牛田琦，劉彩霞，熊 軍，賈 浩，王 華，李 霜，鄧慧鳴，曾祥周

（海南醫(yī)學(xué)院，海南 ?？?571199）

破骨細(xì)胞（osteoclasts，OCs）是來自單核-巨噬細(xì)胞譜系的多核骨吸收細(xì)胞［1］，破骨細(xì)胞作為人體內(nèi)唯一負(fù)責(zé)骨吸收的細(xì)胞類型，對(duì)正常骨骼發(fā)育和體內(nèi)骨平衡至關(guān)重要，過度激活會(huì)導(dǎo)致骨內(nèi)環(huán)境平衡失調(diào)［2］，進(jìn)而導(dǎo)致多種溶骨性骨疾病，如骨質(zhì)疏松癥、骨佩吉特病和侵蝕性關(guān)節(jié)炎［3］。因此，破骨細(xì)胞已成為預(yù)防和治療骨溶解疾病的重要靶點(diǎn)。microRNA 是一類高度保守的單鏈小分子非編碼RNA，在真核生物中可調(diào)節(jié)超過30% 的基因［4］。miRNA 可特異性結(jié)合靶標(biāo)的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR），通過干擾mRNA 的穩(wěn)定性和/或阻斷蛋白翻譯抑制mRNA 的表達(dá)［5］。大量研究表明，miRNA通過調(diào)控上述多種因子和激素影響各信號(hào)通路，導(dǎo)致OCs 分化和功能改變［6-8］。miR-483 是Landgraf等［9］于2007 年報(bào)道的在人胎肝中發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，經(jīng)酶切后形成miR-483-5p 和miR-483-3p。關(guān)于miR-483-5p 的大多數(shù)文獻(xiàn)與腫瘤有關(guān)。但是，目前關(guān)于miR-483-5p 通過Timp2調(diào)控OCs 生成及其機(jī)制未見報(bào)道。前期研究通過生物信息軟件發(fā)現(xiàn)了miR-483-5p 的靶基因Timp2，并對(duì)比了二者部分基因序列，發(fā)現(xiàn)有互補(bǔ)序列，進(jìn)而通過體外熒光素酶分析驗(yàn)證靶點(diǎn)，并利用RANKL 誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞向OCs 分化體系進(jìn)行靶向驗(yàn)證，明確miR-483-5p 靶向于Timp2影響OCs 分化及活性的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

RAW264.7 小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞和人胚腎293T 細(xì)胞均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

主要試劑和儀器：GP-transfect-Mate 轉(zhuǎn)染試劑來自蘇州吉瑪基因有限公司；熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒來自安諾倫北京生物科技有限公司；Lipo 2000 轉(zhuǎn)染試劑來自美國賽默飛公司；白細(xì)胞酸性磷酸酶（TRAP）試劑盒來自美國Sigma 公司；蛋白提取試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒均來自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script TM RT Master Mix （Perfect Real Time）、熒光定量檢測(cè)試劑盒TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）均來自日本TaKaRa 公司；TRIzol 試劑來自美國Invitrogen 公司；胎牛血清（FBS）、DMEM 培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素均來自美國Gibco 公司；多功能酶標(biāo)儀（型號(hào)：Synergy HTX）來自美國Biotek 公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（型號(hào)：Roche LightCycler480Ⅱ）來自德國羅氏診斷公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息軟件預(yù)測(cè) 用TargetScan8.0 數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站https：//www.targetscan.org/vert_80/預(yù)測(cè)可能與miR-483-5p 靶向的靶基因，對(duì)所預(yù)測(cè)靶基因和miR-483-5p 的基因序列進(jìn)行對(duì)比，尋找是否有互補(bǔ)序列。

1.2.2 雙熒光素酶活性檢測(cè) 構(gòu)建Timp2野生型和突變型3'-UTR 質(zhì)粒來自于蘇州吉瑪基因股份有限公司。轉(zhuǎn)染：293T 細(xì)胞按5×105細(xì)胞/孔的濃度接種12 孔板，各組分別設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，用含10%FBS、100 U/mL 青霉素G 和100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞完全貼壁。轉(zhuǎn)染分組為：mimic NC +Timp2野生、miR483 mimic+Timp2野生、mimic NC+Timp2-miR483-突變、miR483 mimic+Timp2-miR483 突變。參照GP-transfect-Mate 說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在培養(yǎng)箱中溫育5 h 后棄掉舊轉(zhuǎn)染液，加入500 μL 含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液。37 ℃ 5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)48 h。雙熒光素酶系統(tǒng)檢測(cè)：棄掉12 孔板中的培養(yǎng)液，用500 μL PBS 洗滌細(xì)胞兩次，將1×PLB 300 μL 加入到培養(yǎng)孔中，在室溫輕緩晃動(dòng)培養(yǎng)板15 min，把裂解液轉(zhuǎn)移到檢測(cè)試板中，每孔100 μL。用Synergy HTX 酶標(biāo)儀雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)分別檢測(cè)螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，選擇1～2 s 延遲，5～10 讀數(shù)。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將miR-483-5p mimic、miR-483-5p inhibitor 和Timp2siRNA 分別轉(zhuǎn)染入RAW264.7細(xì)胞中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染方法：取RAW264.7 細(xì)胞按5×104/孔密度鋪板于24 孔板，用含10% FBS、100 U/mL 青霉素G 和100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基500 μL/孔培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞完全貼壁。參照Lipo 2000 說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h 后，棄掉板中的舊轉(zhuǎn)染液，加入含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基500 μL/孔，除Blank組外，其余各組加入終濃度為100 ng/mL 的RANKL，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 首先將來自于蘇州吉瑪基因公司構(gòu)建的慢病毒Timp2-LV 根據(jù)說明書感染入RAW264.7 細(xì)胞，待細(xì)胞在6 孔板中培養(yǎng)至90%以上，消化后重新以5×104/孔密度鋪板于24 孔板，進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)染miR-483-5p mimic 實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 Western blot 檢測(cè) RAW264.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)2 d 后用含PMSF 的RIPA 緩沖液從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取全細(xì)胞蛋白。全細(xì)胞蛋白濃度用BCA 蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定。等量的全細(xì)胞提取物通過10% SDS-PAGE 和電泳分離，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶在TBST 中阻斷1 h 后，用Timp2和β-actin 一抗在4 ℃下孵育過夜，然后用HRP 耦聯(lián)二抗孵育1 h，最后用蛋白顯影儀用ECL試劑檢測(cè)條帶。用ImageJ 軟件對(duì)western blotting得到的信號(hào)進(jìn)行量化。用β-actin 進(jìn)行歸一化。

1.2.6 TRAP 染色 RAW264.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)4 d 后行TRAP 染色，具體實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。在倒置顯微鏡下觀察拍照，視野中觀察到的紫紅色部分為OCs 的胞漿，胞漿中藍(lán)染部分為OCs 的胞核，并按TRAP 染色陽性且細(xì)胞核數(shù)大于3 個(gè)的為破骨細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.7 RT-PCR 檢測(cè) RAW264.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)2 d 后用TRIzol 試劑從培養(yǎng)的RAW264.7 細(xì)胞中分離總RNA。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script TM RT Master Mix（Perfect Real Time）將500 ng 總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實(shí)時(shí)PCR 根據(jù)TB Green?Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，用Roche LightCycler480實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增參數(shù)如下：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃20 s，共40 個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)小鼠引物序列如下：TRAP 上游引物：5'-GTGGAAGCCTCTGGAAAATC-3'，下游引物：5'-CTCCTCCCTCACACCCGTTA - 3'；NFATc1 上游引物：5'-CCGTTGCTTCCAGAAAATAACA-3'，下游引物：5'-TGTGGGATGTGAAACTCG GAA - 3'；Cathepsin K 上游引物：5' - CTTCCAATACGTGCAGCAGA-3'，下 游 引 物 ：5'-TCTTCAGG GCTTTCTCGTTC-3'；MMP-9上游引物：5'-CAAAGACCTGAAAACCTCCAA-3'；下游引物：5'-GGTACAAGTATGCCTCTGCCA-3'；β-actin 上游引物：5'-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3'；下游引物：5'-TGATGTCACGCACGATTT-3'。采用2-ΔΔCT法評(píng)估相關(guān)基因表達(dá)，所有值用β-actin 歸一化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS26.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料間的分析采用單因素方差分析和LSD 事后檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)意義分析。P＜0.05 判斷差異為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 靶基因預(yù)測(cè)

通過Target Scan 8.0 軟件預(yù)測(cè)mmu-miR-483-5p 的靶基因，并通過接下來的熒光素酶報(bào)告基因發(fā)現(xiàn)Timp2可能是miR-483-5p 影響OCs 分化的靶點(diǎn)，并對(duì)Timp2進(jìn)行接下來的驗(yàn)證。

2.2 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)驗(yàn)證Timp2 是否為mmu-miR-483-5p 靶點(diǎn)

通過對(duì)Timp2的3'-UTR 與mmu-miR-483-5p的互補(bǔ)區(qū)對(duì)比發(fā)現(xiàn)完全互補(bǔ)，見圖1（A）。為了驗(yàn)證Timp2與mmu-miR-483-5p 的靶向關(guān)系，成功克隆了Timp23'-UTR，構(gòu)建了用于miRNA 靶標(biāo)檢測(cè)的野生型Timp2WT 以及突變型Timp2MUT 重組載體。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染HEK 293T 細(xì)胞2 d 后，共轉(zhuǎn)染野生型重組載體Timp2WT 時(shí)，與 mimics NC 組比較，mmu-miR-483-5p mimics 組的熒光活性顯著下調(diào)（F=19.401，P＜0.05），見圖1（B）；而共轉(zhuǎn)染突變型重組載體Timp2MUT 時(shí)，mimics NC 組與mmu-miR-483-5p mimics組的熒光素酶活性差異不顯著（F=0.05，P＞0.05），見圖1（C）。說明mmu-miR-483-5p 可以與預(yù)測(cè)的Timp2基因的3'-UTR 位點(diǎn)互補(bǔ)，兩者之間存在靶向調(diào)控關(guān)系。上述結(jié)果初步提示Timp2基因可能是mmu-miR-483-5p 調(diào)控破骨細(xì)胞生成的靶基因。

圖1 雙熒光素酶報(bào)告分析Fig 1 Luciferase reporter assays

2.3 轉(zhuǎn)染miR-483-5p 在RAW264.7 細(xì)胞中的含量對(duì)Timp2 的影響

將miR-483-5p mimic 和miR-483-5p inhibitor 分別轉(zhuǎn)染入RAW264.7 細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，增加細(xì)胞中miR-483-5p 的表達(dá)后相較于NC 組，Timp2的蛋白含量顯著降低（F=13.218，P＜0.05），相反，抑制miR-483-5p 的表達(dá)后相較于inNC 組，Timp2的蛋白含量有所提高（F=25.693，P＜0.01），見圖2，這說明在體外miR-483-5p 至少與Timp2蛋白有靶向關(guān)聯(lián)，且呈負(fù)相關(guān)。

圖2 Western blot 檢測(cè)Fig 2 Western blot analysis

2.4 沉默RAW264.7 細(xì)胞中Timp2 對(duì)OCs 分化的影響

為明確Timp2與OCs 之間的關(guān)系，本研究用Timp2的siRNA 沉默RAW264.7 細(xì)胞中的Timp2，誘導(dǎo)OCs 后TRAP 染色顯示，相較于RANKL 誘導(dǎo)的陽性對(duì)照組，沉默細(xì)胞中Timp2會(huì)導(dǎo)致更多OCs生成（F=118.021，P＜0.05），見圖3（A）。而RTPCR 結(jié)果與之對(duì)應(yīng)，各特異性基因TRAP（F=7 358.715，P＜0.05）、NFATc1（F=1 741.066，P＜0.05）、Cathepsin K（F=239.981，P＜0.05）和MMP-9（F=4 456.654，P＜0.05）的表達(dá)相應(yīng)增高，見圖3（B），這提示在RAW264.7 細(xì)胞中Timp2作為miR-483-5p 的靶點(diǎn)可影響OCs 分化及活性。

圖3 TRAP 染色和RT-PCR 檢測(cè)Fig 3 TRAP staining and RT-PCR analysis

2.5 miR-483-5p 和Timp2 共處理RAW264.7 細(xì)胞后對(duì)OCs 分化的影響

Timp2- LV 和miR - 483 - 5p mimic 共處理RAW264.7 細(xì)胞后TRAP 染色結(jié)果顯示，與RANKL 組相比，僅轉(zhuǎn)染miR-483-5p mimic 可促進(jìn)OCs 分化，并且分化出的OCs 體積增大，但在轉(zhuǎn)染miR-483-5p mimic 的前提下，過表達(dá)Timp2可顯著逆轉(zhuǎn)miR-483-5p mimic 引起的過度OCs 活化（F=108.721，P＜0.05），見圖4（A）。RT-PCR 檢測(cè)特異性基因得到了和TRAP 染色一致的結(jié)果（TRAP：F=323.829，P＜0.05；NFATc1：F=197.148，P＜0.05；Cathepsin K：F=431.888，P＜0.05；MMP-9：F=448.821，P＜0.05），見圖4（B）。因此miR-483-5p和Timp2在體外呈靶向且相互拮抗的作用，miR-483-5p 可通過降低Timp2的表達(dá)導(dǎo)致OCs 過度分化。

圖4 共轉(zhuǎn)染后TRAP 染色和RT-PCR 檢測(cè)Fig 4 TRAP staining and RT-PCR analysis after co-transfection

3 討論

越來越多的研究證明OCs 在病理?xiàng)l件下的形成和激活異常對(duì)多種疾病中的骨破壞的影響非常關(guān)鍵［10］。OCs 分化過程受到多種因子和激素的影響，包括RANKL、M-CSF、性激素等，這些因素作為信號(hào)分子導(dǎo)致下游多條信號(hào)通路被激活，如NFATc1（主要）、MAPK、MITF、PI3K/AKT 和NF-κB 等，從而調(diào)節(jié)OCs 的分化和活性［11，12］。除了這些促破骨因子外，還有一些發(fā)揮抑制作用的調(diào)節(jié)因子，如骨保護(hù)素（OPG）與RANKL 的可溶結(jié)合，導(dǎo)致RANK/RANKL 信號(hào)通路的激活被沉默。而雌激素可通過刺激OPG 的產(chǎn)生間接地抑制骨吸收［13］。此外，一些促炎細(xì)胞因子也可促進(jìn)OCs 的形成［14］。

許多研究認(rèn)為在OCs 形成過程中，干預(yù)調(diào)控破骨相關(guān)的miRNA 具有重要意義。自1993 年發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)名為“l(fā)in4”的miRNA 以來，越來越多的研究在多種有機(jī)體中發(fā)現(xiàn)了許多miRNA 可以通過負(fù)向調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)來控制多種生物過程，包括器官發(fā)生、發(fā)育、造血功能、細(xì)胞凋亡、增殖和腫瘤發(fā)生等，是控制細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞分化等過程的關(guān)鍵調(diào)控分子［15］，miRNA 來自RNA 聚合酶Ⅱ，該轉(zhuǎn)錄序列來自于非編碼DNA 序列、內(nèi)含子或非翻譯區(qū)（UTR）內(nèi)的編碼序列［16］，其調(diào)控基因的功能作用于轉(zhuǎn)錄后水平［17］，許多miRNA 已被確定為淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子（如miR146a 或miR155）［18］。

在針對(duì)miR-483-5p 的研究中，Wang 等［19］報(bào)道了miR-483-5p 可通過調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞肥大參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展；De-Ugarte 等［20］通過miRNA 芯片分析發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松病人來源的松質(zhì)骨樣本中miR-483-5p 的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯上調(diào)。

有研究表明miR-483-5p 有助于單核細(xì)胞分化為OCs［21］，而在本研究中，首先利用生物信息軟件預(yù)測(cè)miR-483-5p 可能與Timp2有靶向關(guān)系，進(jìn)而構(gòu)建Timp23'-UTR 的野生型（WT）和突變型（MUT）雙熒光素酶報(bào)告基因載體，通過RT-PCR 檢測(cè)和基因測(cè)序確定Timp2是miR-483-5p 的靶點(diǎn)。隨后，利用miR-483-5p mimic 和miR-483-5p inhibitor 人為的上調(diào)或下調(diào)RAW264.7 細(xì)胞中miR-483-5p 的含量后對(duì)靶蛋白進(jìn)行檢測(cè)，體現(xiàn)出miR-483-5p 可影響RAW264.7 細(xì)胞中Timp2的蛋白表達(dá)量。并研究了Timp2在OCs 分化過程中的作用，結(jié)合兩部分?jǐn)?shù)據(jù)，筆者認(rèn)為miR-483-5p 可通過靶向Timp2調(diào)控OCs 的分化過程及其破骨活性。對(duì)RAW264.7 細(xì)胞的共處理驗(yàn)證了該猜想，在RAW264.7 細(xì)胞分化為OCs 過程中，Timp2可顯著逆轉(zhuǎn)miR-483-5p 帶來的OCs 過度活化。因此，通過以上體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-483-5p 通過調(diào)控Timp2影響OCs 分化和活性。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)干預(yù)調(diào)控破骨相關(guān)的miRNA 影響OCs形成具有重要意義，為治療OCs 過度分化導(dǎo)致的骨破壞疾病提供了新的潛在思路和策略。

作者貢獻(xiàn)度說明：

曾祥周：項(xiàng)目主持人，負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)及論文修改指正；牛田琦：負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)實(shí)施、數(shù)據(jù)處理及論文撰寫；劉彩霞：負(fù)責(zé)部分?jǐn)?shù)據(jù)處理；熊軍、李霜、鄧慧鳴：負(fù)責(zé)樣本收集整理；王華、賈浩：負(fù)責(zé)針對(duì)靶基因預(yù)測(cè)提供技術(shù)指導(dǎo)。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。