劉曉穎　王潤(rùn)圓　徐芳　張夢(mèng)媛　鄒偉　王琦

摘 要：目的：探索丙醇二酸對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)脂肪的影響及調(diào)節(jié)機(jī)制。方法：在NGM培養(yǎng)基中加入不同濃度丙醇二酸飼養(yǎng)線(xiàn)蟲(chóng)，油紅O和尼羅紅染色法展示線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)脂肪顆粒大小、數(shù)量和相對(duì)脂肪含量，測(cè)定線(xiàn)蟲(chóng)身體擺動(dòng)頻率、吞咽頻率、48 h存活率、身寬、體長(zhǎng)等指標(biāo)。QPCR檢測(cè)fat-1至fat-7、sbp-1和nhr-49基因相對(duì)表達(dá)量，熒光顯微鏡觀察FAT-6：GFP、FAT-7：GFP熒光強(qiáng)度的變化。結(jié)果：10、50、100 μg/mL丙醇二酸處理對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)脂滴大小無(wú)影響，脂肪顆粒數(shù)量降至對(duì)照組的0.69、0.53、0.54倍，相對(duì)脂肪含量降至0.87、0.81、0.80倍。此外，身體擺動(dòng)頻率、吞咽頻率、48 h后存活率和體長(zhǎng)無(wú)顯著差異，身寬分別降至53.11、57.01、56.03 μm。FAT-6：GFP、FAT-7：GFP熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化，nhr-49、sbp-1、fat-1、fat-5、fat-6、fat-7基因轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯變化，fat-2、fat-3、fat-4基因轉(zhuǎn)錄水平分別降至0.69、0.77、0.24倍。結(jié)論：丙醇二酸可降低秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)脂肪，但不影響運(yùn)動(dòng)、吞咽等行為。降脂的調(diào)控不依賴(lài)于油酸轉(zhuǎn)化，推測(cè)通過(guò)降低fat-2、fat-3、fat-4基因轉(zhuǎn)錄使得多不飽和脂肪酸（PUFAs）減少導(dǎo)致脂肪含量降低。

關(guān)鍵詞：秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)；丙醇二酸；脂肪代謝；基因轉(zhuǎn)錄

丙醇二酸是從節(jié)瓜中提取出的一種活性物質(zhì)［1］，屬于小分子有機(jī)酸。在人體中，丙醇二酸通過(guò)抑制糖轉(zhuǎn)化為脂肪從而減少脂肪堆積［2］。然而，人體自身不能合成丙醇二酸，需通過(guò)飲食獲取。節(jié)瓜等少數(shù)果蔬中含有丙醇二酸，是植物有機(jī)型丙醇二酸的重要來(lái)源［3-4］。隨著人們生活水平的提升、健康意識(shí)的增強(qiáng)，越來(lái)越注重節(jié)瓜在美容、減肥方面的作用，節(jié)瓜的需求量逐年增加［5］。秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)以其良好的遺傳學(xué)特征和高度保守的脂質(zhì)代謝途徑成為肥胖研究中的動(dòng)物模型［6］，已被廣泛用于食品生物活性成分的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)，尤其是在脂肪代謝和長(zhǎng)壽領(lǐng)域［7］。與哺乳動(dòng)物類(lèi)似，秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)不僅含有一系列脂肪酸，如飽和和不飽和脂肪酸，而且能將吸收的膳食營(yíng)養(yǎng)素轉(zhuǎn)化為脂肪酸［8］。更重要的是，許多對(duì)調(diào)節(jié)人類(lèi)脂質(zhì)代謝至關(guān)重要的成分是保守的［9］，如NHR-49/MDT-15系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物和哺乳動(dòng)物能量平衡的類(lèi)似功能。秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)具有一個(gè)固醇反應(yīng)元件，能夠結(jié)合蛋白同源物SBP-1，它不僅是該生物體內(nèi)脂肪酸合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，而且也是哺乳動(dòng)物脂肪的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器。線(xiàn)蟲(chóng)缺乏哺乳動(dòng)物體內(nèi)的專(zhuān)用脂肪細(xì)胞，它將脂肪以液滴形式儲(chǔ)存在腸道和皮下細(xì)胞中，可通過(guò)脂溶性染料（如油紅O和尼羅紅）進(jìn)行觀察［10-11］。在此，以秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)為模式生物，全面評(píng)估丙醇二酸對(duì)脂肪積累的影響及其潛在機(jī)制。本研究將為促進(jìn)丙醇二酸作為一種減少脂肪積累的營(yíng)養(yǎng)保健品的發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丙醇二酸，上海生工生物工程有限公司；RNA提取試劑盒，上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司；CDNA合成試劑盒，北京天根生化科技有限公司；SYRB，美國(guó)MedChemExpress 公司；尼羅紅、油紅O染料，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；QPCR引物，由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成。

1.2 儀器與設(shè)備

Ts2R倒置熒光顯微鏡，日本Nikon公司；TADVANCED PCR儀，德國(guó)Biometra公司；Light Cycler 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，德國(guó)Eppendorf公司；Allegra X-低溫高速離心機(jī)，美國(guó)貝克曼公司。

1.3 方法

1.3.1 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)培養(yǎng) N2野生型線(xiàn)蟲(chóng)、FAT-6：GFP和FAT-7：GFP線(xiàn)蟲(chóng)由云南生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。野生型N2和突變株在NGM（50 mmol/L NaCl，20 g/L瓊脂，2.5 g/L蛋白胨，1.0 mmol/L膽固醇，1.0 mmol/L CaCl2，1.0 mmol/L MgSO4，25 mmol/L磷酸二氫鉀，pH 6.0）上用標(biāo)準(zhǔn)方法在20 ℃營(yíng)養(yǎng)良好的大腸桿菌OP50上培養(yǎng)至尚未產(chǎn)卵的成年階段。

1.3.2 油紅O和尼羅紅染色 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)將脂肪以液滴形式儲(chǔ)存在腸道和皮下細(xì)胞中，可通過(guò)脂溶性染料油紅O和尼羅紅進(jìn)行染色觀察，具體染色方法參照文獻(xiàn)［12］。

1.3.3 身體擺動(dòng)頻率、吞咽頻率測(cè)定 將同步化后的線(xiàn)蟲(chóng)加入含有0、10、50、100 μg/mL丙醇二酸的NGM培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)至未產(chǎn)卵成蟲(chóng)期后，將線(xiàn)蟲(chóng)用M9沖洗3次，然后吸取約30條蟲(chóng)在顯微鏡下計(jì)錄1 min身體擺動(dòng)次數(shù)。吸取約30條蟲(chóng)至OP50平板上，超凈工作臺(tái)中吹干后，計(jì)錄每條蟲(chóng)1 min咽泵次數(shù)。

1.3.4 線(xiàn)蟲(chóng)48 h后存活率的檢測(cè) 將同步化后的線(xiàn)蟲(chóng)（約50條）加入含有0、10、50、100 μg/mL丙醇二酸的NGM培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)至未產(chǎn)卵成蟲(chóng)期后，顯微鏡下觀察存活情況。

1.3.5 身寬、體長(zhǎng)的測(cè)定 將同步化后的線(xiàn)蟲(chóng)加入含有0、10、50、100 μg/mL丙醇二酸的NGM培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)至未產(chǎn)卵成蟲(chóng)期。將線(xiàn)蟲(chóng)用M9沖洗3次后，吸取約30條蟲(chóng)在顯微鏡下用其自帶軟件測(cè)定身寬、體長(zhǎng)。

1.3.6 FAT-6：GFP和FAT-7：GFP熒光觀察 將FAT-6：GFP、FAT-7：GFP L1期線(xiàn)蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至含丙醇二酸0、10、50、100 μg/mL的NGM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至成蟲(chóng)。M9洗下后吸取15 μL制片，在熒光顯微鏡下觀察，每次觀察30條蟲(chóng)，Image J對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7 QPCR分析 收集成蟲(chóng)，按標(biāo)準(zhǔn)方法提取總RNA，并測(cè)定其含量。根據(jù)RNA含量，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟合成cDNA，使用羅氏熒光定量PCR儀進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄水平測(cè)定。以act-1為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt計(jì)算轉(zhuǎn)錄水平差異，引物序列見(jiàn)表1。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理及分析 使用GraphPad 8.4.0版本軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，單因素方差分析進(jìn)行組間比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 丙醇二酸降低秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)脂肪積累

脂滴儲(chǔ)存在秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)腸道和皮下細(xì)胞中，大小在50～3 000 nm之間。油紅O和尼羅紅染色測(cè)定線(xiàn)蟲(chóng)體脂，評(píng)估丙醇二酸對(duì)脂肪水平的影響。尼羅紅染色結(jié)果顯示，與WT（對(duì)照組）相比，10、50、100 μg/mL丙醇二酸處理線(xiàn)蟲(chóng)脂滴大小接近1.5μm，無(wú)明顯差異（P>0.05，圖1A、C），脂肪顆粒數(shù)量差異明顯，分別降至對(duì)照組的0.69、0.53、0.54倍（P<0.05，圖1A、E）。此外，油紅O染色中，相對(duì)脂肪含量也分別顯著降低至0.87、0.81、0.80倍（P<0.05，圖1B、D）。這些結(jié)果表明，丙醇二酸在減少線(xiàn)蟲(chóng)脂肪積累方面具有高效性。

2.2 丙醇二酸處理線(xiàn)蟲(chóng)部分指標(biāo)變化

由表2可見(jiàn)，WT（對(duì)照組）身體擺動(dòng)頻率、吞咽頻率分別為60.42、150.25次/min。各劑量組與對(duì)照組相比，身體擺動(dòng)頻率、吞咽頻率無(wú)顯著差異（P>0.05）。測(cè)定線(xiàn)蟲(chóng)L1～L4時(shí)期發(fā)育48 h后存活率，WT及丙醇二酸處理組存活率均為100%。此外，10、50、100 μg/mL丙醇二酸處理，線(xiàn)蟲(chóng)體長(zhǎng)無(wú)明顯差異，身寬分別降至53.1、57.01、56.03 μm（P<0.05，表2）。綜上表明，丙醇二酸對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)無(wú)明顯毒性，不影響線(xiàn)蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)和吞咽。不同濃度丙醇二酸不影響線(xiàn)蟲(chóng)的身長(zhǎng)，但均顯著降低體寬，這可能與其降低線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)脂肪含量有關(guān)。

2.3 丙醇二酸不影響線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)油酸的轉(zhuǎn)化

線(xiàn)蟲(chóng)基因組共包含3個(gè)SCD基因（fat-5、fat-6、fat-7）能夠?qū)柡椭舅嶙貦八幔–16∶0）和硬脂酸（C18∶0）轉(zhuǎn)化為棕櫚油酸（C16∶1n-7）和油酸（C18∶1n-9）［13］。其中fat-5將棕櫚酸（C16：0）轉(zhuǎn)化為棕櫚油酸（C16：1n-7），而fat-6和fat-7均將硬脂酸（C18：0）轉(zhuǎn)化為油酸（C18∶1n-9）［14］。為確定丙醇二酸是否參與調(diào)節(jié)線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)油酸的轉(zhuǎn)化從而降低脂肪含量，檢測(cè)了FAT-6：GFP和FAT-7：GFP熒光強(qiáng)度變化。與WT（對(duì)照組）相比，10、50和100 μg/mL丙醇二酸處理，F(xiàn)AT-6：GFP、FAT-7：GFP熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化（圖2A、B）。Image J對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，不同濃度丙醇二酸處理線(xiàn)蟲(chóng)FAT-6：GFP、FAT-7：GFP熒光數(shù)值無(wú)顯著差異（P>0.05，圖2C、D）。同時(shí)，QPCR檢測(cè)fat-6、fat-7基因轉(zhuǎn)錄水平，均不影響基因轉(zhuǎn)錄（圖2E）。結(jié)果表明，丙醇二酸不影響線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)油酸的轉(zhuǎn)化，其對(duì)降脂的調(diào)控依賴(lài)于對(duì)其他基因的調(diào)控。

2.4 丙醇二酸對(duì)PUFAs合成相關(guān)基因的影響

研究發(fā)現(xiàn)，7種脂肪酸去飽和酶（FAT-1至FAT-7）在秀麗線(xiàn)蟲(chóng)多不飽和脂肪酸（PUFAs）生物合成過(guò)程中發(fā)揮重要作用［15］。其中，fat-1基因編碼n-3去飽和酶，將n-6 LA和γ-亞麻酸轉(zhuǎn)化為n-3 ALA和硬脂酸SDA。fat-2基因編碼Δ12酶，將底物n-9 OA生物合成為n-6 LA［16］。fat-3基因編碼Δ6去飽和酶，fat-4基因編碼Δ5去飽和酶，參與C20-PUFAs生物合成。與哺乳動(dòng)物一樣，線(xiàn)蟲(chóng)也具有Δ9脂肪酸去飽和酶，該酶由fat-5、fat-6、fat-7三個(gè)基因編碼，從飽和脂肪酸（SFA）中生產(chǎn)多不飽和脂肪酸（MUFA）。nhr-49和sbp-1調(diào)控SCD基因fat-5、fat-6、fat-7的表達(dá)［17］。為篩選丙醇二酸作用于PUFAs合成的靶基因，對(duì)多不飽和脂肪酸合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)。其中，nhr-49、sbp-1、fat-1、fat-5、fat-6、fat-7基因轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯變化（P>0.05）（圖2E、表3），fat-2、fat-3、fat-4基因轉(zhuǎn)錄水平分別降至0.69、0.77、0.24倍（P<0.05，表3）。文獻(xiàn)報(bào)道fat-2基因突變，OA大量增加，PUFAs減少導(dǎo)致脂滴含量降低，fat-3基因突變脂滴含量略有降低［18］?；诖?，推測(cè)丙醇二酸處理線(xiàn)蟲(chóng)降低fat-2、fat-3、fat-4基因轉(zhuǎn)錄，PUFAs減少導(dǎo)致脂滴含量降低，其調(diào)控的分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

3 討論

哺乳動(dòng)物中，不同的脂質(zhì)在不同的器官系統(tǒng)中具有多種功能，從而對(duì)包括發(fā)育和生殖在內(nèi)的大多數(shù)生物過(guò)程中的脂肪酸信號(hào)的理解變得復(fù)雜。無(wú)脊椎動(dòng)物模型秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)由于其簡(jiǎn)單的解剖結(jié)構(gòu)，以及廣泛的分子、正向和反向遺傳操作，成為發(fā)現(xiàn)新的功能和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的理想工具［19］。丙醇二酸是否會(huì)影響線(xiàn)蟲(chóng)生物學(xué)行為，是否也有減脂作用有待研究。與人類(lèi)在專(zhuān)用脂肪組織中儲(chǔ)存脂肪不同，線(xiàn)蟲(chóng)利用腸道和皮下細(xì)胞儲(chǔ)存脂質(zhì)。盡管有這些差異，但在RNAi篩選中發(fā)現(xiàn)了許多改變脂肪儲(chǔ)存的基因，其中包括在哺乳動(dòng)物脂肪新陳代謝中發(fā)揮作用的同系物。此外，許多途徑，如胰島素信號(hào)通路，不僅能夠調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的脂肪儲(chǔ)存，也能調(diào)節(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的脂肪儲(chǔ)存［20-21］。秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)具有乙酰輔酶a羧化酶和脂肪酸合酶，作為脂肪酸生物合成的關(guān)鍵酶。研究表明，幾種酶在秀麗線(xiàn)蟲(chóng)PUFAs生物合成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如7種脂肪酸去飽和酶FAT-1至FAT-7、3-酮酰輔酶a還原酶LET-767和脂肪酸延長(zhǎng)酶LRT-1［15］。Δ12去飽和酶FAT-2突變體含有大量的OA，而只有1%的多不飽和脂肪酸，導(dǎo)致許多缺陷，與野生型線(xiàn)蟲(chóng)相比，幼卵體積縮?。?9%）、孵化率降低（19%）、生長(zhǎng)緩慢、運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)、脂滴含量顯著減少［18］。在此，以秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)為模式生物，全面評(píng)估丙醇二酸對(duì)脂肪積累的影響及其潛在機(jī)制。丙醇二酸在減少線(xiàn)蟲(chóng)脂肪積累方面具有高效性，對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)無(wú)明顯毒性，不影響線(xiàn)蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)和吞咽。丙醇二酸不影響線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)油酸的轉(zhuǎn)化，也不降低fat-2、fat-3、fat-4基因轉(zhuǎn)錄。PUFAs減少導(dǎo)致脂滴含量降低，其調(diào)控的分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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Research on Hydroxymalonic Acid Reduce Body Fat Content in Caenorhabditis elegans

LIU Xiao-ying，WANG Run-yuan，XU Fang，ZHANG Meng-yuan，ZOU Wei，WANG Qi

（School of Public Health，Kunming Medical University，Kunming 650500，China）

Abstract：Objective To explore hydroxymalonic acid on the influence of body fat and regulating mechanism in C.elegans.Method Nematodes were feed on the NGM culture medium with different concentration of hydroxymalonic acid，Oil red O and Nile red staining were used to show the size，number and relative fat content of fat particles in nematodes.At the same time，Body swinging frequency，swallowing frequency，48 h survival rate，body width and length were measured.The relative expressions of fat-1 to fat-7，sbp-1 and nhr-49 genes were detected by QPCR，and the changes of fluorescence intensity of FAT-6：GFP and FAT-7：GFP were observed by fluorescence microscope.Result Result showed that 10，50，and 100 μg/mL hydroxymalonic acid treatment had no effect on lipid droplets size，but fat particles number dropped to 0.69，0.53，and 0.54 times，relatively fat decrease to 0.87，0.81，and 0.80 times.In addition，There was no significant difference in body swing frequency，swallowing frequency，survival rate and body length after 48 hours.Nevertheless body width respectively dropped to 53.11，57.01 and 56.03μm.The fluorescence intensity of FAT-6：GFP and FAT-7：GFP did not change significantly，and the transcriptional levels of nhr-49，sbp-1，fat-1，fat-5，fat-6 and fat-7 genes has no obvious change，but fat-2，fat-3，fat-4 gene transcription level dropped to 0.69，0.77，and 0.24 times respectively.Conclusion Hydroxymalonic acid reduced the body fat of Caenorhabditis elegans，but did not affect the behavior of exercise，swallowing and so on.The regulation of lipid lowering does not depend on oleic acid transformation.It is speculated that the decrease of polyunsaturated fatty acids （PUFAs）leads to the decrease of fat content by reducing the transcription of fat-2，fat-3 and fat-4 genes.

Keywords：Caenorhabditis elegans；hydroxymalonic acid；fat metabolism；gene transcription

基金項(xiàng)目：云南省基礎(chǔ)研究計(jì)劃（昆醫(yī)聯(lián)合專(zhuān)項(xiàng)）（項(xiàng)目編號(hào)：2018FE001-309、2019FE001-177）。

#并列第一作者：劉曉穎（2000— ），女，在讀碩士研究生，研究方向：營(yíng)養(yǎng)及食品安全檢測(cè)；王潤(rùn)圓（1995— ），女，在讀碩士研究生，研究方向：營(yíng)養(yǎng)及食品安全檢測(cè)。

*共同通信作者：鄒偉（1988— ），男，博士，講師，研究方向：生物分析與檢測(cè)；王琦（1976— ），女，博士，教授，研究方向：營(yíng)養(yǎng)及食品安全檢測(cè)。