劉曉穎　王潤圓　徐芳　張夢媛　鄒偉　王琦

摘 要：目的：探索丙醇二酸對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)脂肪的影響及調(diào)節(jié)機制。方法：在NGM培養(yǎng)基中加入不同濃度丙醇二酸飼養(yǎng)線蟲，油紅O和尼羅紅染色法展示線蟲體內(nèi)脂肪顆粒大小、數(shù)量和相對脂肪含量，測定線蟲身體擺動頻率、吞咽頻率、48 h存活率、身寬、體長等指標。QPCR檢測fat-1至fat-7、sbp-1和nhr-49基因相對表達量，熒光顯微鏡觀察FAT-6：GFP、FAT-7：GFP熒光強度的變化。結(jié)果：10、50、100 μg/mL丙醇二酸處理對線蟲脂滴大小無影響，脂肪顆粒數(shù)量降至對照組的0.69、0.53、0.54倍，相對脂肪含量降至0.87、0.81、0.80倍。此外，身體擺動頻率、吞咽頻率、48 h后存活率和體長無顯著差異，身寬分別降至53.11、57.01、56.03 μm。FAT-6：GFP、FAT-7：GFP熒光強度無明顯變化，nhr-49、sbp-1、fat-1、fat-5、fat-6、fat-7基因轉(zhuǎn)錄水平無明顯變化，fat-2、fat-3、fat-4基因轉(zhuǎn)錄水平分別降至0.69、0.77、0.24倍。結(jié)論：丙醇二酸可降低秀麗隱桿線蟲體內(nèi)脂肪，但不影響運動、吞咽等行為。降脂的調(diào)控不依賴于油酸轉(zhuǎn)化，推測通過降低fat-2、fat-3、fat-4基因轉(zhuǎn)錄使得多不飽和脂肪酸（PUFAs）減少導致脂肪含量降低。

關(guān)鍵詞：秀麗隱桿線蟲；丙醇二酸；脂肪代謝；基因轉(zhuǎn)錄

丙醇二酸是從節(jié)瓜中提取出的一種活性物質(zhì)［1］，屬于小分子有機酸。在人體中，丙醇二酸通過抑制糖轉(zhuǎn)化為脂肪從而減少脂肪堆積［2］。然而，人體自身不能合成丙醇二酸，需通過飲食獲取。節(jié)瓜等少數(shù)果蔬中含有丙醇二酸，是植物有機型丙醇二酸的重要來源［3-4］。隨著人們生活水平的提升、健康意識的增強，越來越注重節(jié)瓜在美容、減肥方面的作用，節(jié)瓜的需求量逐年增加［5］。秀麗隱桿線蟲以其良好的遺傳學特征和高度保守的脂質(zhì)代謝途徑成為肥胖研究中的動物模型［6］，已被廣泛用于食品生物活性成分的營養(yǎng)評價，尤其是在脂肪代謝和長壽領(lǐng)域［7］。與哺乳動物類似，秀麗隱桿線蟲不僅含有一系列脂肪酸，如飽和和不飽和脂肪酸，而且能將吸收的膳食營養(yǎng)素轉(zhuǎn)化為脂肪酸［8］。更重要的是，許多對調(diào)節(jié)人類脂質(zhì)代謝至關(guān)重要的成分是保守的［9］，如NHR-49/MDT-15系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)哺乳動物和哺乳動物能量平衡的類似功能。秀麗隱桿線蟲具有一個固醇反應元件，能夠結(jié)合蛋白同源物SBP-1，它不僅是該生物體內(nèi)脂肪酸合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，而且也是哺乳動物脂肪的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器。線蟲缺乏哺乳動物體內(nèi)的專用脂肪細胞，它將脂肪以液滴形式儲存在腸道和皮下細胞中，可通過脂溶性染料（如油紅O和尼羅紅）進行觀察［10-11］。在此，以秀麗隱桿線蟲為模式生物，全面評估丙醇二酸對脂肪積累的影響及其潛在機制。本研究將為促進丙醇二酸作為一種減少脂肪積累的營養(yǎng)保健品的發(fā)展提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丙醇二酸，上海生工生物工程有限公司；RNA提取試劑盒，上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司；CDNA合成試劑盒，北京天根生化科技有限公司；SYRB，美國MedChemExpress 公司；尼羅紅、油紅O染料，美國Sigma-Aldrich公司；QPCR引物，由上海生工生物工程有限公司進行合成。

1.2 儀器與設(shè)備

Ts2R倒置熒光顯微鏡，日本Nikon公司；TADVANCED PCR儀，德國Biometra公司；Light Cycler 96實時熒光定量PCR儀，德國Eppendorf公司；Allegra X-低溫高速離心機，美國貝克曼公司。

1.3 方法

1.3.1 秀麗隱桿線蟲培養(yǎng) N2野生型線蟲、FAT-6：GFP和FAT-7：GFP線蟲由云南生物資源保護與利用國家重點實驗室饋贈。野生型N2和突變株在NGM（50 mmol/L NaCl，20 g/L瓊脂，2.5 g/L蛋白胨，1.0 mmol/L膽固醇，1.0 mmol/L CaCl2，1.0 mmol/L MgSO4，25 mmol/L磷酸二氫鉀，pH 6.0）上用標準方法在20 ℃營養(yǎng)良好的大腸桿菌OP50上培養(yǎng)至尚未產(chǎn)卵的成年階段。

1.3.2 油紅O和尼羅紅染色 秀麗隱桿線蟲將脂肪以液滴形式儲存在腸道和皮下細胞中，可通過脂溶性染料油紅O和尼羅紅進行染色觀察，具體染色方法參照文獻［12］。

1.3.3 身體擺動頻率、吞咽頻率測定 將同步化后的線蟲加入含有0、10、50、100 μg/mL丙醇二酸的NGM培養(yǎng)基中，生長至未產(chǎn)卵成蟲期后，將線蟲用M9沖洗3次，然后吸取約30條蟲在顯微鏡下計錄1 min身體擺動次數(shù)。吸取約30條蟲至OP50平板上，超凈工作臺中吹干后，計錄每條蟲1 min咽泵次數(shù)。

1.3.4 線蟲48 h后存活率的檢測 將同步化后的線蟲（約50條）加入含有0、10、50、100 μg/mL丙醇二酸的NGM培養(yǎng)基中，生長至未產(chǎn)卵成蟲期后，顯微鏡下觀察存活情況。

1.3.5 身寬、體長的測定 將同步化后的線蟲加入含有0、10、50、100 μg/mL丙醇二酸的NGM培養(yǎng)基中，生長至未產(chǎn)卵成蟲期。將線蟲用M9沖洗3次后，吸取約30條蟲在顯微鏡下用其自帶軟件測定身寬、體長。

1.3.6 FAT-6：GFP和FAT-7：GFP熒光觀察 將FAT-6：GFP、FAT-7：GFP L1期線蟲轉(zhuǎn)移至含丙醇二酸0、10、50、100 μg/mL的NGM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至成蟲。M9洗下后吸取15 μL制片，在熒光顯微鏡下觀察，每次觀察30條蟲，Image J對熒光強度進行定量分析，實驗重復3次。

1.3.7 QPCR分析 收集成蟲，按標準方法提取總RNA，并測定其含量。根據(jù)RNA含量，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟合成cDNA，使用羅氏熒光定量PCR儀進行基因轉(zhuǎn)錄水平測定。以act-1為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt計算轉(zhuǎn)錄水平差異，引物序列見表1。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理及分析 使用GraphPad 8.4.0版本軟件對數(shù)據(jù)進行作圖和統(tǒng)計學分析，t檢驗進行兩兩比較，單因素方差分析進行組間比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 丙醇二酸降低秀麗隱桿線蟲體內(nèi)脂肪積累

脂滴儲存在秀麗隱桿線蟲腸道和皮下細胞中，大小在50～3 000 nm之間。油紅O和尼羅紅染色測定線蟲體脂，評估丙醇二酸對脂肪水平的影響。尼羅紅染色結(jié)果顯示，與WT（對照組）相比，10、50、100 μg/mL丙醇二酸處理線蟲脂滴大小接近1.5μm，無明顯差異（P>0.05，圖1A、C），脂肪顆粒數(shù)量差異明顯，分別降至對照組的0.69、0.53、0.54倍（P<0.05，圖1A、E）。此外，油紅O染色中，相對脂肪含量也分別顯著降低至0.87、0.81、0.80倍（P<0.05，圖1B、D）。這些結(jié)果表明，丙醇二酸在減少線蟲脂肪積累方面具有高效性。

2.2 丙醇二酸處理線蟲部分指標變化

由表2可見，WT（對照組）身體擺動頻率、吞咽頻率分別為60.42、150.25次/min。各劑量組與對照組相比，身體擺動頻率、吞咽頻率無顯著差異（P>0.05）。測定線蟲L1～L4時期發(fā)育48 h后存活率，WT及丙醇二酸處理組存活率均為100%。此外，10、50、100 μg/mL丙醇二酸處理，線蟲體長無明顯差異，身寬分別降至53.1、57.01、56.03 μm（P<0.05，表2）。綜上表明，丙醇二酸對線蟲無明顯毒性，不影響線蟲的運動和吞咽。不同濃度丙醇二酸不影響線蟲的身長，但均顯著降低體寬，這可能與其降低線蟲體內(nèi)脂肪含量有關(guān)。

2.3 丙醇二酸不影響線蟲體內(nèi)油酸的轉(zhuǎn)化

線蟲基因組共包含3個SCD基因（fat-5、fat-6、fat-7）能夠?qū)柡椭舅嶙貦八幔–16∶0）和硬脂酸（C18∶0）轉(zhuǎn)化為棕櫚油酸（C16∶1n-7）和油酸（C18∶1n-9）［13］。其中fat-5將棕櫚酸（C16：0）轉(zhuǎn)化為棕櫚油酸（C16：1n-7），而fat-6和fat-7均將硬脂酸（C18：0）轉(zhuǎn)化為油酸（C18∶1n-9）［14］。為確定丙醇二酸是否參與調(diào)節(jié)線蟲體內(nèi)油酸的轉(zhuǎn)化從而降低脂肪含量，檢測了FAT-6：GFP和FAT-7：GFP熒光強度變化。與WT（對照組）相比，10、50和100 μg/mL丙醇二酸處理，F(xiàn)AT-6：GFP、FAT-7：GFP熒光強度無明顯變化（圖2A、B）。Image J對線蟲熒光強度進行定量分析，不同濃度丙醇二酸處理線蟲FAT-6：GFP、FAT-7：GFP熒光數(shù)值無顯著差異（P>0.05，圖2C、D）。同時，QPCR檢測fat-6、fat-7基因轉(zhuǎn)錄水平，均不影響基因轉(zhuǎn)錄（圖2E）。結(jié)果表明，丙醇二酸不影響線蟲體內(nèi)油酸的轉(zhuǎn)化，其對降脂的調(diào)控依賴于對其他基因的調(diào)控。

2.4 丙醇二酸對PUFAs合成相關(guān)基因的影響

研究發(fā)現(xiàn)，7種脂肪酸去飽和酶（FAT-1至FAT-7）在秀麗線蟲多不飽和脂肪酸（PUFAs）生物合成過程中發(fā)揮重要作用［15］。其中，fat-1基因編碼n-3去飽和酶，將n-6 LA和γ-亞麻酸轉(zhuǎn)化為n-3 ALA和硬脂酸SDA。fat-2基因編碼Δ12酶，將底物n-9 OA生物合成為n-6 LA［16］。fat-3基因編碼Δ6去飽和酶，fat-4基因編碼Δ5去飽和酶，參與C20-PUFAs生物合成。與哺乳動物一樣，線蟲也具有Δ9脂肪酸去飽和酶，該酶由fat-5、fat-6、fat-7三個基因編碼，從飽和脂肪酸（SFA）中生產(chǎn)多不飽和脂肪酸（MUFA）。nhr-49和sbp-1調(diào)控SCD基因fat-5、fat-6、fat-7的表達［17］。為篩選丙醇二酸作用于PUFAs合成的靶基因，對多不飽和脂肪酸合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平進行檢測。其中，nhr-49、sbp-1、fat-1、fat-5、fat-6、fat-7基因轉(zhuǎn)錄水平無明顯變化（P>0.05）（圖2E、表3），fat-2、fat-3、fat-4基因轉(zhuǎn)錄水平分別降至0.69、0.77、0.24倍（P<0.05，表3）。文獻報道fat-2基因突變，OA大量增加，PUFAs減少導致脂滴含量降低，fat-3基因突變脂滴含量略有降低［18］。基于此，推測丙醇二酸處理線蟲降低fat-2、fat-3、fat-4基因轉(zhuǎn)錄，PUFAs減少導致脂滴含量降低，其調(diào)控的分子機制有待于進一步研究。

3 討論

哺乳動物中，不同的脂質(zhì)在不同的器官系統(tǒng)中具有多種功能，從而對包括發(fā)育和生殖在內(nèi)的大多數(shù)生物過程中的脂肪酸信號的理解變得復雜。無脊椎動物模型秀麗隱桿線蟲由于其簡單的解剖結(jié)構(gòu)，以及廣泛的分子、正向和反向遺傳操作，成為發(fā)現(xiàn)新的功能和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的理想工具［19］。丙醇二酸是否會影響線蟲生物學行為，是否也有減脂作用有待研究。與人類在專用脂肪組織中儲存脂肪不同，線蟲利用腸道和皮下細胞儲存脂質(zhì)。盡管有這些差異，但在RNAi篩選中發(fā)現(xiàn)了許多改變脂肪儲存的基因，其中包括在哺乳動物脂肪新陳代謝中發(fā)揮作用的同系物。此外，許多途徑，如胰島素信號通路，不僅能夠調(diào)節(jié)哺乳動物的脂肪儲存，也能調(diào)節(jié)線蟲的脂肪儲存［20-21］。秀麗隱桿線蟲具有乙酰輔酶a羧化酶和脂肪酸合酶，作為脂肪酸生物合成的關(guān)鍵酶。研究表明，幾種酶在秀麗線蟲PUFAs生物合成過程中發(fā)揮重要作用，如7種脂肪酸去飽和酶FAT-1至FAT-7、3-酮酰輔酶a還原酶LET-767和脂肪酸延長酶LRT-1［15］。Δ12去飽和酶FAT-2突變體含有大量的OA，而只有1%的多不飽和脂肪酸，導致許多缺陷，與野生型線蟲相比，幼卵體積縮?。?9%）、孵化率降低（19%）、生長緩慢、運動不協(xié)調(diào)、脂滴含量顯著減少［18］。在此，以秀麗隱桿線蟲為模式生物，全面評估丙醇二酸對脂肪積累的影響及其潛在機制。丙醇二酸在減少線蟲脂肪積累方面具有高效性，對線蟲無明顯毒性，不影響線蟲的運動和吞咽。丙醇二酸不影響線蟲體內(nèi)油酸的轉(zhuǎn)化，也不降低fat-2、fat-3、fat-4基因轉(zhuǎn)錄。PUFAs減少導致脂滴含量降低，其調(diào)控的分子機制有待于進一步研究。

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Research on Hydroxymalonic Acid Reduce Body Fat Content in Caenorhabditis elegans

LIU Xiao-ying，WANG Run-yuan，XU Fang，ZHANG Meng-yuan，ZOU Wei，WANG Qi

（School of Public Health，Kunming Medical University，Kunming 650500，China）

Abstract：Objective To explore hydroxymalonic acid on the influence of body fat and regulating mechanism in C.elegans.Method Nematodes were feed on the NGM culture medium with different concentration of hydroxymalonic acid，Oil red O and Nile red staining were used to show the size，number and relative fat content of fat particles in nematodes.At the same time，Body swinging frequency，swallowing frequency，48 h survival rate，body width and length were measured.The relative expressions of fat-1 to fat-7，sbp-1 and nhr-49 genes were detected by QPCR，and the changes of fluorescence intensity of FAT-6：GFP and FAT-7：GFP were observed by fluorescence microscope.Result Result showed that 10，50，and 100 μg/mL hydroxymalonic acid treatment had no effect on lipid droplets size，but fat particles number dropped to 0.69，0.53，and 0.54 times，relatively fat decrease to 0.87，0.81，and 0.80 times.In addition，There was no significant difference in body swing frequency，swallowing frequency，survival rate and body length after 48 hours.Nevertheless body width respectively dropped to 53.11，57.01 and 56.03μm.The fluorescence intensity of FAT-6：GFP and FAT-7：GFP did not change significantly，and the transcriptional levels of nhr-49，sbp-1，fat-1，fat-5，fat-6 and fat-7 genes has no obvious change，but fat-2，fat-3，fat-4 gene transcription level dropped to 0.69，0.77，and 0.24 times respectively.Conclusion Hydroxymalonic acid reduced the body fat of Caenorhabditis elegans，but did not affect the behavior of exercise，swallowing and so on.The regulation of lipid lowering does not depend on oleic acid transformation.It is speculated that the decrease of polyunsaturated fatty acids （PUFAs）leads to the decrease of fat content by reducing the transcription of fat-2，fat-3 and fat-4 genes.

Keywords：Caenorhabditis elegans；hydroxymalonic acid；fat metabolism；gene transcription

基金項目：云南省基礎(chǔ)研究計劃（昆醫(yī)聯(lián)合專項）（項目編號：2018FE001-309、2019FE001-177）。

#并列第一作者：劉曉穎（2000— ），女，在讀碩士研究生，研究方向：營養(yǎng)及食品安全檢測；王潤圓（1995— ），女，在讀碩士研究生，研究方向：營養(yǎng)及食品安全檢測。

*共同通信作者：鄒偉（1988— ），男，博士，講師，研究方向：生物分析與檢測；王琦（1976— ），女，博士，教授，研究方向：營養(yǎng)及食品安全檢測。