鮑 波，柴星星，鄧子亮，劉露露，朱少平，李莉莉，4

（1.廣東醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，廣東 湛江 524023；2.廣東醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，廣東 東莞 523808；3.廣東醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，廣東 東莞 523808；4.東莞市生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)實驗動物資源開發(fā)與應(yīng)用研究重點實驗室，廣東東莞 523808）

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是繼阿爾茲海默病之后的第二大中老年神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病［1］，全球患者超過600 萬人［2］。相關(guān)研究表明PD已經(jīng)成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病中增長速度最快的一種［3］，已有研究表明，多種因素的共同作用可能導(dǎo)致PD的發(fā)生［4］，年齡、遺傳因素、環(huán)境因素等是導(dǎo)致PD 發(fā)病的關(guān)鍵性因素。近年多方面研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）在PD 的發(fā)病過程中起到重要作用［5-9］。Stefani 等［10］的研究發(fā)現(xiàn)ERS 初期旨在恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，若應(yīng)激過度可以觸發(fā)促凋亡信號，促進神經(jīng)元細(xì)胞死亡。目前PD的治療以控制癥狀為主［11］，無法從根本上阻止疾病的病理進展［12］，并且隨著治療期的延長會出現(xiàn)療效減退、不良反應(yīng)的情況［13］。隨著對PD 發(fā)病機制的日益了解，提出了潛在的神經(jīng)保護策略假說，若在早期采用神經(jīng)保護或疾病改善療法，可能有利于改變疾病的進展［14］。綜上，本研究預(yù)測早期干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對PD 的預(yù)防和治療具有重要意義。

番茄紅素（lycopene）是一種具有藥理活性的類胡蘿卜素，具有抗癌、抗氧化、保護心臟和降壓等藥理作用［15，16］。近年越來越多的研究報道番茄紅素具有神經(jīng)保護作用［17-19］。已有研究表明番茄紅素的神經(jīng)保護作用機制主要涉及抗氧化、抑制炎癥反應(yīng)、抑制凋亡和恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)等方面［20］，這提示番茄紅素的神經(jīng)保護作用可能與ERS 有相關(guān)性，而目前少有相關(guān)研究報道。因此，本研究基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激探討番茄紅素對帕金森病細(xì)胞模型的預(yù)防效果，旨在為PD 的防治提供有價值的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青/鏈霉素（100×）（美國GIBCO 公司）；Dimethyl sulfoxide （細(xì)胞凍存級）、魚藤酮（批號：R8875，純度≥95%，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司）；番茄紅素（純度≥98%，西安飛達生物技術(shù)有限公司）；CCK-8 檢測試劑（日本同仁）；RIPA 裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、DAPI、超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司）；β-Actin 單克隆抗體、CHOP 單克隆抗體（批號：3700、2895，美國CST 公司）；GRP78 單克隆抗體（批號：ARG54026，arigo 公司）；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）、辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（H+L）（批號：ZB-5301、ZB-5305，中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；山羊抗兔IgG （H+L），DyLightTM488、山羊抗鼠IgG（H+L），DyLightTM633（批號：35552、35512，美國Pierce 公司）。人神經(jīng)母瘤細(xì)胞（SH-SY5Y）來自本課題組。魚藤酮和番茄紅素溶于DMSO 中配成母液，使用時用無血清的DMEM 培養(yǎng)基稀釋至工作濃度。

1.2 方法

1.2.1 SH-SY5Y 細(xì)胞的培養(yǎng) 復(fù)蘇凍存的SH-SY5Y 細(xì)胞，用含10%的胎牛血清、1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基，置于5% CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。及時更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞匯合度至80%～90%，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。采用處在對數(shù)生長期的細(xì)胞進行實驗。

1.2.2 細(xì)胞分組及處理方法 對照組細(xì)胞加入不含藥物的培養(yǎng)液，番茄紅素組細(xì)胞加入20 μmol/L番茄紅素作用2 h 后更換正常的培養(yǎng)液，魚藤酮組細(xì)胞加入含0.5 μmol/L 魚藤酮的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，不同濃度的番茄紅素（低、中、高）預(yù)處理組的處理方法是分別用含5、10、20 μmol/L 番茄紅素處理作用2 h 后更換0.5 μmol/L 魚藤酮繼續(xù)作用24 h。

1.2.3 番茄紅素對SH-SY5Y 細(xì)胞活力的影響 將細(xì)胞按5×104個/ mL 密度接種于96 孔板，每孔的接種量為100 μL，同時設(shè)3 個復(fù)孔。待細(xì)胞完全貼壁后，將20 mmol/L 番茄紅素稀釋至20 μmol/L，隨后以2 為稀釋倍數(shù)進行7 個梯度稀釋，將各濃度的番茄紅素作用于SH-SY5Y 細(xì)胞，同時設(shè)立細(xì)胞中只加含培養(yǎng)液的對照組和無細(xì)胞空白對照組。番茄紅素處理結(jié)束后，吸走原來的培養(yǎng)液，向各孔中加入含10 μL CCK-8 試劑的新培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育，注意觀察各孔顏色變化。在酶標(biāo)儀波長為450 nm 下測定各孔OD 值。計算細(xì)胞相對活力：細(xì)胞相對活力=（實驗組OD 均值-空白組OD均值/（對照組OD 均值-空白組OD 均值×100%

1.2.4 番茄紅素預(yù)處理對魚藤酮損傷的SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響 將細(xì)胞按5×104個/ mL 密度接種于96 孔板，每孔100 μL 細(xì)胞懸液，同時設(shè)3 個復(fù)孔。待細(xì)胞完全貼壁后，按照實驗分組進行。細(xì)胞處理結(jié)束后吸走原來的培養(yǎng)液，向各孔中加入10 μL 的CCK-8 試劑，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育，注意觀察各孔顏色變化。在酶標(biāo)儀波長為450 nm 下測定各孔OD 值。計算細(xì)胞相對活力方法同上。

1.2.5 Hoechst 染色觀察細(xì)胞凋亡 將SH-SY5Y細(xì)胞按1×105個/mL 的密度接種在24 孔板中，每孔總體積500 μL。觀察細(xì)胞完全貼壁后，根據(jù)實驗設(shè)計對各孔細(xì)胞分別加藥處理。藥物處理結(jié)束后，棄去舊的培養(yǎng)液，PBS 洗細(xì)胞2 次。加入適量的4%多聚甲醛，室溫固定細(xì)胞15 min。棄去固定液，加入PBS，放在低速搖床上洗2 次，每次5 min，盡可能吸盡殘余液。將Hoechst 33 258 染色液稀釋成5 μg/mL，每孔加入適量，室溫避光染色10 min。棄去染色液，加入PBS，放在低速搖床上洗3 次，每次5 min。熒光顯微鏡下在激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm 觀察和拍照。

1.2.6 免疫印跡法檢測目的蛋白的表達 細(xì)胞經(jīng)藥物處理結(jié)束后，棄去舊的培養(yǎng)液，預(yù)冷的PBS 洗細(xì)胞2 遍，吸盡PBS，加入含終濃度為1 mmol/L PMSF 的RIPA 裂解液冰浴裂解細(xì)胞半個小時，于4 ℃離心機，14 000 r/min 離心15 min，收集上清液，采用BCA 試劑盒測定細(xì)胞蛋白的濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后進行免疫反應(yīng)β-actin（1∶1 000）、GRP78（1∶1 000）和CHOP（1∶1 000）4 ℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體或者山羊抗鼠抗體（稀釋比例為1∶1 000），室溫孵育2 h。ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒進行曝光檢測，采用圖像分析軟件ImageJ 分析條帶的灰度值。

1.2.7 細(xì)胞免疫熒光 將SH-SY5Y 細(xì)胞以5×104個/mL 的密度接種在激光共聚焦專用培養(yǎng)皿中，每皿1 mL 細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后，根據(jù)實驗設(shè)計進行加藥處理。藥物處理結(jié)束后，棄去舊的培養(yǎng)液，加入PBS 洗細(xì)胞2 次，盡可能吸盡PBS。每皿加入適量冷丙酮和甲醇等體積混合液，室溫固定通透處理細(xì)胞20 min。棄去丙酮和甲醇混合液，PBS 洗細(xì)胞3 次，每次5 min。每皿加入適量5% 的BSA（PBS 配制），室溫封閉30 min。加一抗GRP78（1∶100），CHOP（1∶70），4 ℃過夜?；厥找豢?，PBS 洗3次，每次5 min。加入熒光標(biāo)記的二抗（1% BSA 配制）：兔抗（1∶300）或鼠抗（1∶300），室溫孵育1 h。PBS 洗3 次，每次5 min，每皿加入適量1 μg/mL 的DAPI（1%BSA 配制）染核10 min。PBS 洗3 次，每次5 min。每皿加入少量PBS，盡早在激光共聚焦工作站觀察并拍照。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)處理 用GraphPad Prism5.0 軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用（±s）表示，兩組之間比較t檢驗，多組樣本比較采用方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 番茄紅素對SH-SY5Y 細(xì)胞生長活力的影響

為了更好地研究番茄紅素在魚藤酮損傷的SH-SY5Y 細(xì)胞中的作用，首先檢測番茄紅素對SH-SY5Y 細(xì)胞活力的影響。結(jié)果如圖1 所示，對照組相比，各濃度的番茄紅素作用SH-SY5Y 細(xì)胞24 h，細(xì)胞活力未發(fā)生明顯改變（P＞0.05），表明 0～20 μmol/L 濃度范圍內(nèi)，番茄紅素處理SH-SY5Y 細(xì)胞24 h，細(xì)胞的生長活力不受影響，因此可將番茄紅素用于下一步的研究。

圖1 不同濃度的番茄紅素對細(xì)胞活力的影響（n=3，±s）Fig 1 Effects of different concentrations of lycopene on cell viability（n=3，±s）

2.2 番茄紅素預(yù)處理對魚藤酮損傷的SH-SY5Y細(xì)胞的影響

確認(rèn)番茄紅素的安全作用濃度范圍后，進一步研究番茄紅素預(yù)處理對魚藤酮損傷SH-SY5Y 細(xì)胞的干預(yù)作用，結(jié)果如圖2 所示，和對照組相比，魚藤酮組的細(xì)胞活力明顯下降（P＜0.01）；不同濃度的番茄紅素預(yù)處理均可提高細(xì)胞活力（分別為（74.74±0.47）%、（81.70±1.90 ）%和（83.17±1.37）%），與魚藤酮組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。顯微觀察細(xì)胞形態(tài)變化（圖3），番茄紅素單獨處理組的細(xì)胞和對照組的細(xì)胞一樣生長旺盛，形態(tài)好，可見細(xì)胞突起；魚藤酮單獨處理組細(xì)胞生長受到抑制：細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞邊界模糊、突起減少，部分細(xì)胞縮小變圓；而番茄紅素預(yù)處理組與魚藤酮單獨處理組在細(xì)胞形態(tài)變化上無明顯差異，表明番茄紅素預(yù)處理在改善細(xì)胞形態(tài)上的作用并不明顯。

圖2 番茄紅素預(yù)處理對魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞活力的影響（n=3，±s）Fig 2 Effects of lycopene pretreatment on rotenone-induced SH-SY5Y cell viability（n=3，±s）

圖3 番茄紅素預(yù)處理對魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞形態(tài)的影響（100×）Fig 3 Effects of lycopene pretreatment on rotenone-induced SH-SY5Y cell morphology （100×）

2.3 番茄紅素預(yù)處理對魚藤酮損傷的SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡情況的影響

為了進一步明確番茄紅素預(yù)處理后對SH-SY5Y 細(xì)胞的影響，采用Hoechst 染色后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果如圖4，對照組和番茄紅素單獨處理組的細(xì)胞呈正常染色，熒光均勻；魚藤酮組的細(xì)胞出現(xiàn)較多的致密濃染，熒光變亮，顏色發(fā)白，表明細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)高度凝聚，邊緣化，即將裂解為碎塊狀的凋亡小體；與魚藤酮組相比，番茄紅素預(yù)處理組細(xì)胞出現(xiàn)致密濃染的情況減少。

圖4 Hoechst 染色檢測細(xì)胞凋亡（200×）Fig 4 Cell apoptosis was detected by Hoechst staining （200×）

2.4 番茄紅素預(yù)處理對魚藤酮誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

研究結(jié)果如圖5A、B，與對照組的GRP78（0.50±0.17）相比，魚藤酮組的GRP78（1.13±0.16）表達明顯升高（P＜0.01）。5 μmol/L 的番茄紅素預(yù)處理組GRP78 的表達量（1.25±0.23）有所升高，但與魚藤酮組相比無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；10 μmol/L 的番茄紅素預(yù)處理組GRP78 的表達量（1.02±0.23）有所下降，但與魚藤酮組相比無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；20 μmol/L 的番茄紅素預(yù)處理組GRP78的表達量（0.58±0.15）明顯降低，與魚藤酮單獨處理組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果如圖5E，GRP78 在胞漿中表達，各實驗組GRP78 的表達情況與Western blot 結(jié)果相符。

研究發(fā)現(xiàn)魚藤酮組CHOP 的表達量（1.33±0.04）明顯比對照組（0.53±0.03）增多（P＜0.01），如圖5C、D 所示；而低濃度、中濃度、高濃度番茄紅素預(yù)處理組CHOP 的表達量分別為（1.10±0.02）、（0.98±0.08）、（0.86±0.03），比魚藤酮組降低（P＜0.01）。細(xì)胞免疫熒光的結(jié)果如圖5F，CHOP 主要定位于細(xì)胞核中，魚藤酮處理會增強CHOP 的熒光信號，番茄紅素預(yù)處理則使CHOP 的熒光信號減弱。

3 討論

番茄紅素因其極強的抗氧化能力而受到關(guān)注，被廣泛應(yīng)用于疾病的抗氧化應(yīng)激研究中。Liu 等［21］研究發(fā)現(xiàn)番茄紅素可以提高魚藤酮誘導(dǎo)的PD 模型小鼠抗氧化應(yīng)激的能力，改善小鼠的認(rèn)知以及運動功能障礙。此外也有研究表明番茄紅素通過抑制氧化應(yīng)激激活的AMPK/mTOR 通路，保護缺糖缺氧誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞免受自噬性死亡［22］。以上研究均表明番茄紅素具有神經(jīng)保護作用，但其機制并未完全明確。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核生物許多重要的蛋白質(zhì)合成、加工、轉(zhuǎn)運的重要場所。在PD 病人的樣本中檢測到了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［23］。研究發(fā)現(xiàn)魚藤酮可以引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應(yīng)激［24-26］，Chen 等［24］報道了活性氧并不參與魚藤酮誘導(dǎo)的SK-N-MC 細(xì)胞的早期死亡，可能ERS 在其中發(fā)揮更大的作用。因此本研究基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激探討番茄紅素預(yù)處理對魚藤酮所致PD 細(xì)胞模型的影響及其機制。結(jié)果顯示低濃度番茄紅素預(yù)處理可提高細(xì)胞活力，與魚藤酮組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；中濃度、高濃度番茄紅素預(yù)處理可以顯著提高細(xì)胞的活力（P＜0.01）。此外番茄紅素預(yù)處理組細(xì)胞凋亡減少，表明番茄紅素預(yù)處理可以提高SH-SY5Y 細(xì)胞應(yīng)對魚藤酮損傷的能力，對細(xì)胞有保護作用。該結(jié)果同Li 等［22］以及Feng 等［27］的研究結(jié)果充分說明了番茄紅素對受損的SH-SY5Y 細(xì)胞有保護作用。

為了探究番茄紅素預(yù)處理對魚藤酮損傷的SH-SY5Y 細(xì)胞發(fā)揮保護作用的可能機制，研究了細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的情況。GRP78 是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一種蛋白分子，其表達上調(diào)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應(yīng)激的一種標(biāo)志［28］。在本研究中，魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞，GRP78 的表達量明顯上調(diào)（P＜0.01），說明在魚藤酮誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞發(fā)生了內(nèi)質(zhì)應(yīng)激。低濃度番茄紅素預(yù)處理組GRP78 的表達量有所升高，但與魚藤酮組相比無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；中濃度番茄紅素預(yù)處理組GRP78 的表達量有所下降，但與魚藤酮組相比無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），高濃度番茄紅素預(yù)處理組GRP78 的表達量下降明顯，與魚藤酮單獨處理組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）?？紤]到早期的ERS 可能對神經(jīng)細(xì)胞具有保護作用，為了解魚藤酮誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的程度，同時檢測了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的另一代表指標(biāo)CHOP，也稱GADD153，為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的一種促凋亡的分子［29］。本研究中，魚藤酮損傷的SH-SY5Y 細(xì)胞表達CHOP 的量明顯增多（P＜0.01），這表明魚藤酮誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞發(fā)生了過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，使細(xì)胞發(fā)生了ERS 引起的凋亡。番茄紅素預(yù)處理組CHOP 表達下調(diào)，提示番茄紅素預(yù)處理使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激得到緩解，從而避免了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。因此本研究發(fā)現(xiàn)番茄紅素可以在一定程度上緩解魚藤酮引起的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而避免了細(xì)胞走向凋亡。

綜上所述，番茄紅素預(yù)處理可以明顯提高細(xì)胞活力、降低魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，說明番茄紅素預(yù)處理可以提高SH-SY5Y 細(xì)胞應(yīng)對魚藤酮損傷的能力，對細(xì)胞有保護作用。番茄紅素預(yù)處理下調(diào)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指示蛋白GRP78 的表達，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡蛋白CHOP 的表達，說明番茄紅素可以通過緩解PD 細(xì)胞模型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，避免細(xì)胞因內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過度導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，實現(xiàn)對細(xì)胞的保護作用，但其作用的詳細(xì)機制有待進一步的研究。

作者貢獻度說明：

鮑波、柴星星、李莉莉：參與實驗設(shè)計，鮑波、柴星星、鄧子亮、劉露露、朱少平、李莉莉：實驗實施，鮑波、鄧子亮、李莉莉：文章撰寫。

所有作者聲明無任何利益沖突。