朱云娜，符質(zhì)，馮慧敏，王斌，沈雪晴，湯婉君，劉建國

(1.廣東省粵北食藥資源利用與保護重點實驗室，廣東 韶關 512005；2.韶關學院英東生物與農(nóng)業(yè)學院，廣東 韶關 512005)

鈣作為第二信使在植物信號轉(zhuǎn)導中具有重要調(diào)控作用[1，2]。 鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)、類鈣調(diào)蛋白(CaM-likeprotein，CML)、類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白(calcineurin B-like protein，CBL)和鈣依賴型蛋白激酶(Ca2＋-dependentproteinkinase，CDPK)是植物體內(nèi)常見的鈣感受器種類[3，4]。 除CDPK 中含有蛋白激酶結構域外，其他3 個鈣感受器都不含激酶結構域，必須與靶蛋白結合形成復合體才能傳遞鈣信號[4，5]。

CBL 起源于綠藻和苔蘚，現(xiàn)廣泛存在于被子植物和裸子植物中，是一種古老的鈣感受器[6]，具有典型的結合Ca2＋結構域——EF 手臂(EFhand)[1]。 類鈣調(diào)磷酸酶B 亞基蛋白激酶(CBLsinteracting protein kinases，CIPK)是CBL 特異結合的蛋白激酶，通過形成CBL-CIPK 復合體參與調(diào)控植物生長發(fā)育和非生物脅迫響應[1，4，5]。 不同植物CBL 成員數(shù)量不同，擬南芥[1，7]、煙草[8]、黃瓜[9]、大白菜[10]中分別有10、20、6、13 個CBLs 成員。

植物CBLs 參與種子發(fā)芽、花粉管萌發(fā)等生長發(fā)育過程[1，2]，也參與響應高鹽、低溫、干旱等逆境脅迫[1，4，11-13]。 CIPK23 在調(diào)控礦質(zhì)營養(yǎng)轉(zhuǎn)運蛋白方面具有重要作用[1，4，11-14]。 低鉀脅迫下，AtCBL1/AtCBL9 可將AtCIPK23 定位到質(zhì)膜，使其通過磷酸化激活鉀離子通道蛋白(ArabidopsisK＋transporter 1，AKT1)，從而增加擬南芥細胞對K＋的吸收[15]。 近年來的研究表明，水稻早期氮響應因子在蛋白質(zhì)磷酸化等方面富集[16]，而氮轉(zhuǎn)運蛋白活性也依賴于外界氮信號所觸發(fā)的磷酸化[17]，因此，蛋白磷酸化在氮信號傳導、氮代謝方面發(fā)揮重要作用。 如:CBL-CIPK 復合體通過調(diào)控氮轉(zhuǎn)運蛋白磷酸化水平調(diào)控擬南芥氮信號通路[18-20]；AtCBL1/9-AtCIPK23 通過磷酸化修飾，調(diào)控擬南芥硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運蛋白(nitrate transporter 1.1，NRT1.1)親和性的轉(zhuǎn)變，以適應不同濃度硝酸鹽(NO-3) 條件下對NO-3的吸收[18]；在高銨(NH＋4)脅迫下，AtCBL1-AtCIPK23 可調(diào)控銨態(tài)氮轉(zhuǎn)運蛋白(ammonium transporter，AMT)AMT1.1 和AMT1.2 的磷酸化，使其失去活性，避免吸收過量NH＋4[19，21]。 我們最近研究發(fā)現(xiàn)，菜心銨轉(zhuǎn)運蛋白BcAMT1s 可與CIPK23 互作[22]，菜心CIPK23表達受氮素水平和氮素形態(tài)的影響(待發(fā)表)。 不同CBLs 可能參與同一種非生物脅迫，相同CBL可能參與不同非生物脅迫響應[1]。 為此，本文選擇可與CIPK23 互作的CBL1、CBL9 為研究對象，采用同源克隆法獲得菜心CBL1和CBL9的全長序列，并分析其生物學特性、組織表達特性以及對不同氮素形態(tài)的響應，以期為提高菜心氮素吸收利用的作用機理研究提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及樣品處理

供試菜心(Brassica campestrisL.ssp.chinensisvar.utilisTsen et Lee)品種為‘油綠501’(由廣州市農(nóng)業(yè)科學研究院選育)，于2021 年3—5 月在廣東省韶關市韶關學院英東生物與農(nóng)業(yè)學院生態(tài)園玻璃溫室內(nèi)培養(yǎng)。 將菜心種子用7.5%的NaClO消毒10 min，用無菌水清洗4 ～5 次，然后播種于海綿塊上進行育苗，待幼苗長至三葉一心時移植到改良霍格蘭營養(yǎng)液中進行培養(yǎng)。 之后根據(jù)不同試驗要求進行處理、取樣。

1.1.1 基因表達組織特異性分析的樣品采集菜心幼苗移栽后生長30～40 d，待角果結莢后，分別取根、莖、葉、花、葉柄、莢果、花蕾、薹莖等組織樣品，用于基因表達的組織特異性分析。 每個樣品設3 個生物學重復，每重復取4 ～6 株，液氮速凍后保存在-80℃冰箱中備用。

1.1.2 不同水平氮素處理試驗的樣品處理 菜心移苗后在1 個劑量的改良霍格蘭營養(yǎng)液中培養(yǎng)4 d，取出用蒸餾水沖洗根部，然后轉(zhuǎn)移到缺氮營養(yǎng)液中再培養(yǎng)4 d，將菜心苗分苗移栽到1、4、8 mmol/L NH4Cl/NaNO3營養(yǎng)液中處理2 h，分別對葉片和根系進行取樣，每個樣品設3 個生物學重復，每重復取4～6 株，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA 提取及cDNA 合成

采用Eastep?Super 植物總RNA 提取試劑盒[普洛麥格(北京)生物技術有限公司]提取總RNA，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3 菜心CBLs 基因克隆

在NCBI 數(shù)據(jù)庫(https:/ /blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)查找擬南芥(Arabidopsis thaliana)AtCBL1、AtCBL9的基因序列，然后在大白菜(Brassica rapa)基因組進行BLAST 比對，得到與其同源性最高的BrCBL1(XM_009138607.3)、BrCBL9(XM_009130690.3)基因序列。 菜心是大白菜的一個變種，親緣關系較近，因此根據(jù)大白菜BrCBL1、BrCBL9基因序列設計同源引物用于克隆菜心相應的基因。 利用Primer Premier 5.0 軟件設計引物，引物序列見表1。 設置20 μL PCR 反應體系:Primer star Max primer 10 μL，cDNA 模板鏈1 μL，上下游引物各1 μL，加ddH2O 補充至20 μL。 PCR 反應程序:98℃預變性5 min；98℃20 s，58℃20 s，72℃1 min，35 個循環(huán)；72℃延伸1 min。

表1 所用引物及其序列

回收擴增產(chǎn)物，連接到pMD20-T 載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞，將經(jīng)PCR 鑒定的陽性克隆送廣州擎科生物技術有限公司測序。

1.4 生物信息學分析

利用表2 所列軟件對菜心CBL1、CBL9基因編碼蛋白及其氨基酸序列進行分析。

表2 所用軟件及其網(wǎng)址

1.5 基因表達量的qRT-PCR 分析

按照1.2 中的方法提取菜心樣品的RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，cDNA 樣品用RNase-Free ddH2O稀釋5 倍后作為模板，利用SYBR Green?PremixEx TaqTM進行熒光定量PCR 分析。 擴增體系:2×SYBR GreenTaqTM10 μL，10 μmol/L 上下游引物各0.4 μL，cDNA 模板2 μL，用RNase-Free ddH2O 補充到20.0 μL。 擴增程序:95℃預變性3 min，95℃10 s，60℃30 s，循環(huán)40 次。 以GADPH和Actin2為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt計算基因相對表達量[23]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析與作圖

用Microsoft Excel 2010 整理數(shù)據(jù)，用SPSS 19.0 進行統(tǒng)計分析，用Duncan’s 法進行顯著性分析，用SigmaPlot 11.0 作圖。

2 結果與分析

2.1 菜心CBL1、CBL9 基因的克隆

以菜心葉片cDNA 為模板，用CBL1-F、CBL1-R 和CBL9-F、CBL9-R 引物進行PCR 擴增，均獲得約650 bp 的基因片段(圖1)。 經(jīng)測序，克隆得到的基因片段長度均為642 bp。 通過BLAST 在線比對，菜心CBL1基因片段與擬南芥的AtCBL1(NM_001341238.1)、甘藍型油菜(Brassica napus)的BnCBL1(XM_013881846.3)、大白菜的BrCBL1(XM_009138607.3)的核苷酸序列同源性分別為91.12%、98.29%、98.44%；而菜心CBL9基因片段與AtCBL9(NM _ 124081.4)、BnCBL9(XM _013840912.3)、BrCBL9(XM_009130690.3)的核苷酸序列同源性分別為92.21%、99.69%、99.69%。初步表明所克隆的兩個基因片段分別為菜心CBL1、CBL9基因序列。 將這兩個基因分別命名為BcCBL1、BcCBL9。

圖1 菜心CBL1、CBL9 基因的PCR 擴增圖譜

2.2 BcCBL1、BcCBL9 的氨基酸序列分析

利用ProtParam 和ExPASyProtScale 對Bc-CBL1、BcCBL9 編碼蛋白序列進行分析，結果顯示，BcCBL1 編碼213 個氨基酸，分子量為24.60 kD，原子組成為C1109H1725N277O336S9，理論等電點(pI)為4.64，平均疏水率為-0.173，脂肪酸系數(shù)為89.20，不穩(wěn)定系數(shù)為36.35。 BcCBL9 編碼213 個氨基酸，分子量為24.41 kD，原子組成為C1097H1703N275O338S8，pI 為4.58，平均疏水率為-0.185，脂肪酸系數(shù)為88.31，不穩(wěn)定系數(shù)為34.69。 BcCBL1、BcCBL9 均為可溶性親水蛋白。 通過SignalP 5.0 預測分析發(fā)現(xiàn)二者均無信號肽序列，為非分泌型蛋白。

BcCBL1、BcCBL9 均有多個絲氨酸磷酸位點(ser)和蘇氨酸磷酸位點(Thr)。 利用Cell-Ploc 2.0 和ProtCompv.9.0 預測BcCBL1、BcCBL9 亞細胞定位，均定位于細胞膜上；TMHMM Server 2.0分析結果表明二者均無跨膜結構。

2.3 BcCBL1 和BcCBL9 的二、三級結構分析

運用Expasy 的SOPMA 對BcCBL1、BcCBL9蛋白的二級結構進行預測分析，結果(圖2)顯示，BcCBL1 蛋白含有α-螺旋(alpha helix)50.70%、β-折疊延伸鏈(extended strand)11.74%、β-轉(zhuǎn)角(beta turn) 5.16%、 無 規(guī) 則 卷 曲(random coil)32.39%，而BcCBL9 蛋白的α-螺旋、β-折疊延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲分別為52.11%、7.98%、6.57%、33.33%。 可見，兩者的主要組成部分均為α-螺旋，β-折疊延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲則散布于蛋白結構中。 三級結構預測結果與該結果一致。 另外，BcCBL1 蛋白三級結構為單體結構，而BcCBL9 蛋白三級結構為二聚體結構(圖3)。

圖2 BcCBL1 和BcCBL9 蛋白二級結構預測

圖3 BcCBL1、BcCBL9 蛋白三級結構預測

2.4 BcCBL1、BcCBL9 氨基酸序列同源性比對及系統(tǒng)進化分析

將BcCBL1、BcCBL9 與AtCBL1(NP_567533.1)、AtCBL9(NP_199521.1)、BrCBL1(XP_009136855.1)、BrCBL9(XP_009128938.1)進行氨基酸序列多重比對分析，結果(圖4)顯示，BcCBL1、BcCBL9 與兩個物種CBL1、CBL9 的氨基酸相似性介于95.31%～100%，其中， BcCBL1 與BrCBL1 相 似 性 高 達100%，BcCBL9 與BrCBL9 相似性為99.53%。

圖4 菜心、擬南芥、大白菜CBL1、CBL9 氨基酸序列多重比對結果

利用SMART 在線工具對兩個菜心CBL基因編碼氨基酸進行保守結構域分析，結果(圖5)表明，Bc-CBL1、BcCBL9 均具有CBL 蛋白結合Ca2＋所必需的EF-hand 型結構域(EFh)，保守結構域均為3 個且位置相同，位于第71～99、108～136、152～180 位氨基酸，F(xiàn)ANRIFDMFDVKRKGVIDFGDFVRSLNVF(BcCBL1)和FANRIFDLFDVKRKGVIDFGDFVRSLNVF(BcCBL9)，KIDFTFRLYDMDCTGFIERQEVKQMLIAL (BcCBL1)和KTDFTFRLYDMDCTGFIERQEVKQMLIAL(Bc-CBL9)，ILDKTFEDADVNQDGKIDKLEWSDFVNKN(BcCBL1)和ILDQTFEDADVDRDGKIDKTEWSDFVIKN(BcCBL9)。

圖5 BcCBL1、BcCBL9 保守結構域分析

進化樹分析結果(圖6)表明，BcCBL1 與BrCBL1親緣關系最近，BcCBL9 與BrCBL9 親緣關系最近，其次分別為AtCBL1 和AtCBL9，且菜心、大白菜、擬南芥的CBL1 與CBL9 同聚類在一個分支，而與擬南芥、大白菜的其他CBL 成員相距較遠。進一步表明本研究分離得到的2 個菜心CBL基因?qū)儆谥参顲BLs基因家族成員，編碼類鈣調(diào)磷酸酶B 亞基蛋白。

圖6 BcCBL1、BcCBL9 與擬南芥、大白菜CBLs 的進化樹分析

2.5 BcCBL1、BcCBL9 在菜心不同器官中的表達分析

由圖7 可知，BcCBL1和BcCBL9在菜心根、莖、葉、葉柄、薹莖、花蕾、花、莢果中均有表達。BcCBL1在菜心葉中表達量最高，顯著高于其他器官，其次為根、莖；在葉柄、薹莖、花蕾、花、莢果中表達量相對較低，且器官間無顯著差異。BcCBL9在菜心莢果中表達量最高，其次為薹莖，兩者間差異顯著且均顯著高于其他器官；在葉、葉柄、花、根、莖中表達量相對較低，在花蕾中的表達量最低，顯著低于其他器官，僅為莢果中表達量的3.33%。

2.6 BcCBL1 和BcCBL9 對不同氮素形態(tài)的響應

由圖8 可知，BcCBL1、BcCBL9表達量受氮素形態(tài)及其水平影響，二者表現(xiàn)出不同的表達模式。BcCBL1在低濃度氮條件表達量較高，表達量有隨氮濃度增加而明顯下降的趨勢；在8 mmol/L NO-3(或NH＋4)條件下，菜心根和葉中的BcCBL1表達量也較高，為1 mmol/L NO-3(或NH＋4)條件下的5.92%～41.41%。BcCBL1表達還受不同氮素形態(tài)影響，在相同濃度條件下，NH＋4處理的菜心根中BcCBL1表達量最高，NO-3處理的次之，NH4NO3處理的最低(圖8A)；在菜心葉中，BcCBL1表達也呈現(xiàn)出與根中類似的變化規(guī)律(圖8B)。

圖8 BcCBL1(A、B)和BcCBL9(C、D)對不同氮素形態(tài)的響應

由圖8C 看出，在菜心根中，BcCBL9表達量隨著NH＋4濃度增加顯著增加，8 mmol/L NH＋4處理下最高，分別是中、低濃度NH＋4處理下的1.96 倍和48.16 倍；而在NO-3和NH4NO3處理下，隨其濃度增加，BcCBL9表達量均呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢，且不同濃度處理間差異顯著，但表達量最高值分別出現(xiàn)在低濃度和高濃度處理時。 在菜心葉中(圖8D)，BcCBL9表達水平隨NO-3濃度增加而降低，中、高濃度處理間表達量差異不顯著，但顯著低于低濃度處理；在NO-3和NH4NO3處理下，Bc-CBL9表達水平隨濃度的變化趨勢與根系中相似，但變化幅度略小，其中，中濃度與高濃度NH＋4處理間、低濃度與高濃度NH4NO3處理間差異不顯著。

此外，與BcCBL1相比，無論在菜心根還是葉中，BcCBL9均保持較高的表達水平，暗示兩基因可能在氮素吸收利用方面發(fā)揮著不同作用。

2.7 BcCBL1、BcCBL9 蛋白互作關系

在STRING 交互式數(shù)據(jù)庫中輸入BcCBL1、BcCBL9 蛋白序列，選擇“擬南芥”為所屬物種，利用擬南芥蛋白構建互作關系網(wǎng)絡，據(jù)此推測Bc-CBL1、BcCBL9 的互作蛋白。 由圖9 推測可知，BcCBL1 蛋白與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族(CIPK1、CIPK3、CIPK7、CIPK8、CIPK9、CIPK15、CIPK23、SOS2、SIP3)、鉀離子通道蛋白AKT1 具有互作關系；而BcCBL9 蛋白也可與AKT1 和CIPK 家族蛋白互作，但其互作網(wǎng)絡中未包含CIPK7 和CIPK15，此外，菜心BcCBL9 還可與免疫親和蛋白(FKBP12)和AT2G20050 蛋白互作。

圖9 BcCBL1(A)和BcCBL9(B)蛋白的互作網(wǎng)絡

3 討論與結論

本研究從菜心中克隆到兩個完整的CBL基因——BcCBL1、BcCBL9，開放閱讀框均為642 bp，均編碼213 個氨基酸殘基；BcCBL1、BcCBL9 蛋白均具有CBL 蛋白結合Ca2＋所必需的EF-hand 結構域；與大白菜、擬南芥CBL1、CBL9 的氨基酸序列同源性均在95%以上，聚類于同一進化分支，但與其他CBL 成員的遺傳距離較遠。BcCBL1、BcCBL9編碼蛋白均為穩(wěn)定性蛋白，具有較強的親水性，定位于細胞質(zhì)膜上，無跨膜結構，無信號肽，與擬南芥AtCBL1、AtCBL9[24]和唐古特白刺Nt-CBL 的定位結果一致[11]。 CBL 定位于質(zhì)膜上表明其可能通過結合膜蛋白在細胞中發(fā)揮作用[11]。BcCBL1 和BcCBL9 蛋白結構的主要組成部分均為α-螺旋，散布β-折疊延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲；然而，BcCBL1 為單體結構，BcCBL9 蛋白為二聚體結構，暗示兩者可能發(fā)揮著不同的生物學功能。

基因在不同組織中的表達特性可能暗示其在相應表達部位的生物學功能[25]。 在已研究的植物中，多數(shù)CBL在各個組織或器官中具有不同程度表達，在某些組織中具有表達優(yōu)勢[8]。 本研究結果表明，BcCBL1和BcCBL9在菜心根、莖、葉、葉柄、薹莖、花蕾、花、莢果中均有表達，其中，Bc-CBL1在葉中的表達量遠高于在其他組織中，而BcCBL9在莢果中的表達量顯著高于在其他組織中，暗示兩基因可能分別主要在菜心葉和莢果生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用。

研究報道，CBL1/9 可與CIPK23 形成CBLCIPK 復合體參與擬南芥氮信號通路調(diào)控[18，19]，并可響應低溫、高鹽、干旱、低鉀等多種逆境脅迫，在植物生長發(fā)育過程和非生物脅迫中具有重要作用[13，20]。 本研究結果表明，BcCBL1、BcCBL9 確實可響應外界氮素變化，二者的表達水平不僅受不同氮素形態(tài)影響，也受氮素水平影響，但二者呈現(xiàn)出不同的變化趨勢。 其中，BcCBL1在低濃度(1 mmol/L)單一氮源(NO-3或NH＋4)條件上調(diào)表達，而在中(4 mmol/L)、高濃度(8 mmol/L)或混合氮源(NH4NO3)條件下調(diào)表達，甚至不表達；BcCBL9在低濃度NH＋4條件下表達量低，在中、高濃度NH＋4條件下表達量高，而在NO-3和NH4NO3處理時，BcCBL9在低/高氮濃度下表達水平較高，在中等濃度下表達量較低。 這與AtCBL1/9受低濃度NO-3誘導上調(diào)表達而在高濃度NO-3時下調(diào)表達[18]的結論一致。Straub[24]報道，擬南芥AtCBL1表達依賴于NH＋4，缺氮后恢復供2 mmol/L NH＋4可誘導其表達，供NH＋430 min 時，AtCBL1表達量達到峰值，隨后開始下降；而AtCBL9表達量在供NH＋430 min 后才開始增加，隨后基本無明顯變化。 本研究主要對供不同濃度不同形態(tài)氮素2 h后BcCBL1、BcCBL9基因在菜心中的表達情況進行分析，并未比較不同供氮時間對二者表達量的影響，可在今后研究中增加該項目。

通過STRING 交互式數(shù)據(jù)庫，利用擬南芥CBL1、CBL9 蛋白構建互作蛋白網(wǎng)絡，據(jù)此推測菜心的BcCBL1 與CIPK1、CIPK3、CIPK7、CIPK8、CIPK9、CIPK15、CIPK23 等CIPK 家族成員及鉀離子通道蛋白AKT1 互作； 而BcCBL9 雖可與AKT1、CIPKs 互作，但CIPK 成員不包含CIPK7 和CIPK15， 此 外， BcCBL9 還 可 與 FKBP12 和AT2G20050 蛋 白 互 作。 STRING 數(shù) 據(jù) 庫 對AT2G20050 蛋白注釋為含有蛋白磷酸酶2C 和環(huán)核苷酸結合/激酶結構域蛋白，參與調(diào)控蛋白質(zhì)磷酸化。AtCBL1/9受低濃度NO-3誘導表達，促進其與CIPK23 形成復合體以調(diào)控AtNRT1.1 磷酸化水平，從而促進NO-3運輸[18]。 在擬南芥中，AtCBL1 與AtCIPK23 形成CBL-CIPK 復合體，參與調(diào)控AtAMT1.1 和AtAMT1.2 蛋白磷酸化水平，從而調(diào)控擬南芥根系對NH＋4的吸收，而AtCBL9并未參與調(diào)控[19，21，24]。 本研究發(fā)現(xiàn)菜心BcCBL1和BcCBL9表達均受不同氮素形態(tài)和氮素水平影響，二者在不同氮素形態(tài)下如何調(diào)控氮素吸收利用，是否存在功能冗余現(xiàn)象，仍需進一步研究。

綜上，本研究分離得到的BcCBL1、BcCBL9基因?qū)儆诓诵腃BL 基因家族成員，具有組織表達特異性，受氮素不同形態(tài)不同水平影響，但兩者表達模式不同，可能參與調(diào)控不同氮素條件下的氮吸收與利用過程，具體作用機制還需進一步探究。在今后研究中，可將氮素供應時間進一步細化，觀察BcCBL1、BcCBL9基因在不同供氮時間下的表達模式，再利用VIGS 對基因進行沉默，驗證其功能。 本研究結果可對進一步探究菜心氮素吸收利用分子機制提供一定的理論依據(jù)。