趙 鑫，谷麗華，楊 莉，王崢濤

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥新資源與質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（上海 201203）；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)交叉科學(xué)研究院（上海 201203）；3.上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心（上海 201203）

茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有利水滲濕、健脾寧心的功效［1-2］。茯苓中富含多糖、三萜酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、揮發(fā)油和甾醇等多種成分，其中多糖和三萜酸是其主要活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和利尿等多種作用［3-5］。茯苓在中藥臨床與配伍應(yīng)用中十分廣泛，2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）一部中的成方制劑共收錄1 607 種，其中含有茯苓的共有252種（如六味地黃丸、四君子丸、桂枝茯苓丸等），約占16%。因此提升茯苓藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)十分重要。

中藥作為一個(gè)多成分復(fù)雜體系，檢測(cè)單一成分難以全面反映藥材內(nèi)在質(zhì)量，多指標(biāo)含量測(cè)定已成為發(fā)展趨勢(shì)。但由于多成分測(cè)定使對(duì)照品成本增加，因此基于單外標(biāo)校正測(cè)定多指標(biāo)成分含量的方法，即一測(cè)多評(píng)法（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）被廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制［6-7］。相對(duì)校正因子（relative correction factor，RCF）是QAMS的關(guān)鍵參數(shù)，直接影響到QAMS的定量準(zhǔn)確度。

斜率校正是計(jì)算RCF 的一種方法，該方法以線性斜率為計(jì)算參數(shù)，測(cè)算校正因子較多點(diǎn)校正法更為簡(jiǎn)便，且在結(jié)果上與外標(biāo)測(cè)定法無(wú)顯著差異［8］。因此，本研究建立斜率校正一測(cè)多評(píng)法測(cè)定茯苓中3-O-乙?；?16α-羥基-氫化松苓酸、去氫茯苓酸和茯苓酸的含量，以期為提升茯苓藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器 Agilent 高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司（型號(hào)：Agilent 1260 infinity Ⅱ、Agilent 1260）；Waters 高效液相色譜儀，美國(guó)Waters 公司（型號(hào)：E2695）；電子分析天平，北京賽多利斯公司［型號(hào)：BT25S 型（十萬(wàn)分之一）、BSA124S-CW 型（萬(wàn)分之一）］；超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司（型號(hào)：KQ-250DB）；超聲純水儀，上海澤權(quán)儀器設(shè)備有限公司（型號(hào)：ZP15D1）。

1.2 試劑與藥材 茯苓酸（純度＞98%），成都普菲德生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：JOT-10611）；去氫茯苓酸（純度＞98%），成都格利普生物科技有限公司（批號(hào)：JOT-10749）；3-O-乙酰基-16α-羥基-氫化松苓酸（純度＞98%）；成都德思特生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：DST210811-012）；色譜純乙腈、甲醇、磷酸，均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（批號(hào)分別為20210804、20210906、J5640045）；水為超純水。

20批茯苓樣品信息見(jiàn)表1，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)吳立宏研究員鑒定為茯苓Poria cocos（Schw.） Wolf 的干燥菌核。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 以Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，流動(dòng)相：乙腈-0.1 %磷酸水溶液（84∶16）；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取3-O-乙?；?16α-羥基-氫化松苓酸、去氫茯苓酸和茯苓酸對(duì)照品適量，精密稱定，分別置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得到質(zhì)量濃度分別為0.214 0、0.244 4、0.298 8 g/L 的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，混合均勻，得到對(duì)照品混合溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取茯苓粉末（過(guò)4 號(hào)篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇溶液50 mL，稱定重量，超聲處理30 min（功率250 w，頻率40 kHz），放冷，置室溫后再次稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状歼m量使溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL 容量瓶中，定容，搖勻后過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察 取供試品、對(duì)照品混合溶液、甲醇溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。各待測(cè)成分色譜峰分離度均大于1.5，達(dá)到基線分離，表明該方法專屬性良好。

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品混合溶液，加甲醇逐級(jí)稀釋，配制一系列濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積（Y，mAU）對(duì)濃度（X，mg/L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性關(guān)系結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 3種被測(cè)成分的線性關(guān)系、檢測(cè)限和定量限

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取同一批茯苓樣品（FL-10）粉末1.0 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次并記錄色譜峰峰面積，結(jié)果3-O-乙?；?16α-羥基-氫化松苓酸、去氫茯苓酸和茯苓酸峰面積的RSD分別為1.51 %、1.69 %和0.13 %，表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取同一批茯苓樣品（FL-10）粉末6 份，每份約1.0 g，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果3-O-乙?；?16α-羥基-氫化松苓酸、去氫茯苓酸和茯苓酸的平均含量分別為0.142 4、0.231 1、0.694 3 mg/g，RSD分別為1.44 %、1.19 %和0.65 %，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液適量，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定并記錄色譜峰峰面積，結(jié)果3-O-乙?；?16α-羥基-氫化松苓酸、去氫茯苓酸和茯苓酸峰面積的RSD分別為1.68%、1.80%和0.21%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 加樣回收試驗(yàn) 分別取3-O-乙?；?16α-羥基-氫化松苓酸、去氫茯苓酸和茯苓酸對(duì)照品儲(chǔ)備液4、6和12 mL 置25 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得到質(zhì)量濃度分別為0.034 2、0.058 7、0.143 4 g/L 的混合對(duì)照品溶液。取已知含量的茯苓樣品（FL-10）粉末9 份，每份約0.5 g，精密稱定，分別置錐形瓶中，精密加入混合對(duì)照品溶液1、2、3 mL（相當(dāng)于供試品中各指標(biāo)成分含量的50%、100%、150%），每個(gè)梯度各3 份；分別按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。經(jīng)計(jì)算得到3-O-乙酰基-16α-羥基-氫化松苓酸、去氫茯苓酸和茯苓酸的平均回收率分別為100.32%、106.12%、107.16%，RSD分別為4.16%、2.08%和2.04%。

表3 茯苓含量測(cè)定加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.5 耐用性考察

2.5.1 不同色譜柱考察 取同一供試品溶液（FL-10），分別使用Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Shim-pack GIST C18-AQ（4.6 mm×250 mm，5 μm）、CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）3 根色譜柱進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示 3-O-乙?；?16α-羥基-氫化松苓酸、去氫茯苓酸和茯苓酸含量的RSD分別為2.00%、0.36%、0.56%，3根色譜柱對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較小，表明方法耐用性良好。

2.5.2 不同儀器考察 取同一供試品溶液（FL-10），比較儀器Agilent 1260 infinity Ⅱ、Agilent 1260 及Waters E2695 對(duì)茯苓含量測(cè)定的影響。結(jié)果3-O-乙?；?16α-羥基-氫化松苓酸、去氫茯苓酸和茯苓酸含量的RSD分別為2.84%、1.95%、0.56%，表明不同儀器對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較小。

2.5.3 不同流動(dòng)相pH 考察 取同一供試品溶液，分別以0.05%、0.10%和0.15%的磷酸作為流動(dòng)相B 進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果3-O-乙酰基-16α-羥基-氫化松苓酸、去氫茯苓酸和茯苓酸含量的RSD分別為0.51%、1.16%、0.20%，表明流動(dòng)相的磷酸濃度在0.05%～0.15%范圍均可進(jìn)行試驗(yàn)。

2.5.4 不同流速考察 取同一供試品溶液（FL-10），分別在0.6 mL/min、0.8 mL/min 和1.0 mL/min 流速下比較茯苓含量測(cè)定結(jié)果，結(jié)果3-O-乙?；?16α-羥基-氫化松苓酸、去氫茯苓酸和茯苓酸含量的RSD分別為0.92%、1.32%、0.18%，表明在0.6～1.0 mL/min 的流速下均可進(jìn)行試驗(yàn)，方法耐用性良好。

2.5.5 不同柱溫考察 取同一供試品溶液（FL-10），分別在28 ℃、30 ℃和32 ℃柱溫條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果3-O-乙?；?16α-羥基-氫化松苓酸、去氫茯苓酸和茯苓酸含量的RSD分別為0.55%、0.16%、1.55%，表明在28 ℃～32 ℃的柱溫下均可進(jìn)行試驗(yàn)。

2.5.6 不同進(jìn)樣量考察 取同一供試品溶液（FL-10），分別進(jìn)樣5 μL、10 μL 和15 μL 進(jìn)行分析，結(jié)果3-O-乙?；?16α-羥基-氫化松苓酸、去氫茯苓酸和茯苓酸含量的RSD分別為3.31%、3.36%、0.81%，結(jié)果表明進(jìn)樣量對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯差異，表明方法耐用性良好。

2.5.7 不同波長(zhǎng)考察 取同一供試品溶液（FL-10），分別在208 nm、210 nm及212 nm下檢測(cè)，結(jié)果3-O-乙?；?16α-羥基-氫化松苓酸、去氫茯苓酸和茯苓酸含量的RSD分別為0.04%、1.64%、0.06%，表明所建立的分析方法在208～212 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)檢測(cè)耐用性良好。

2.6 校正因子計(jì)算 根據(jù)“2.4.2”項(xiàng)下所得到的各化合物線性曲線的斜率，代入fs/k的計(jì)算公式。以茯苓酸為內(nèi)參（s），計(jì)算茯苓酸對(duì)3-O-乙?；?16α-羥基-氫化松苓酸的校正因子f1，茯苓酸對(duì)去氫茯苓酸的校正因子f2，分別為0.71 和1.43。斜率校正因子計(jì)算公式為：fs/k=as/ak。其中as為茯苓酸內(nèi)參物的線性方程斜率，ak為被測(cè)組分k的線性方程斜率。

2.7 不同儀器及色譜柱對(duì)校正因子的影響 將“2.4.2”項(xiàng)下的系列濃度對(duì)照品溶液分別精密吸取10 μL，分別采用Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Shim-pack GIST C18-AQ（4.6 mm×250 mm，5 μm）、CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）3 根色譜柱，在Agilent 1260 infinity Ⅱ、Agilent 1260 及Waters E2695高效液相色譜儀上進(jìn)樣檢測(cè)，求算以茯苓酸為內(nèi)參下的2種成分的fs/k，結(jié)果見(jiàn)表4及表5。結(jié)果表明，校正因子在使用不同儀器及不同色譜柱時(shí)耐用性良好。

表4 不同色譜柱的校正因子

表5 不同儀器的校正因子

2.8 相對(duì)保留時(shí)間法預(yù)測(cè)待測(cè)成分出峰位置 待測(cè)色譜峰可通過(guò)相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行定位；計(jì)算公式為：RT=tk/ts。ts為茯苓酸內(nèi)參物的保留時(shí)間，tk為被測(cè)組分k的保留時(shí)間。

分別采用3 臺(tái)不同儀器（Agilent 1260 infinity Ⅱ、Agilent 1260 及Waters E2695）及不同廠家的色譜柱（Agilent ZORBAX SB-C18、Shim-pack GIST C18-AQ、CAPCELL PAK C18）在“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄3 個(gè)被測(cè)成分的保留時(shí)間，計(jì)算3-O-乙酰基-16α-羥基-氫化松苓酸的相對(duì)保留時(shí)間（RT1）及去氫茯苓酸的相對(duì)保留時(shí)間（RT2），測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6及表7。各儀器及色譜柱測(cè)定結(jié)果RSD均小于3%，表明相對(duì)保留時(shí)間在不同儀器及色譜柱之間的重復(fù)性良好，可用于待測(cè)成分的色譜峰定位。

表6 不同色譜柱的相對(duì)保留值

表7 不同儀器的相對(duì)保留值

2.9 一測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法比較 采用對(duì)照品外標(biāo)法及一測(cè)多評(píng)法分別測(cè)定20 批茯苓中3-O-乙?；?16α-羥基-氫化松苓酸、去氫茯苓酸和茯苓酸的含量（mg/g），結(jié)果見(jiàn)表8。一測(cè)多評(píng)法測(cè)定結(jié)果與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異［相對(duì)誤差（RE）＜5%］。

表8 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法結(jié)果比較（n=2）

3 討論

3.1 提取方式的優(yōu)化 為全面評(píng)價(jià)茯苓的藥材質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)對(duì)茯苓樣品的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。對(duì)不同提取溶劑（甲醇、70%甲醇、乙醇、乙酸乙酯）、不同料液比（1∶30、1∶50、1∶100）、不同提取方法及提取時(shí)間（超聲30 min、45 min、60 min；回流1 h、1.5 h、2 h）進(jìn)行了系統(tǒng)考察。發(fā)現(xiàn)提取溶劑對(duì)茯苓中3 個(gè)三萜酸成分的提取具有顯著影響，甲醇提取效率最高，其他參數(shù)對(duì)提取結(jié)果影響不大，因此選擇甲醇作為最終提取溶劑，同時(shí)從實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便性考慮選擇超聲30 min為提取方案。

3.2 內(nèi)參物的選擇 茯苓酸是茯苓中的主要活性成分之一［9］，在茯苓中含量較高，該對(duì)照品相對(duì)價(jià)廉易得；在本實(shí)驗(yàn)條件下茯苓酸與其他被測(cè)成分分離度良好，達(dá)到含量測(cè)定要求［分離度（R）＞1.5］，出峰位置適中，符合內(nèi)參物的選擇原則［10］，因此選擇茯苓酸作為內(nèi)參物能夠體現(xiàn)“一測(cè)多評(píng)法”實(shí)用和準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

3.3 斜率校正法的優(yōu)勢(shì) 中藥多指標(biāo)分析是中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)現(xiàn)代化發(fā)展的必然趨勢(shì)，但大量對(duì)照品的制備分離難度嚴(yán)重制約了其發(fā)展。一測(cè)多評(píng)法的出現(xiàn)為中藥復(fù)雜體系的品質(zhì)評(píng)價(jià)提供了新策略［11］。它在中藥材和成方制劑中的應(yīng)用研究已經(jīng)很多［12-15］，其中也包括對(duì)茯苓中三萜酸成分的含量測(cè)定的應(yīng)用［16-17］。多點(diǎn)校正法依然是一測(cè)多評(píng)法校正因子的主要計(jì)算方法，但多點(diǎn)校正法在使用中存在一定局限性，易產(chǎn)生特殊點(diǎn)的偏差從而影響整個(gè)計(jì)算結(jié)果［18］。斜率校正法通過(guò)線性回歸擬合，避免了可能存在的特殊點(diǎn)偏差，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作和計(jì)算的同時(shí)，計(jì)算結(jié)果也更加科學(xué)準(zhǔn)確［19］。目前針對(duì)茯苓中三萜酸成分含量測(cè)定開(kāi)發(fā)的方法存在色譜條件復(fù)雜、分析時(shí)間較長(zhǎng)等弊端［20-22］。本研究采用等度洗脫的色譜條件在較短時(shí)間內(nèi)完成茯苓中3 種三萜酸成分的基線分離。

3.4 總結(jié) 本實(shí)驗(yàn)建立的“斜率校正一測(cè)多評(píng)法”用于測(cè)定茯苓中3個(gè)三萜酸成分的含量，并考察了不同儀器和不同色譜柱等關(guān)鍵影響因素，結(jié)果顯示一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法的含量測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異，表明該一測(cè)多評(píng)方法可用于茯苓中三萜酸類成分的含量測(cè)定，為茯苓藥材質(zhì)量控制提供了科學(xué)簡(jiǎn)便的方法。