張 倩，金武燮，陸美龍，韓沅沅，陳天琦，谷麗華，王崢濤

上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局中藥新資源與質(zhì)量評價重點實驗室，上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心（上海 201203）

中藥材石菖蒲是天南星科植物石菖蒲Acorus tatarinowiiSchott 的干燥根莖，多數(shù)生長于長江以南地區(qū)，其性溫，味辛、苦，歸心、胃經(jīng)，具有開竅豁痰、醒神益智、化濕開胃的功效。藥理研究［1-3］表明，石菖蒲具有抗疲勞以及改善阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）相關(guān)的認(rèn)知障礙疾病等藥理活性。石菖蒲成分復(fù)雜，含豐富的揮發(fā)油類成分，其中代表性成分β-細(xì)辛醚與α-細(xì)辛醚是其重要的活性成分，也是研究熱點［4］。此外，石菖蒲中還含有機酸、氨基酸、糖類等大極性非揮發(fā)性成分，存在于水提液中［5-6］。石菖蒲水提物不僅具有一定的神經(jīng)營養(yǎng)功能，同時也有改善AD 的作用［7-8］，是其發(fā)揮藥效作用不可忽視的一部分。

近年來，核苷類成分的生物活性已被證實，該類成分不僅是人體內(nèi)核苷酸類輔酶的前體物質(zhì)，還在機體各種生理過程的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起到重要的調(diào)控作用，具有增強機體免疫、預(yù)防心血管疾病等作用［9-10］。目前已有多種中藥使用核苷類成分控制藥材質(zhì)量［11-14］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，石菖蒲配方顆粒水溶性主要成分為核苷類化合物，同時由于揮發(fā)油是石菖蒲中的主要藥效成分，故本次配方顆粒部分樣品嘗試增加環(huán)糊精包合揮發(fā)油技術(shù)制備方案。本實驗參考《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》［15］，首先采用超高效液相色譜（UPLC）法對配方顆粒進行整體表征，建立特征圖譜；同時，采用高效液相色譜（HPLC）法對石菖蒲配方顆粒中核苷類成分建立專屬特征圖譜，并以尿苷為指標(biāo)建立了石菖蒲配方顆粒的含量測定方法，以期更好地控制該配方顆粒的質(zhì)量，保證臨床療效。

1 材料

1.1 主要儀器 HPLC 儀，美國安捷倫科技有限公司（型號：Agilent 1260 Infinity Ⅱ）；UPLC 儀，美國安捷倫科技有限公司（型號：Agilent 1290 Infinity Ⅱ）；三重四極桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀，美國安捷倫科技有限公司（型號：Agilent 6545 LC/QTOF/MS）；電子分析天平，德國賽多利斯公司（型號：BT 25S）；臺式超聲波清洗機，美國Branson 公司（型號：CPX 5800HC）；離心機，上海菲恰爾分析儀器有限公司（型號：SF-TGL-16）；超純水系統(tǒng)，美國密理博公司（型號：Milli-Q Advantage A10）；高效液相色譜柱，日本島津株式會社（型號：Shim-pack GIST C18-AQ， 4.6 mm×250 mm， 5 μm）；超高效液相色譜柱，美國沃特世公司（型號：ACQUITY UPLC BEH C18， 2.1 mm×100 mm， 1.7 μm）。

1.2 試藥 對照品：細(xì)辛醛、N-反式阿魏酰酪胺、尿苷、鳥苷、腺苷，上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司（批號分別為ST79700120、ST22720105、ST11520120、ST55670120、ST09400120）；β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚，中國食品藥品檢定研究院（批號分別為YJ-112018、YJ-100298）。

對照藥材：石菖蒲，中國食品藥品檢定研究院（批號：121098-201807）。

配方顆粒：水提后加入環(huán)糊精包合揮發(fā)油制備的石菖蒲配方顆粒，廠家A（S1～S10）；直接水提制備的石菖蒲配方顆粒，廠家A（S11～S20）；直接水提制備的石菖蒲配方顆粒，廠家B（S21～S23）。

甲醇，美國Thermo Fisher Scientific 公司（色譜純）；磷酸，迪馬科技有限公司（色譜純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 整體特征圖譜研究

2.1.1 參照物溶液的制備 取石菖蒲對照藥材粉末約2 g，置具塞錐形瓶中，精密稱定，精密加入75%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用75%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，離心10 min（6 000 r/min），取上清，即得。另取β-細(xì)辛醚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.3 mg 的對照品參照物溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，取粉末約0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密稱定，精密加入75%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用75%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，離心10 min（6 000 r/min），取上清，即得。

2.1.3 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm， 1.7 μm）；柱溫：35 ℃；流動相：甲醇（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～22 min，5%→45%A；22～25 min，45%→50%A；25～35 min，50%A）；流速：0.4 mL/min；進樣量：1 μL；檢測波長 ：280 nm。實驗結(jié)果見圖1。

圖1 石菖蒲混合對照品（A）、S1～S10配方顆粒（B，共有模式圖）和S11配方顆粒（C）超高效液相色譜圖

2.1.4 特征峰的指認(rèn)與確定 特征圖譜共標(biāo)定9 個特征峰。以對照品對供試品的色譜峰進行指認(rèn)，峰3為細(xì)辛醛，峰4 為N-反式阿魏酰酪胺，峰6 為β-細(xì)辛醚，峰9 為α-細(xì)辛醚；其中峰6 的峰面積較大，保留時間居中，標(biāo)記為S 峰。計算各特征峰與S 峰的相對保留時間，其相對保留時間應(yīng)在規(guī)定值的±10%之內(nèi)。規(guī)定值為0.09（峰1）、0.11（峰2）、0.58（峰3）、0.71（峰4）、0.92（峰5）、1.03（峰7）、1.05（峰8）以及1.07（峰9）。

2.1.5 方法學(xué)考察

2.1.5.1 精密度實驗 取同一批石菖蒲配方顆粒樣品（S4），按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣6次，注入液相色譜儀，測定。以β-細(xì)辛醚為參照峰，計算各共有峰相對保留時間的RSD為0.01%～0.74%。各共有峰的相對峰面積的RSD為0.43%～2.25%。這說明特征圖譜中色譜峰的表達(dá)基本一致，儀器的精密度良好。

2.1.5.2 重復(fù)性實驗 取同一批次石菖蒲配方顆粒樣品（S4），按照“2.1.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，注入液相色譜儀，測定。以β-細(xì)辛醚為參照峰，計算各共有峰相對保留時間的RSD為0.10%～1.85%，各共有峰相對峰面積的RSD為0.62%～4.14%。這表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.5.3 穩(wěn)定性實驗 取同一批次石菖蒲配方顆粒樣品（S4），按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，于不同時間（0、2、4、8、12、24、48 h）進樣，測定。以β-細(xì)辛醚為參照峰，計算各共有峰相對保留時間的RSD為0.02%～0.24%，各共有峰相對峰面積的RSD為0.65%～4.23%。這表明供試品在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 特征圖譜的建立以及相似度分析 按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液并進樣分析，得到10 批樣品（S1～S10）的液相色譜圖。將色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012 版”軟件，選定9 個特征峰進行多點校正，按中位數(shù)法自動匹配生成石菖蒲配方顆粒對照圖譜（R）。10 批石菖蒲配方顆粒與對照圖譜相似度在0.994～1.000之間，10批配方顆粒色譜疊加圖見圖2，相似度計算結(jié)果見表1。S11～S23 為水提制備未加入環(huán)糊精包合的樣品，不適用于該特征圖譜，故未加入分析。

表1 10批石菖蒲配方顆粒特征圖譜相似度

圖2 石菖蒲配方顆粒10批顆粒樣品和對照圖譜（R）疊加特征圖譜

2.2 核苷類成分特征圖譜的建立

2.2.1 參照物溶液的制備 取石菖蒲對照藥材粉末約2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入 25 mL 超純水，密塞，稱定質(zhì)量，回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用超純水補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。另取腺嘌呤、尿苷、鳥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各含10 μg 的混合溶液，作為對照品參照物溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）45 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用25%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，離心10 min（6 000 r/min），取上清，即得。

2.2.3 色譜條件 色譜柱：SHIMADZU Shim-pack GIST C18-AQ（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流動相：甲醇（A）- 0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～15 min，0%→3%A；15～17 min，3%→4%A；17～22 min，4%→9%A；22～30 min，9%→12%A；30～40 min，12%A）；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：35 ℃。檢測波長：260 nm。實驗結(jié)果見圖3。

圖3 混合對照品（A）、石菖蒲配方顆粒樣品特征圖譜共有模式圖（B）和陰性樣品（C）色譜圖

2.2.4.1 對照品指認(rèn) 特征圖譜共標(biāo)定8 個特征峰。以對照品對供試品色譜峰進行指認(rèn)，峰2 為尿苷，峰3為腺苷，峰5 為鳥苷；其中峰5 保留時間居中，周圍干擾小，標(biāo)記為S 峰。計算各特征峰與S 峰的相對保留時間，其相對保留時間應(yīng)在規(guī)定值的±10%之內(nèi)。規(guī)定值為0.26（峰1）、0.64（峰2）、0.72（峰3）、0.82（峰4）、1.24（峰6）、1.37（峰7）以及1.60（峰8）。

2.2.4.2 高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿飛行時間質(zhì)譜（HPLC-Q-TOF-MS）分析 （1）液相工作條件：SHIMADZU Shim-pack GIST C18-AQ（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動相：甲醇（A）- 1%甲酸（B），梯度洗脫（0～15 min，0%→1%A；15～17 min，1%→4%A；17～22 min，4%→9%A；22～30 min，9%→12%A；30～40 min，12%A）；流速：1 mL/min；進樣量：5 μL。檢測波長：260 nm。

（2）質(zhì)譜工作條件：Agilent Dual AJS ESI 離子源，干燥氣溫度300 ℃，干燥氣體流速8 L/min，霧化器壓力241 kPa，毛細(xì)管電壓3 500 V，碰撞電壓140 V。質(zhì)譜選用一級質(zhì)譜（MS）模式，采用正、負(fù)離子模式分別進行掃描，質(zhì)量掃描范圍50～1 000m/z。數(shù)據(jù)采用Agilent Mass Hunter-Data Acquisition10.0軟件采集。

按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述條件進樣，采用Agilent MussHunter Qualitative Analysis10.0軟件對供試品進行質(zhì)譜分析。結(jié)合對照品的保留時間、準(zhǔn)分子離子、特征碎片，并與文獻數(shù)據(jù)對比分析，結(jié)果見表2。

表2 石菖蒲配方顆粒中核苷類成分高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿飛行時間質(zhì)譜（HPLC-Q-TOF-MS）分析

2.2.5 方法學(xué)考察

2.2.5.1 精密度實驗 取同一批次石菖蒲配方顆粒樣品（S4），按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣6 次，注入液相色譜儀，測定。以鳥苷色譜峰為參照峰，計算各共有峰相對保留時間的RSD為0.03%～0.04%。各共有峰相對峰面積的RSD為0.42%～2.94%。這表明特征圖譜中色譜峰的表達(dá)基本一致，儀器的精密度良好。

2.2.5.2 重復(fù)性實驗 取同一批次石菖蒲配方顆粒樣品（S4），按照“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，注入液相色譜儀，測定。以鳥苷為參照峰，計算各共有峰相對保留時間的RSD為0.10%～1.85%，各共有峰相對峰面積的RSD為1.39%～3.53%。這表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.5.3 穩(wěn)定性實驗 取同一批次石菖蒲配方顆粒樣品（S4），按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，于不同時間點（0、2、4、8、12、24、48 h）進樣，測定。以鳥苷為參照峰，計算各共有峰相對保留時間的RSD為0.66%～4.03%，各共有峰相對峰面積的RSD為0.32%～0.48%。這表明供試品在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

多糖是淮山的主要生物活性物質(zhì)之一，能提高機體免疫力[5]。許效群等[6]報道，中、高劑量的淮山多糖可以顯著提高小鼠免疫臟器指數(shù)和吞噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)以及血清溶血素水平，因此認(rèn)為淮山多糖具有較高的免疫增強活力。Choi等[7]對淮山粘多糖的體外免疫調(diào)節(jié)研究發(fā)現(xiàn)，10 μg/mL的淮山粘多糖(YMP)能促進淋巴細(xì)胞干擾素(IFN-γ)的產(chǎn)生、促進小鼠抗白血病細(xì)胞的增殖，認(rèn)為淮山粘多糖可以作為免疫活性多糖的來源。

2.2.6 核苷類成分特征圖譜的建立以及相似度分析按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液并進樣分析。得到23 批樣品的特征圖譜。將23 批石菖蒲配方顆粒樣品的色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012 版”軟件，選定8 個特征峰進行多點校正，按中位數(shù)法自動匹配生成石菖蒲配方顆粒對照圖譜（R）（圖4）。23批石菖蒲配方顆粒與對照圖譜相似度在0.931～0.972之間（表3）。

表3 23批石菖蒲配方顆粒核苷類成分特征圖譜相似度

圖4 23批石菖蒲配方顆粒樣品特征圖譜和對照圖譜（R）疊加圖

2.2.7 模式識別 相似度實驗結(jié)果表明，10 批樣品（S1～S10，制備工藝1）的整體特征圖譜和23 批樣品（S1～S10，制備工藝1；S11～23，制備工藝2）水溶性成分特征圖譜與對應(yīng)的對照圖譜相似度均＞0.931，表明兩種制備工藝下的石菖蒲配方顆粒樣品質(zhì)量穩(wěn)定性均良好。本部分采用模式識別軟件對數(shù)據(jù)進一步分析，探討工藝、廠家、批次等參數(shù)對配方顆粒質(zhì)量穩(wěn)定性的影響，為后期大批量生產(chǎn)提供指導(dǎo)。使用Origin Pro 2022軟件，以各特征峰峰面積為變量，進行主成分分析（PCA）（圖5A）。結(jié)果顯示，第一主成分貢獻率為63.2%，第二主成分貢獻率為28.2%，累積貢獻率為91.4%，表明2 個主成分可以代表該特征圖譜中不同批次間的最大方差方向，且樣本聚集度較好，表明實驗結(jié)果數(shù)據(jù)可靠。23 批石菖蒲配方顆粒主要分為3 類，其中S1～S10為制備工藝1，廠家A；S11～S20為制備工藝2，廠家A；S21～S23為制備工藝2，廠家B。不同廠家與不同制備工藝可完全區(qū)分。此外，在第一主成分上（PC1），相同廠家不同制備工藝間的差距較相同制備工藝不同廠家的差距大，提示制備工藝是影響配方顆粒質(zhì)量的首要因素。

圖5 石菖蒲配方顆粒特征圖譜中核苷類成分PCA分析得分圖（A）和峰面積聚類熱圖（B）

同時，以各特征峰峰面積為變量繪制聚類熱圖，計算各樣品的歐氏距離，選擇最合適的類間距離（最短距離、最長距離、中間距離、重心距離和離差平方）聚類，分析結(jié)果（圖5B）同樣顯示制備工藝對產(chǎn)品差異影響最大，兩種制備工藝樣品S1～S10 和S11～S23 分別聚為一類；其次是廠家，S11～S20 聚為一類，S21～S23 聚為一類，與PCA分析結(jié)果一致。

2.3 含量測定

2.3.1 對照品溶液的制備 取“2.2.1”項下對照品參照物溶液制備方法。

2.3.2 供試品溶液的制備 取“2.2.2”項下供試品溶液。

2.3.3 色譜條件 同“2.2.3”項下。

2.3.4 方法學(xué)考察

2.3.4.1 專屬性實驗 取環(huán)糊精樣品，按“2.2.2”項下方法制備陰性樣品溶液。取石菖蒲配方顆粒供試品溶液、陰性樣品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件進行分析，記錄色譜圖，結(jié)果見圖3。供試品色譜在與陰性樣品相對應(yīng)的保留時間處無相同的色譜峰，表明該方法的專屬性良好。

2.3.4.2 線性關(guān)系考察 取尿苷對照品10 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加25%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成尿苷濃度為0.104 3 g/L 的對照品儲備溶液。精密吸取不同體積的對照品儲備溶液，加25%甲醇稀釋制成不同濃度的系列溶液，按“2.2.3”項下色譜條件進樣分析，分別以對照品的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=22 960X+0.397 7，在2.086～104.300 mg/L 的濃度范圍內(nèi)，R2=1.000。以信噪比為3∶1 確定尿苷的檢測限（LOD），LOD 為8.419 μg/L（n=3）；以信噪比為10∶1確定尿苷的定量限（LOQ），LOQ為86.366 μg/L（n=3）。

2.3.4.3 精密度實驗 取同一批次石菖蒲配方顆粒樣品（S4），按照“2.2.2”項下方法制備得到供試品溶液，連續(xù)進樣6 次測定，結(jié)果尿苷含量的RSD是2.79%，表明儀器的精密度良好。

2.3.4.4 重復(fù)性實驗 取同一批次石菖蒲配方顆粒樣品（S4），按照“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，注入液相色譜儀，測定。結(jié)果尿苷的平均含量為0.056%，RSD是2.29%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4.5 穩(wěn)定性實驗 取同一批次石菖蒲配方顆粒樣品（S4），按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，于不同時間（0、2、4、8、12、24、48 h）進樣，測定。結(jié)果尿苷含量的RSD是0.96%，表明供試品溶液的穩(wěn)定性良好，在48 h內(nèi)檢測對結(jié)果無影響。

2.3.4.6 加樣回收率實驗 精密稱取已測含量的同一批次石菖蒲配方顆粒樣品（S4）0.25 g，分別加入已知含量50%、100%、150%水平的尿苷對照品（0.075、0.150、0.225 mg），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件測定，結(jié)果，尿苷的回收率在97.29%～102.48% 之間，RSD＜3%，說明該測定方法可行。

2.3.5 樣品含量測定 取不同廠家和批次的石菖蒲配方顆粒樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件測定，計算石菖蒲配方顆粒中尿苷的含量。測定結(jié)果見表4。

表4 石菖蒲配方顆粒中尿苷的含量測定結(jié)果（n=2）

2.4 質(zhì)量傳遞規(guī)律

2.4.1 揮發(fā)性成分質(zhì)量傳遞規(guī)律 取同一批次（S1）對應(yīng)的石菖蒲飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒以及對照藥材，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液。按“2.1.3”項下色譜條件測定，對比石菖蒲飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒以及對照藥材圖譜，結(jié)果見圖6。含環(huán)糊精包合的配方顆粒與石菖蒲飲片圖譜具有高度一致性。

圖6 配方顆粒（A，S1）與其對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)湯劑（B）、飲片（C）和對照藥材（D）特征圖譜

2.4.2 核苷類成分特征圖譜質(zhì)量傳遞規(guī)律 取3批（S1～S3）配方顆粒對應(yīng)的石菖蒲飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。按“2.2.3”項下色譜條件測定，測定結(jié)果導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012 版”軟件，選定5 個共有特征峰進行多點校正，3 批石菖蒲配方顆粒和其對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)湯劑、飲片與對照圖譜相似度在0.905～0.991之間（表5）。根據(jù)1 g 配方顆粒含有7.5 g 原藥或湯劑的比例，計算石菖蒲飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒中尿苷的含量和轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表6、表7。另取石菖蒲配方顆粒對應(yīng)飲片與對照藥材粉末約2 g，精密稱定，加入25 mL 純水，稱定質(zhì)量，回流1 h，冷卻至室溫，補足質(zhì)量，混勻，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按“2.2.3”項下色譜條件測定，對比配方顆粒、飲片及對照藥材，結(jié)果見圖7。

表5 石菖蒲配方顆粒（S1～S3）與對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)湯劑、飲片特征圖譜相似度

表6 石菖蒲飲片和配方顆粒（S1～S3）中尿苷的含量和轉(zhuǎn)移率（%）

表7 石菖蒲湯劑和配方顆粒（S1～S3）中尿苷的含量和轉(zhuǎn)移率（%）

圖7 配方顆粒（A，S1）與其對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)湯劑（B）、飲片（C）和對照藥材（D）核苷類成分特征圖譜

3 討論

3.1 整體表征特征圖譜條件的選擇 在建立石菖蒲配方顆粒整體表征特征圖譜過程中發(fā)現(xiàn)，UPLC 法可以在較短的時間內(nèi)達(dá)到更好的分離效果。在供試品的制備方法中，采用單因素考察方法考察了不同的提取溶劑（水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇）、不同提取方式（回流、超聲）、不同提取時間（15、30、45、60 min）和不同提取溶劑用量（1∶20、1∶50、1∶100）以確定最佳供試品制備方案。研究考察了不同流速（0.3、0.4、0.5 mL/min）、不同柱溫（33、35、37 ℃）、不同廠家色譜柱（DIKMA Endeavorsil C18、Welch Xtimate UHPLC C18、Waters ACQUITY HSS T3）、不同流動相酸度（0.05%、0.10%、0.15%磷酸）對色譜行為的影響，結(jié)果表明所建立的方法耐受性良好。在190～400 nm 紫外區(qū)，含量較高的β-細(xì)辛醚和α- 細(xì)辛醚在254 nm 處有最大吸收，其余3 個特征峰在280 nm 附近吸收更強，為了提高各特征峰的整體可測性，選擇280 nm 作為石菖蒲配方顆粒 UPLC特征圖譜的檢測波長。

3.2 核苷類成分特征圖譜條件的選擇 在使用HPLC法建立石菖蒲配方顆粒質(zhì)量評定標(biāo)準(zhǔn)的過程中發(fā)現(xiàn)，核苷類成分極性較大，常規(guī)C18色譜柱無法將其分開，因此選擇了可以承受純水相洗脫的C18-AQ 色譜柱進行分析。在供試品的制備方法中，考察了不同的提取溶劑（水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、100%甲醇）、不同提取方式（回流、超聲）、不同提取時間（15、30、45、60 min）和不同提取溶劑用量（1∶20、1∶50、1∶100），結(jié)果表明25%甲醇與水提取所得尿苷含量相差不大?？紤]到25%甲醇保存的樣品穩(wěn)定性更好，故選擇0.5 g 樣品以25%甲醇為提取溶劑，1∶50為提取溶劑用量，超聲45 min為提取方法。本研究考察了不同流速（0.9、1.0、1.1 mL/min）、不同柱溫（33、35、37 ℃）、不同廠家色譜柱（SHIMADZU Shim-pack GIST C18-AQ、Nano Micro Unisil 5-120 C18AQ、Welch Ultimate LP-C18）、不同流動相酸度（0.08%、0.10%、0.12%磷酸）對色譜行為的影響，結(jié)果表明所建立的方法耐受性良好。參照物鳥苷的最大吸收峰為254 nm，定量指標(biāo)尿苷和其他特征峰均在260 nm附近有較大吸收，因此選擇260 nm作為檢測波長。

3.3 含量測定 有學(xué)者［16］研究發(fā)現(xiàn)核苷類成分穩(wěn)定性不佳，石菖蒲中可能存在一種酶，使核苷類成分在提取過程中發(fā)生一定的轉(zhuǎn)化，回流提取穩(wěn)定性更好。本實驗結(jié)果顯示，石菖蒲配方顆粒特征圖譜和尿苷含量測定方法建立過程中核苷類成分鳥苷、尿苷和腺苷的穩(wěn)定性均良好，推測其原因可能是由于在配方顆粒制備流程中，加熱煎煮過程已破壞了酶的活性，與上述報道一致。實驗發(fā)現(xiàn)，核苷類成分的保留順序與文獻［16］中并不一致。經(jīng)過對大量核苷類成分的色譜分析文獻的對比分析和實驗驗證后發(fā)現(xiàn)，色譜柱的類型以及流動相酸度、流動相種類都會對腺苷的保留時間造成較大影響，這提示在核苷類成分的分析實驗中應(yīng)充分平衡色譜柱，確保流動相新鮮配制，以提高方法的重復(fù)性。

實驗中發(fā)現(xiàn)特征峰6 在配方顆粒對應(yīng)的飲片中存在，但在對照藥材中未檢測出，故使用不同產(chǎn)地采集的石菖蒲樣品做進一步比較，發(fā)現(xiàn)特征峰6在部分產(chǎn)地的石菖蒲樣品中出現(xiàn)，結(jié)果見圖8。結(jié)合“2.2.7”模式識別結(jié)果，提示不同產(chǎn)地的藥材投料會對配方顆粒質(zhì)量形成影響，在控制配方顆粒的質(zhì)量中應(yīng)注重原藥材、飲片的質(zhì)量控制。特征峰7、8 在對應(yīng)飲片和對照藥材中均未檢出，應(yīng)是在生產(chǎn)制備過程中新產(chǎn)生的成分，且在不同制備工藝下峰面積存在較大差異，但由于特征峰8在質(zhì)譜中響應(yīng)較低，未獲得鑒定，有待進一步研究。

圖8 不同來源石菖蒲樣品HPLC色譜圖