陶樂(lè)維，韓 煦，陳清光，徐雋斐，陸 灝

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院內(nèi)分泌科（上海 201203）

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞叉頭框蛋白O（FOXO）家族的抗氧化作用對(duì)于維持骨骼的穩(wěn)態(tài)、改善氧化應(yīng)激具有重要作用［1-2］，F(xiàn)OXO1 是其中非常重要并發(fā)揮關(guān)鍵作用的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子［3-4］。在前期研究［5-6］中，我們發(fā)現(xiàn)六味地黃方含藥血清能改善過(guò)氧化氫（H2O2）對(duì)小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞（MC3T3-E1）造成的氧化損傷，促進(jìn)其增殖分化，升高還原型谷胱甘肽（GSH）水平，降低細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，但六味地黃方是否通過(guò)FOXO1 來(lái)發(fā)揮以上作用目前并不清楚。因此，本研究采用六味地黃方干預(yù)去卵巢（OVX）大鼠，觀察其對(duì)骨髓ROS 水平、血清抗氧化指標(biāo)、骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物及股骨FOXO1 蛋白表達(dá)的影響，并進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討六味地黃方能否通過(guò)影響FOXO1來(lái)發(fā)揮抗氧化作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 Wistar雄性大鼠40只、雌性大鼠42只，體質(zhì)量200 g 左右，SPF 級(jí)，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2020-0009。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0006。大鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：濕度（55±10）%，溫度（23±2）℃，晝夜交替光照與黑暗12 h∶12 h，自由進(jìn)食進(jìn)水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有操作均符合上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定（倫理批準(zhǔn)號(hào)：PZSHUTCM190912002）。

1.1.2 細(xì)胞 MC3T3-E1，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.3 藥物與試劑 六味地黃方藥物組成、產(chǎn)地及煎煮方法參見(jiàn)文獻(xiàn)［5］。

戊酸雌二醇片（補(bǔ)佳樂(lè)），法國(guó)DELPHARM Lille S.A.S.公司（批號(hào)：488A）；H2O2，上海阿拉丁生化科技股份有限公司（批號(hào)：H112515）；N-乙酰半胱氨酸（NAC），瑞陽(yáng)制藥有限公司（批號(hào)：19050303）；替來(lái)他明/唑拉西泮（舒泰50），法國(guó)維克有限公司（批號(hào)：83887901）；ROS 檢測(cè)試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：S0033）；還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒（批號(hào)：A006-2）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）（批號(hào)：A005）、超氧化物歧化酶（SOD）（批號(hào)：A001-3）、過(guò)氧化氫酶（CAT）（批號(hào)：A007-2）、蛋白定量試劑盒（批號(hào)：A045-3），南京建成生物工程研究所；I 型膠原羧基末端肽（CTX-I）（批號(hào)：XY-E30026）、骨鈣素（OCN）（批號(hào)：XY-E30604）、骨堿性磷酸酶（BALP）試劑盒（批號(hào)：XYE30037），上海信裕生物有限公司；CCK-8 試劑盒，美國(guó)Sab 公司（批號(hào)：CP002）；0.25%胰蛋白酶（批號(hào)：T1300-100）、青霉素-鏈霉素混合液（批號(hào)：P1400-100），北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清，美國(guó)Gibco 公司（批號(hào)：16000-044）；α基礎(chǔ)培養(yǎng)基（α-MEM），美國(guó)HyClone公司（批號(hào)：SH30265.01）；FOXO1（批號(hào)：Bs-23175R）、p-FOXO1一抗（批號(hào)：Bs-13207R），北京博奧森生物技術(shù)有限公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔，上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：A0208）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH），美國(guó) Cell Signaling Technology 公司（批號(hào)：5174）。

1.1.4 主要儀器 電轉(zhuǎn)儀，大連競(jìng)邁科技有限公司（型號(hào)：PS-9）；恒溫水浴箱，北京市長(zhǎng)鳳儀器儀表公司（型號(hào)：HW-SY11-K）；CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司（型號(hào)：3111）；生物安全柜，蘇州金凈凈化設(shè)備公司（型號(hào)：BHC-1300IIB2）；流式細(xì)胞儀，美國(guó)Beckman 公司（型號(hào)：CytoFLEX）；酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司（型號(hào)：Synergy H1）；離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司（型號(hào)：TDZ4-WS）；電泳儀，美國(guó)Bio-Rad 公司（型號(hào)：mini protean 3 cell）；0.22 μm 過(guò)濾器，美國(guó)Millipore公司（型號(hào)：SLGP033RB）；成像系統(tǒng)，上海天能公司（型號(hào)：5200）；超低溫冰箱，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司（型號(hào)：900系列）。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.1 分組與造模 將42 只Wistar 雌性大鼠分為正常組、假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)佳樂(lè)組、NAC組，以及六味地黃方大劑量組及小劑量組，每組6只。除正常組外，其他大鼠用舒泰50按照40 mg·kg-1體質(zhì)量腹腔注射麻醉，肌內(nèi)注射0.2 mL的阿托品。麻醉后，參照文獻(xiàn)［7］方法，假手術(shù)組大鼠切除兩側(cè)卵巢下方的部分脂肪組織后縫合，其他大鼠均切除兩側(cè)卵巢。術(shù)后3 d，每日1次肌內(nèi)注射青霉素8萬(wàn)U。術(shù)后1周行陰道脫落細(xì)胞涂片檢查，確認(rèn)手術(shù)成功。

1.2.2 干預(yù) 給藥周期為8 周。假手術(shù)組和模型組均給予質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液灌胃；按照成人每日用藥量換算，六味地黃方小劑量組予7.5 g·kg-1·d-1六味地黃方灌胃，六味地黃方大劑量組予15 g·kg-1·d-1六味地黃方灌胃；補(bǔ)佳樂(lè)組給予0.1 mg·kg-1·d-1補(bǔ)佳樂(lè)灌胃。以上各組均每日灌胃1 次。NAC 組給予NAC，劑量為50 mg·kg-1·d-1，每天1次，皮下注射。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 （1）大鼠氧化應(yīng)激及骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物。取股骨骨髓，采用二氯熒光黃二乙酸酯（DCFH-DA）熒光探針檢測(cè)ROS 水平。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中抗氧化指標(biāo)，包括SOD 活力以及CAT、GSH-PX、GSH 含量。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物，包括骨形成標(biāo)志物BALP、OCN，骨吸收標(biāo)志物CTX-I。

（2）大鼠股骨FOXO1 蛋白表達(dá)。采用Western blot法檢測(cè)大鼠股骨中的FOXO1 蛋白表達(dá)。取大鼠股骨，加入細(xì)胞裂解液（RIPA），冰上裂解30 min后，離心收集上清提取細(xì)胞蛋白。二辛可寧酸（BCA）法測(cè)定細(xì)胞總蛋白濃度。各孔取25 μg的蛋白上樣，于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離（濃縮膠80 V 電壓，20 min；分離膠120 V 電壓，60 min）。將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)移（100 mA 電流，90 min）至聚偏二氟乙烯（PVDF 膜）。加入5%脫脂奶粉封閉液于搖床上室溫封閉1 h。用等滲緩沖鹽溶液（TBST）洗膜3 次，每次5 min，分別加入一抗抗體（體積稀釋比例均為1∶1 000）4 ℃反應(yīng)過(guò)夜。次日先以TBST洗膜3次，每次5 min。后加入HRP標(biāo)記的抗兔IgG（體積稀釋比例為1∶1 000），室溫反應(yīng)1 h。再用TBST 洗膜3 次，每次5 min。按增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒說(shuō)明進(jìn)行顯影。采用ImageJ 軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.1 含藥血清的制備 40 只雄性Wistar 大鼠隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10 只，分別灌胃給予質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液、低劑量六味地黃方（15 g·kg-1·d-1）、中劑量六味地黃方（30 g·kg-1·d-1）和高劑量六味地黃方（45 g·kg-1·d-1）。按每100 g 大鼠體質(zhì)量1 mL 給藥，連續(xù)灌胃5 d，于第5 天灌胃1 h 后腹主動(dòng)脈取血后處死。將裝有大鼠血液的離心管離心，取同組血清合并，制備對(duì)照組含藥血清和低、中、高劑量組含藥血清，并于56 ℃水浴箱滅活30 min。將滅活后的血清通過(guò)0.22 μm Millipore過(guò)濾器過(guò)濾，分裝后放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 MC3T3-E1 細(xì)胞培養(yǎng) MC3T3-E1 細(xì)胞復(fù)蘇后，用含10%的胎牛血清、含青霉素-鏈霉素混合液的α-MEM 培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。細(xì)胞隔天換液，當(dāng)生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，用胰酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 細(xì)胞分組 ①FOXO1 蛋白表達(dá)：實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組、對(duì)照含藥血清組，以及低、中、高劑量含藥血清組、NAC 組。②細(xì)胞轉(zhuǎn)染及驗(yàn)證：分為正常組、FOXO1 小干擾RNA 轉(zhuǎn)染組（siFOXO1 組）、陰性對(duì)照小干擾RNA 轉(zhuǎn)染組（siNC 組）。③沉默F(xiàn)OXO1基因后含藥血清對(duì)細(xì)胞增殖及ROS水平干預(yù)作用：分為正常組、模型組、NAC 組、高劑量含藥血清組、siNC 組、siFOXO1組、siFOXO1+高劑量含藥血清組。④含藥血清對(duì)p-FOXO1 表達(dá)的干預(yù)作用：分為正常組、模型組、NAC組、對(duì)照含藥血清組、高劑量含藥血清組。

1.3.4 細(xì)胞藥物干預(yù) 除正常組外，其余各組先用1.0 mmol·L-1的H2O2預(yù)處理MC3T3-E1 細(xì)胞6 h，隨后模型組、siNC 組、siFOXO1 組更換正常培養(yǎng)基，NAC 組更換含2.5 mmol·L-1NAC 的培養(yǎng)基，對(duì)照含藥血清組和高、中、低劑量含藥血清組均更換為相應(yīng)組別含10%大鼠血清的培養(yǎng)基。各組均處理24 h。

1.3.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法 （1）FOXO1 蛋白表達(dá)。參照“1.3.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行藥物干預(yù)。FOXO1 蛋白檢測(cè)：將需要抽提蛋白的細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細(xì)胞后離心收集細(xì)胞沉淀，加入RIPA 提取蛋白，BCA 法測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度。其余操作參照“1.2.3（2）”項(xiàng)下方法。

（2）細(xì)胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后驗(yàn)證。細(xì)胞轉(zhuǎn)染委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司完成。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后蛋白驗(yàn)證參照“1.3.5（1）”項(xiàng)下方法。

（3）沉默F(xiàn)OXO1基因后細(xì)胞增殖及ROS 水平。參照“1.3.4”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞。分別于培養(yǎng)48 h、72 h后，加入 CCK-8并放入培養(yǎng)箱中孵育，于450 nm處讀取光密度（OD）值。采用DCFH-DA 熒光探針，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

（4）六味地黃方含藥血清對(duì)p-FOXO1 表達(dá)的干預(yù)作用。參照“1.3.4”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞；參照“1.3.5（1）”項(xiàng)下方法檢測(cè)FOXO1及p-FOXO1蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用±s表示。組間比較采用One-way ANOVA 檢驗(yàn)，如統(tǒng)計(jì)有差異時(shí)再進(jìn)行組間多重比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.1.1 對(duì)大鼠骨髓ROS 的干預(yù)作用 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠ROS 水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，補(bǔ)佳樂(lè)組、NAC 組以及六味地黃方大、小劑量組ROS 水平均明顯降低（P＜0.05）。補(bǔ)佳樂(lè)組、NAC 組、六味地黃方大劑量組的ROS水平明顯低于六味地黃方小劑量組（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組ROS水平比較

2.1.2 對(duì)大鼠血清抗氧化指標(biāo)的干預(yù)作用 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠SOD、CAT、GSH-PX、GSH 水平明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，補(bǔ)佳樂(lè)組、NAC 組和六味地黃方大劑量組SOD、CAT、GSH-PX、GSH 水平均明顯升高（P＜0.05），六味地黃方小劑量組GSH-PX 明顯升高（P＜0.05）。與補(bǔ)佳樂(lè)組比較，六味地黃方大劑量組SOD 水平明顯降低（P＜0.05），六味地黃方小劑量組SOD、CAT、GSH-PX、GSH水平均明顯降低（P＜0.05）。與NAC 組比較，六味地黃方大劑量組SOD、GSH 及六味地黃方小劑量組SOD、CAT、GSH-PX、GSH 水平均明顯降低（P＜0.05）。與六味地黃方大劑量組比較，六味地黃方小劑量組GSH-PX水平明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組抗氧化指標(biāo)比較

2.1.3 對(duì)大鼠血清骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物的干預(yù)作用 與假手術(shù)組比較，模型組BALP、OCN 水平明顯降低，CTX-I 水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，補(bǔ)佳樂(lè)組、NAC組及六味地黃方大劑量組的BALP、OCN 水平均明顯升高（P＜0.05），CTX-I 水平均明顯降低（P＜0.05）。與補(bǔ)佳樂(lè)組比較，六味地黃方小劑量組BALP 水平明顯降低（P＜0.05）。與NAC 組比較，六味地黃方小劑量組BALP水平明顯降低（P＜0.05），六味地黃方大劑量組、小劑量組OCN 水平均明顯降低（P＜0.05），六味地黃方小劑量組CTX-I 水平明顯升高（P＜0.05）。與六味地黃方大劑量組比較，六味地黃方小劑量組各指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物水平比較

2.1.4 對(duì)大鼠股骨FOXO1蛋白表達(dá)的干預(yù)作用 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠股骨FOXO1 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，補(bǔ)佳樂(lè)組、NAC 組以及六味地黃方大、小劑量組股骨FOXO1 蛋白表達(dá)均明顯降低（P＜0.05）。與補(bǔ)佳樂(lè)組比較，NAC 組及六味地黃方大、小劑量組股骨FOXO1蛋白表達(dá)均明顯升高（P＜0.05）。與NAC 組比較，六味地黃方大、小劑量組股骨FOXO1蛋白表達(dá)均明顯升高（P＜0.05）。與六味地黃方大劑量組比較，六味地黃方小劑量組股骨FOXO1 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 各組大鼠FOXO1蛋白表達(dá)比較

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.2.1 對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞FOXO1 蛋白表達(dá)的干預(yù)作用 與正常組比較，模型組細(xì)胞FOXO1 蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。與模型組比較，低、中、高劑量含藥血清組及NAC 組FOXO1 蛋白表達(dá)均明顯降低（P＜0.05），且隨著六味地黃方劑量增加，蛋白表達(dá)依次降低（P＜0.05）。與NAC 組比較，低、中、高劑量含藥血清組蛋白表達(dá)均明顯增加（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 各組MC3T3-E1細(xì)胞FOXO1蛋白表達(dá)比較

2.2.2 沉默F(xiàn)OXO1基因后的驗(yàn)證 沉默F(xiàn)OXO1基因后通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法可以發(fā)現(xiàn)，siFOXO1 組FOXO1 蛋白表達(dá)明顯低于正常組及siNC組（P＜0.05）。見(jiàn)圖6。

圖6 相關(guān)基因沉默后各組FOXO1蛋白表達(dá)比較

2.2.3 對(duì)沉默F(xiàn)OXO1基因后細(xì)胞增殖的干預(yù)作用 與模型組比較，siNC 組細(xì)胞增殖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。沉默F(xiàn)OXO1基因后，siFOXO1組在48 h及72 h細(xì)胞增殖均明顯低于模型組和siNC組（P＜0.05）。經(jīng)含藥血清干預(yù)后，siFOXO1+高劑量含藥血清組在48 h及72 h細(xì)胞增殖均明顯高于模型組和siFOXO1組（P＜0.05），但都明顯低于高劑量含藥血清組（P＜0.05）。見(jiàn)圖7。

圖7 相關(guān)基因沉默后各組細(xì)胞增殖情況比較

2.2.4 對(duì)沉默F(xiàn)OXO1基因后ROS 水平的干預(yù)作用與模型組比較，siNC 組ROS 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。沉默F(xiàn)OXO1基因后，siFOXO1 組ROS 水平明顯高于模型組和siNC 組（P＜0.05）。經(jīng)含藥血清干預(yù)后，siFOXO1+高劑量含藥血清組ROS 水平明顯低于模型組和siFOXO1 組（P＜0.05），但明顯高于高劑量含藥血清組（P＜0.05）。見(jiàn)圖8。

圖8 相關(guān)基因沉默后各組ROS水平比較

2.2.5 對(duì)p-FOXO1蛋白表達(dá)的干預(yù)作用 FOXO1蛋白表達(dá)結(jié)果與“2.2.1”中的結(jié)果一致。但模型組p-FOXO1蛋白表達(dá)明顯低于正常組（P＜0.05），NAC組及高劑量含藥血清組p-FOXO1/GAPDH均明顯高于模型組（P＜0.05）。高劑量含藥血清組p-FOXO1 蛋白表達(dá)明顯低于NAC組（P＜0.05）。見(jiàn)圖9。

圖9 各組FOXO1/GAPDH、p-FOXO1/GAPDH水平比較

3 討論

隨著年齡增加和性激素水平的衰退，骨骼內(nèi)的ROS 水平會(huì)不斷增加，進(jìn)而導(dǎo)致骨吸收增加、骨形成減少，骨重建穩(wěn)態(tài)的改變導(dǎo)致了骨質(zhì)疏松的發(fā)生［8］。中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥，基于“腎主骨”理論，“從腎治骨”是其重要治則。近年來(lái)，經(jīng)典名方六味地黃丸（六味地黃方）用于治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，不僅可以緩解癥狀、改善骨密度，在作用機(jī)制方面也有很多新的發(fā)現(xiàn)［9-10］。同時(shí)也有大量文獻(xiàn)［11-14］報(bào)道六味地黃方在機(jī)體多個(gè)組織和器官中具有抗氧化的作用。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)六味地黃方含藥血清能改善氧化損傷MC3T3-E1細(xì)胞的ROS 水平。本研究采用的OVX 大鼠不僅是經(jīng)典的骨質(zhì)疏松癥模型［15］，同時(shí)也被證實(shí)其骨骼內(nèi)的ROS 水平明顯升高［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃方各劑量組干預(yù)措施均能降低OVX 大鼠ROS 水平，其中尤以大劑量組更為顯著，與此相應(yīng)的是六味地黃方大劑量組干預(yù)措施能顯著提高血清中抗氧化指標(biāo)（SOD、CAT、GSH-PX、GSH）的含量，同時(shí)其能明顯升高OVX 大鼠的BALP和OCN，降低CTX-I，提示六味地黃方能促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收。

FOXO 家族最初引起人們的關(guān)注是由于發(fā)現(xiàn)它們具有延長(zhǎng)線蟲(chóng)和果蠅壽命的作用［17-18］。隨后大量研究［4，19-20］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO 家族尤其是FOXO1、FOXO3、FOXO4 這3 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控包括成骨細(xì)胞在內(nèi)的氧化應(yīng)激中發(fā)揮了重要作用。在既往的研究［21］中，我們發(fā)現(xiàn)六味地黃方含藥血清能促進(jìn)MC3T3-E1 細(xì)胞FOXO1mRNA 表達(dá)。為進(jìn)一步明確六味地黃方的抗氧化機(jī)制，我們將著眼點(diǎn)聚焦于FOXO1基因。但比較意外的是在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)六味地黃方各劑量組FOXO1 蛋白表達(dá)都要低于模型組，同時(shí)大劑量組的FOXO1 蛋白表達(dá)要明顯低于小劑量組（P＜0.05），在后續(xù)用氧化損傷MC3T3-E1 細(xì)胞的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中也得到了類似的結(jié)果。為此，我們嘗試進(jìn)一步沉默F(xiàn)OXO1基因表達(dá)來(lái)觀察其中的變化。

有研究［4］顯示，敲除小鼠成骨細(xì)胞FOXO1基因后，骨骼中ROS水平上升，成骨細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，成骨細(xì)胞的增殖受到抑制。在我們的實(shí)驗(yàn)中，同樣發(fā)現(xiàn)siFOXO1 組在48 h 及72 h 細(xì)胞增殖均明顯低于模型組和siNC 組（P＜0.05），ROS 水平明顯高于模型組和siNC組（P＜0.05）。雖然siFOXO1+高劑量含藥血清組在各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖均明顯高于模型組和siFOXO1組（P＜0.05），但都明顯低于高劑量含藥血清組（P＜0.05）；類似的情況也出現(xiàn)在了ROS 水平上。這提示沉默MC3T3-E1 細(xì)胞FOXO1基因表達(dá)后還是部分影響到了六味地黃方對(duì)氧化損傷MC3T3-E1細(xì)胞增殖及對(duì)ROS的改善作用，即FOXO1 對(duì)六味地黃方改善氧化應(yīng)激、促進(jìn)細(xì)胞增殖發(fā)揮了正向作用。那么六味地黃方又是如何通過(guò)FOXO1來(lái)發(fā)揮作用的呢？

有研究［1-2］顯示，當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，蓄積的ROS 能使FOXO1 磷酸化，促進(jìn)其轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中，進(jìn)而通過(guò)激活抗氧化基因、DNA 修復(fù)基因、細(xì)胞周期基因等進(jìn)一步發(fā)揮抗氧化的防御作用。同時(shí)p-FOXO1可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，其中就包括了GSH，其可進(jìn)一步發(fā)揮改善氧化應(yīng)激的作用［4，8］。在前期研究中，我們確實(shí)發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)六味地黃方高劑量含藥血清干預(yù)的氧化損傷MC3T3-E1細(xì)胞中GSH水平有明顯升高，ROS水平有明顯降低。因此，我們進(jìn)一步采用高劑量含藥血清來(lái)觀察其對(duì)p-FOXO1 的干預(yù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，盡管（六味地黃方）高劑量含藥血清組降低了FOXO1 蛋白表達(dá)，但p-FOXO1 表達(dá)明顯高于模型組（P＜0.05）。這提示六味地黃方含藥血清雖然降低了氧化損傷MC3T3-E1 細(xì)胞的FOXO1 蛋白表達(dá)，但還是能上調(diào)FOXO1基因磷酸化水平。根據(jù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果我們推測(cè)：六味地黃方各劑量組FOXO1 表達(dá)下降是由于六味地黃方改善氧化應(yīng)激后，不再需要通過(guò)FOXO1 高表達(dá)來(lái)改善氧化應(yīng)激，因此FOXO1 蛋白表達(dá)出現(xiàn)下降；但同時(shí)六味地黃方能促進(jìn)FOXO1 磷酸化，p-FOXO1發(fā)揮了部分促進(jìn)細(xì)胞增殖及抗氧化的作用。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)六味地黃方能促進(jìn)OVX 大鼠骨形成，抑制骨吸收，改善氧化應(yīng)激，抑制ROS水平，其機(jī)制可能部分與促進(jìn)成骨細(xì)胞FOXO1磷酸化有關(guān)。