及序列Tabl 1 Primer names and sequences

1.3.5 Western blot 大鼠處死后，剪開右心耳，心尖灌注生理鹽水至右心耳處流出生理鹽水，斷頭并取出新鮮腦組織，隨即進行冰上操作剝離出新鮮海馬組織，可放入-80 ℃冰箱保存，實驗開始前，將組織勻漿裂解來提取總蛋白，根據(jù)BCA 試劑盒的操作說明書，測定每組蛋白樣品濃度后，加入上樣緩沖液和PBS 使蛋白樣品達到同一濃度，然后加入沸水中煮沸10 min 后變性，樣品制作完畢。按照每孔40 g蛋白樣品經(jīng)過10% SDS-PAGE 進行電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)到PVDF 膜進行封閉（5%脫脂奶粉）2 h，用TBST 洗膜3 次，4 ℃孵育一抗，一抗過夜后TBST洗膜5 次，二抗孵育1 h，TBST 洗膜5 次，滴加ECL溶液發(fā)光以進行成像，利用Image J 軟件對條帶進行分析灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS26.0 軟件進行統(tǒng)計分析，所有實驗結(jié)果表示為（±s），組間數(shù)據(jù)比較采用單因素單因素ANOVA 檢驗，檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Morris Water Maze 定位航行實驗潛伏期比較

低、中、高3 個劑量組分別給予AlCl3水溶液灌胃（25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg），空白對照組給予生理鹽水灌胃。

實驗記錄了定位航行實驗訓(xùn)練第1、3、5 天的潛伏時間，染毒組的找到平臺時間明顯大于對照組。其中，訓(xùn)練第1 天與空白對照組相比，低、中劑量組不具有統(tǒng)計學(xué)意義，高劑量組具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；訓(xùn)練第3 天，與空白對照組相比，低劑量組的結(jié)果不具有統(tǒng)計學(xué)意義，中、高劑量組具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；訓(xùn)練第5 天，與空白對照組相比，低劑量組不具有統(tǒng)計學(xué)意義，中、高劑量組具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 4 組大鼠 Morris Water Maze 定位航行實驗訓(xùn)練后的潛伏時間比較（s，±s）Tab 2 Comparison of latency after training in the Morris Water Maze positioning navigation experiment in four groups （s，±s）

表2 4 組大鼠 Morris Water Maze 定位航行實驗訓(xùn)練后的潛伏時間比較（s，±s）Tab 2 Comparison of latency after training in the Morris Water Maze positioning navigation experiment in four groups （s，±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別潛伏期(s)劑量（mg/kg）-25 50 100第3 天32.38±17.27 35.04±10.74 44.00±3.94*48.12±9.74*第5 天23.90±10.39 34.41±14.35 41.30±7.18*45.90±14.07*對照組低劑量組中劑量組高劑量組第1 天44.80±6.42 49.07±5.10 50.58±8.97 52.46±8.46*

2.2 對照組與劑量組海馬切片HE 染色實驗結(jié)果對比

HE 染色結(jié)果顯示，對照組大鼠神經(jīng)細胞無水腫，排列有序，結(jié)構(gòu)正常，核仁清晰可見，有豐富的胞質(zhì)，且染色清晰，胞膜邊緣銳利清楚，無明顯病理改變。

染毒組隨著增加染毒劑量，神經(jīng)細胞開始出現(xiàn)損傷，低劑量組、中劑量組、高劑量組開始出現(xiàn)不同程度的，神經(jīng)細胞排列紊亂，胞核固縮，破裂，溶解，核質(zhì)深染，胞膜邊緣模糊不清，出現(xiàn)若干病理性改變，神經(jīng)細胞損傷加重。與對照組相比，高劑量組變化最為明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織HE 染色比較（×200）Fig 1 Comparison of HE staining of hippocampal tissues in rat groups （×200）

2.3 對照組與劑量組海馬切片尼氏染色實驗結(jié)果對比

尼氏染色結(jié)果顯示，對照組海馬神經(jīng)元排列緊密，染色清晰，胞漿內(nèi)的Nissl 體顆粒染色清晰，細胞形態(tài)正常。隨著染毒劑量的增加，可見染毒組的細胞排列紊亂，胞內(nèi)的Nissl 體顆粒消散減少，細胞形態(tài)不一的情況。見圖2。

圖2 各組大鼠海馬組織尼氏染色比較（×200）Fig 2 Comparison of Nymphali staining of hippocampal tissue in rat groups（×200）

2.4 對照組與劑量組大鼠海馬組織miR-9-5p、RHOA、BDNF mRNA 表達比較

與對照組相比，低、中、高劑量組miR-9-5p 的表達均明顯下降，其中低劑量組無統(tǒng)計學(xué)意義中、高劑量組具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.001）；與對照組相比，RHOA 的表達均明顯上升，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.001）；與對照組相比，BDNF 的表達均明顯下降，其中低劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，中、高劑量組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3，表3。

圖3 各組大鼠miR-9-5p、RHOA、BDNF mRNA 表達比較Fig 3 Comparison of miR-9-5p，RHOA and BDNF mRNA expression in rat groups

表3 各組大鼠RT-qPCR 結(jié)果P 值Tab 3 P values of RT-qPCR results in each group

2.5 對照組與劑量組大鼠海馬組織RHOA、BDNF蛋白表達比較

與對照組比較，染毒組的RHOA 蛋白表達量均有所提高，其中中劑量組和高劑量組的相對表達量與對照組的統(tǒng)計學(xué)差異P＜0.05；染毒組的BDNF蛋白表達量均有所下降，其中中、高劑量組與對照組統(tǒng)計學(xué)差異P＜0.05。見表4，圖4。

圖4 各組大鼠海馬組織RHOA、BDNF蛋白的相對表達情況Fig 4 Relative expression of RHOA and BDNF proteins in rat hippocampal tissues of each group

表4 各組大鼠海馬組織RHOA、BDNF 蛋白相對表達量的比較Tab 4 Comparison of relative expression of RHOA and BDNF proteins in rat hippocampal tissues

3 討論

Al 是地殼中延伸最廣泛的金屬之一。它的豐富性，加上人類的廣泛使用，使得與Al 相關(guān)的毒性與人類健康特別相關(guān)。Al 已被反復(fù)證明具有神經(jīng)毒性，加速腦衰老，進而導(dǎo)致腦部疾病，最開始的表現(xiàn)為認知功能障礙，進而可能會發(fā)展為AD、帕金森病等。Al 所致認知障礙的相關(guān)研究在眾多學(xué)者的努力下雖然已取得初步勝利，但其機制尚未完全明確。

AD 是目前最常見的癡呆病，其特點是記憶力和智力下降、行為怪異、喜怒無常等，最終導(dǎo)致患者失去自理能力，在全球范圍內(nèi)估計癡呆病人的占60%～70%，情況不容樂觀［5］。根據(jù)目前的研究發(fā)現(xiàn)，AD 的主要發(fā)病機制為淀粉樣蛋白和早老素蛋白這兩類基因的突變加速導(dǎo)致了β 淀粉樣多肽轉(zhuǎn)化為神經(jīng)斑塊的過程，其主要病理特征表現(xiàn)為形成淀粉樣蛋白β 肽的神經(jīng)質(zhì)斑塊和過度磷酸化tau 組成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)［6，7］。輕度認知障礙發(fā)生在從正常認知到癡呆的過程中，老年人認知能力隨著年齡增長可分為4 個階段：具有正常認知能力、主觀認知功能障礙、輕度認知功能障礙，最后發(fā)展為癡呆［8］。由此可見，AD 是一種表現(xiàn)為進行性認知障礙的癡呆癥。本研究中，通過水迷宮行為學(xué)實驗、HE 染色和尼氏染色證明3 個Al 染毒組均存在不同程度的學(xué)習(xí)記憶障礙，以及海馬區(qū)神經(jīng)元均受到了不同程度的損傷。證實了本實驗認知障礙模型建立成功。

miRNA 作為非編碼RNA，可以調(diào)節(jié)多種靶基因，使miRNA 成為多種腦疾病的潛在治療靶點。研究表明，miRNA 參與了多種與AD 發(fā)病機制相關(guān)的信號通路，包括β-淀粉樣蛋白產(chǎn)生和清除、神經(jīng)炎癥和神經(jīng)發(fā)生的信號通路。而認知功能障礙又會進一步發(fā)展為AD，所以研究miRNA 與認知功能障礙的機制尤為重要。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-9-5p 與多種認知障礙相關(guān)神經(jīng)退行性疾病相關(guān)，如AD［9］、帕金森?。?0］。已有研究表明miR-9-5p 在AD 小鼠的早期下調(diào)［9］。并且在本課題組前期研究中，通過第二代高通量測序技術(shù)分析高鋁認知障礙人群血清外泌體miRNAs 表達譜，使用Cytoscape 軟件構(gòu)建了miRNAs 與鋁致認知障礙中MAPK 信號通路信相關(guān)靶基因之間的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖，并篩選出了has-miR-9-5p 通過下調(diào)控制RHOA 在高血鋁認知障礙患者的血清外泌體表達［11］。本實驗為了驗證該結(jié)果，故創(chuàng)建了鋁致認知障礙大鼠與正常大鼠做對比，來驗證這一結(jié)論。

RHOA 及其許多下游蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)參與多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。有證據(jù)表明異常的RHOA 信號在AD、亨廷頓病和帕金森病等神經(jīng)退行性疾病中的作用［12］。RHOA 的激活可能會導(dǎo)致神經(jīng)元的生長發(fā)育、抑制軸突再生功能等活動［13-15］。研究發(fā)現(xiàn)，在APP/PS1 轉(zhuǎn)基因和原纖維Aβ 注射小鼠模型中，反應(yīng)性小膠質(zhì)細胞的RHOA 表達增加［16］。還有研究發(fā)現(xiàn)，非甾體［17，18］、他汀類藥物［19］可通過抑制RHOA 相關(guān)信號通路，來減少Aβ 的生成，這表明抑制RHOA 表達，可為AD 治療提供參考依據(jù)。這與本次實驗中RHOA 的RT-qPCR 和Western Blot 結(jié)果一致。

BDNF 是哺乳動物大腦中分布最廣、研究最廣泛的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一，在將突觸活動轉(zhuǎn)化為長期突觸記憶方面至關(guān)重要。據(jù)報道，BDNF 信號傳導(dǎo)的缺陷有助于幾種主要疾病的發(fā)病機制，例如亨廷頓病，AD，抑郁癥，精神分裂癥，雙相情感障礙和焦慮癥［20］。因此，BDNF 的表達直接影響腦的認知水平。本實驗中Al 染毒組的BDNF 與對照組相比均有不同水平的下調(diào)。

本實驗中，給實驗組大鼠灌胃AlCl3來建立實驗?zāi)Ｐ?，然后通過水迷宮行為學(xué)實驗，檢測出低劑量組、中劑量組、高劑量組的大鼠均有不同程度的學(xué)習(xí)記憶能力下降。表明Al 致認知障礙模型建立成功。隨后，本研究通過病理學(xué)技術(shù)直觀地發(fā)現(xiàn)，3 個染毒組的海馬區(qū)神經(jīng)元受到損傷。接下來，通過分子生物學(xué)實驗將本課題組前期在人群數(shù)據(jù)篩選中得出的結(jié)論驗證到動物模型上，結(jié)果表明，低劑量組、中劑量組、高劑量組的miR-9-5p 均下調(diào)，RHOA表達水平均上調(diào)。因此，筆者猜測在鋁致大鼠認知障礙的機制可能與miR-9-5p 下調(diào)導(dǎo)致RHOA 上調(diào)有關(guān)。關(guān)于miR-9-5p 靶向調(diào)控RHOA 還需要實驗進一步證明。

作者貢獻度說明：

賈蕓菁：實驗設(shè)計與實操，數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計分析，論文撰寫修改；李晨羽：實驗操作助手；凌雁武、鐘斌、甘玨方、廉春容、李莎莎：研究指導(dǎo)，論文修改，經(jīng)費支持。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。