董 莉，楊燕玲，鄭鈺凡，戎靖楓

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院心血管內(nèi)科（上海 201203）；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院心血管病研究室（上海 201203）

近年來，盡管在疾病診斷、治療以及更好地控制危險(xiǎn)因素方面取得了顯著進(jìn)展，但缺血性心臟病因其高發(fā)病率和高病死率，仍是主要的死亡原因之一，嚴(yán)重威脅人類健康［1］。急性心肌梗死患者借助溶栓術(shù)、經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)可以挽回生命，但一些患者術(shù)后卻發(fā)生了心功能不全、血壓驟降、心律不齊甚至猝死，在恢復(fù)血液灌注后，缺血區(qū)心肌的損傷反而比缺血期更加嚴(yán)重，這種現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI），也是導(dǎo)致缺血性心臟病患者傷殘甚至死亡的重要原因［2-5］。相關(guān)文獻(xiàn)［6］報(bào)道，氧化應(yīng)激是MIRI 重要的發(fā)病機(jī)制，可能會誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）和過氧化物酶體增殖活化受體γ 輔助活化因子-1α（PGC-1α）是氧化應(yīng)激通路上的重要蛋白。研究［7］表明，SIRT1 在心臟、大腦和其他實(shí)質(zhì)器官的缺血再灌注損傷中起著重要的保護(hù)作用；PGC-1α 在抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞抗氧化酶表達(dá)升高，提高抗氧化能力。

中醫(yī)藥在治療心血管疾病的同時(shí)能夠減少并發(fā)癥的發(fā)生，恢復(fù)機(jī)體的正常生理功能，增強(qiáng)抗病御邪能力，進(jìn)而達(dá)到降低致殘率、病死率的目的［8-9］。益心方是本課題組臨床經(jīng)驗(yàn)用方，有溫通陽氣、活血祛瘀之功效。本研究通過建立MIRI 大鼠模型，觀察益心方預(yù)處理對MIRI 的保護(hù)作用，同時(shí)探討其作用機(jī)制是否為通過SIRT1/PGC-1α 信號通路改善MIRI，減輕氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司上海分公司。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0011。動物使用許可證號：SCXK（滬）2020-0002。實(shí)驗(yàn)動物常規(guī)飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，室溫22～25 ℃，自然光照，自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。實(shí)驗(yàn)操作流程嚴(yán)格遵循上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的相關(guān)法規(guī)。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利與倫理委員會審查（倫理批準(zhǔn)號：PZSHUTCM220711019）。

1.1.2 藥物與試劑 實(shí)驗(yàn)用益心方中藥配方顆粒組成：黃芪15 g（批號：21067604），川芎12 g（批號：21087144），丹參12 g（批號：21046664），紅景天10 g（批號：19126704），當(dāng)歸9 g（批號：21077504），香附9 g（批號：21066854），桂枝6 g（批號：21056424）。以上中藥顆粒劑由江陰天江藥業(yè)有限公司提供，使用前用蒸餾水充分溶解、混勻，分裝編號后冷藏備用。

SIRT1 抑制劑sirtinol，上海源葉生物科技有限公司（批號：S80707）；肝素鈉注射液，賽諾菲制藥有限公司生產(chǎn)（批號：8S13N）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒，碧云天生物科技有限公司（批號：P0012）；肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、過氧化氫（H2O2）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒，南京建成生物工程研究所（批號分別為A032-1-1、BC0955、BC0025、BC3595、BC0170）；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司（批號：C1091）；二甲基亞砜（DMSO），德國Merck 公司（批號：D2650）；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC），北京蘭杰柯科技有限公司（批號：BS095）； SIRT1、PGC-lα、B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）蛋白、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 相關(guān)X（Bax）蛋白抗體，美國Affinity 公司（批號分別為DF6033、BF0402、AF6139、AF0120）；HRP 標(biāo)記山羊抗兔，美國Jackson公司（批號：111-035-003）。

1.1.3 主要儀器 離心機(jī)，美國Beckman 公司（型號：Avanti J-15R）；電泳及轉(zhuǎn)膜電源儀，美國Bio-Rad 公司（型號：170-3930）；凝膠成像系統(tǒng)，上海勤翔科技有限公司（型號：ChemiScope 6000）；酶標(biāo)儀，美國Bio Tek 公司（型號：Synergy H1）；高通量研磨儀，上海凈信科技有限公司（型號：JXFSTPRP-24L）；小動物呼吸機(jī)，深圳市瑞沃德生命科技有限公司（型號：R415）；動物心電圖機(jī)，深圳邦健生物醫(yī)療設(shè)備股份有限公司（型號：ECG-101G）；彩色多普勒超聲成像儀，上海玉研科學(xué)儀器有限公司（型號：X5 VET）。

1.2 分組與造模 將60 只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、心肌缺血再灌注組（模型組）、益心方預(yù)處理+心肌缺血再灌注組（益心方組）、益心方預(yù)處理+心肌缺血再灌注+SIRT1 抑制劑組（益心方+抑制劑組），每組15 只。術(shù)前12 h 禁食，異氟烷麻醉大鼠后仰臥位固定在手術(shù)臺上，氣管插管，連接呼吸機(jī)輔助通氣；于胸骨左側(cè)三、四肋間開胸，暴露心臟；結(jié)扎冠狀動脈左前降支，觀察心電圖的變化。以心電圖ST 段抬高≥0.1 mV，T 波高聳，結(jié)扎線以下部位出現(xiàn)心肌組織變白視為造模成功。結(jié)扎30 min后松開結(jié)扎線，恢復(fù)血供，ST段回落1/2以上，發(fā)白組織逐漸變紅即為再灌注成功［10］。

1.3 干預(yù) 中藥組給予益心方灌胃，劑量為6.84 g/kg（生藥量/體質(zhì)量，按照人和動物體表面積折算的臨床等效劑量比值換算［11］，大鼠用藥劑量是人的6.3 倍），每日1 次。使用前益心方以1.368 g/mL 的濃度配比溶于蒸餾水，益心方組和益心方+抑制劑組按10 mL/kg 的劑量連續(xù)灌胃7 d，其余各組灌胃等體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液。術(shù)前3 d 及術(shù)前20 min 益心方+抑制劑組按2 mg/kg 劑量尾靜脈注射SIRT1 抑制劑sirtinol，其余各組尾靜脈注射等體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液。

1.4 檢測指標(biāo)與方法

1.4.1 心電圖 造模前大鼠予異氟烷麻醉，仰臥位固定，連接呼吸機(jī)；消毒四肢及電極片，將電極片置于大鼠四肢末端，脫毛，開胸造模。分別記錄大鼠缺血前、缺血時(shí)和再灌注后標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。

1.4.2 心功能 再灌注24 h 后，將大鼠麻醉仰臥位固定于手術(shù)臺，連接彩色心臟多普勒超聲儀，測量各組大鼠的左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短百分率（LVFS）。至少檢測3 個連續(xù)、完整的心動周期，計(jì)算均值。

1.4.3 心肌病理形態(tài)學(xué)及心肌梗死面積 再灌注24 h后，各組隨機(jī)取3只大鼠心臟標(biāo)本，4%多聚甲醛溶液固定大鼠心臟，包埋后切成3 μm 厚的石蠟切片，蘇木精-伊紅（HE）染色法檢測大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)。HE 染色步驟按試劑盒說明書進(jìn)行操作，在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)的改變。

各組隨機(jī)取5只大鼠心臟標(biāo)本，沿心臟長軸自心尖向心底將組織切取5～6片約2 mm厚的切片，將切片置于1% TTC溶液內(nèi)，錫箔紙密封后放置于37 ℃恒溫箱內(nèi)避光染色20 min。染色完成后用4%多聚甲醛溶液固定1 h 后拍照，并用ImageJ 軟件計(jì)算心肌組織的梗死面積。梗死面積百分比（%）=梗死面積/切片面積×100%。1.4.4 血流動力學(xué) 再灌注24 h 后，腹腔注射肝素鈉注射液（0.01 mL/kg），20 min 后腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，暴露頸動脈插管，當(dāng)微型壓力（millar）導(dǎo)管進(jìn)入心室時(shí)，應(yīng)用多導(dǎo)電生理儀測量左心室舒張末壓（LVDP）、左心室收縮壓（LVSP）、左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率（+dp/dtmax、-dp/dtmax）。

1.4.5 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù) 每組隨機(jī)取5只大鼠，再灌注24 h 后取心臟標(biāo)本。打開胸腔，剝離大鼠心臟，切取心臟結(jié)扎部位2～3 mm 厚的心臟組織，放入4%的多聚甲醛溶液中常溫固定備用。石蠟包埋、切片、脫蠟、水化后，按照TUNEL 試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，在熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.4.6 血清CK、LDH 水平 再灌注24 h 后，大鼠腹主動脈取血，靜置2 h 后，3 000 r/min 離心15 min，取上清。按生化法相關(guān)試劑盒說明書步驟檢測CK、LDH水平。

1.4.7 血清SOD、MDA、H2O2活性 再灌注24 h 后，大鼠腹主動脈取血，靜置2 h 后，3 000 r/min 離心15 min，取上清。按ELISA 法檢測相關(guān)試劑盒說明書步驟檢測SOD、MDA、H2O2活性。

1.4.8 免疫組織化學(xué)法檢測心肌組織SIRT1、PGC-1α、Bcl-2、Bax蛋白陽性表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)法檢測大鼠心肌組織SIRT1、PGC-1α、Bcl-2、Bax 蛋白陽性表達(dá)。再灌注24 h 后取心肌組織石蠟切片脫水，抗原修復(fù)后3%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉30 min，加入SIRT1（1∶50）、PGC-1α（1∶50）、Bcl-2（1∶50）、Bax（1∶50），一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，中性樹脂封片，光鏡下觀察，以棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。使用ImageJ 軟件統(tǒng)計(jì)陽性表達(dá)的積分光密度（IOD）和陽性染色面積（Area），計(jì)算平均光密度（MOD）。MOD=IOD/Area。

1.4.9 Western blot 法檢測心肌組織SIRT1、PGC-1α、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)水平 采用Western blot 法檢測大鼠心肌組織SIRT1、PGC-1α、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)水平。取100 mg 左心室組織，加入組織細(xì)胞裂解液（RIPA），勻漿后離心收集上清提取組織蛋白。BCA 法測定組織蛋白濃度。各孔取10 μL的蛋白上樣，于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離（濃縮膠電壓70 V，30 min；分離膠120 V，1 h）。將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)移（300 mA，90 min）至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。加入5%脫脂奶粉在搖床上室溫封閉1 h。用Tris 鹽緩沖液（TBS）加入吐溫-20（TBST）洗膜3 次，每次10 min，分別加入SIRT1（1∶500）、PGC-1α（1∶500）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）。然后加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶5 000），室溫反應(yīng)1 h。再用TBST 洗膜3 次，每次10 min。按增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒說明顯影。采用ImageJ 軟件對蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示，符合正態(tài)分布者采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布者采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對大鼠心電圖的影響 與缺血前比較，模型組、益心方組和益心方+抑制劑組大鼠缺血30 min 后Ⅱ?qū)?lián)ST段均有不同程度抬高（≥0.1 mV），表明大鼠心肌缺血模型建立成功。各組大鼠再灌注后ST 段均有不同程度降低，表明再灌注模型建立成功。見圖1。

圖1 各組大鼠心電圖結(jié)果

2.2 對大鼠心功能的影響 與假手術(shù)組比較，模型組LVEF、LVFS 降低（P＜0.05）。與模型組比較，益心方組LVEF、LVFS 明顯增高（P＜0.05）。與益心方組比較，益心方+抑制劑組LVEF、LVFS 明顯降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠LVFS、LVEF比較

2.3 對大鼠心肌病理形態(tài)學(xué)及梗死面積的影響 光鏡下假手術(shù)組心肌組織形態(tài)正常，未見水腫、纖維化及炎性浸潤；模型組心肌組織整體結(jié)構(gòu)異常，心肌纖維排列紊亂及壞死明顯，心肌纖維可見脂肪變性，有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤；益心方組心肌組織形態(tài)基本正常，心肌纖維未見明顯腫脹，部分心肌纖維排列紊亂，少量炎癥細(xì)胞浸潤；益心方+抑制劑組心肌組織整體結(jié)構(gòu)異常，心肌纖維排列紊亂，心肌纖維明顯壞死，壞死區(qū)有較多膠原纖維異常增生，有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤。見圖3。

圖3 各組大鼠心肌組織病理變化（HE染色，×200）

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌梗死范圍增加（P＜0.05）。與模型組比較，益心方組大鼠心肌梗死范圍縮?。≒＜0.05）。與益心方組比較，益心方+抑制劑組大鼠心肌梗死范圍增大（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組大鼠心肌梗死面積比較

2.4 對大鼠血流動力學(xué)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組LVSP、+dp/dtmax 降低，LVDP、-dp/dtmax 升高（P＜0.05）。與模型組比較，益心方組LVSP、+dp/dtmax 升高，LVDP、-dp/dtmax降低（P＜0.05）。與益心方組比較，益心方+抑制劑組LVSP、+dp/dtmax降低，LVDP、-dp/dtmax升高（P＜0.05）。見圖5、表1。

表1 各組大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)比較（n=5，±s）

表1 各組大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)比較（n=5，±s）

注：LVSP為左心室收縮壓，LVDP為左心室舒張末壓，+dp/dtmax為左心室內(nèi)壓最大上升速率，-dp/dtmax為左心室內(nèi)壓最大下降速率。與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與益心方組比較，△P＜0.05。

-dp/dtmax/（mmHg·s-1）-809.94±21.70-365.15±32.52*-603.80±22.59-455.19±21.36△組別假手術(shù)組模型組益心方組益心方+抑制劑組LVSP/mmHg 115.46±10.44 74.94±6.32*96.57±8.30#77.76±6.80△LVDP/mmHg 5.87±0.73 13.37±1.01*9.07±0.62#11.51±0.88△+dp/dtmax/（mmHg·s-1）1 737.22±133.13 1 098.62±116.19*1 570.44±104.78#1 275.69±136.08△

圖5 各組大鼠血流動力學(xué)檢查結(jié)果

2.5 對大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響 與假手術(shù)組比較，模型組凋亡指數(shù)升高（P＜0.05）。與模型組比較，益心方組凋亡指數(shù)降低（P＜0.05）。與益心方組比較，益心方+抑制劑組凋亡指數(shù)升高（P＜0.05）。見圖6。

圖6 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（免疫熒光染色，×400）

2.6 對CK、LDH 水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組CK、LDH 水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，益心方組CK、LDH 水平降低（P＜0.05）。與益心方組比較，益心方+抑制劑組CK、LDH 水平升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清CK、LDH水平比較（n=9，±s）

表2 各組大鼠血清CK、LDH水平比較（n=9，±s）

注：CK 為肌酸激酶，LDH 為乳酸脫氫酶。與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與益心方組比較，△P＜0.05。

LDH/（U·L-1）371.95±28.23 557.96±31.00*427.31±25.72#544.50±40.03△組別假手術(shù)組模型組益心方組益心方+抑制劑組CK/（U·mL-1）152.81±5.78 196.28±5.29*161.60±4.39#197.26±4.22△

2.7 對SOD、MDA、H2O2活性的影響 與假手術(shù)組比較，模型組MDA、H2O2活性升高，SOD活性降低（P＜0.05）。與模型組比較，益心方組MDA、H2O2活性降低，SOD 活性升高（P＜0.05）；與益心方組比較，益心方+抑制劑組MDA、H2O2活性升高，SOD 活性降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠SOD、MDA、H2O2活性比較（n=9，±s）

表3 各組大鼠SOD、MDA、H2O2活性比較（n=9，±s）

注：SOD為超氧化物歧化酶，MDA為丙二醛，H2O2為過氧化氫。與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與益心方組比較，△P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組益心方組益心方+抑制劑組SOD/（U·mL-1）35.27±1.47 6.73±1.08*33.62±2.88#8.65±1.24△MDA/（nmol·L-1）3.59±0.71 20.98±1.89*4.47±0.18#19.51±2.05△H2O2/（mmol·L-1）26.58±1.02 59.34±3.01*27.05±2.68#50.28±2.46△

2.8 對大鼠SIRT1、PGC-1α、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)的影響 先采用免疫組織化學(xué)法檢測，結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織SIRT1、PGC-1α、Bcl-2 蛋白表達(dá)降低，Bax 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組比較，益心方組大鼠心肌組織SIRT1、PGC-1α、Bcl-2 蛋白表達(dá)升高，Bax 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與益心方組比較，益心方+抑制劑組大鼠SIRT1、PGC-1α、Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。

進(jìn)一步用Western blot法檢測，結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織SIRT1、PGC-1α、Bcl-2 蛋白表達(dá)降低，Bax 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組比較，益心方組大鼠心肌組織SIRT1、PGC-1α、Bcl-2 蛋白表達(dá)升高，Bax 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與益心方組比較，益心方+抑制劑組大鼠SIRT1、PGC-1α、Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。見圖7。

圖7 各組大鼠SIRT1、PGC-1α、Bcl-2、Bax表達(dá)比較

3 討論

MIRI是急性心肌梗死血管再通術(shù)后常見的病理現(xiàn)象，探討缺血再灌注損傷的防治措施及相應(yīng)的作用機(jī)制，對提高心血管疾病患者的預(yù)后和生存率具有重要的研究意義［12］。目前，急性心肌梗死的最佳、最有效的治療方法是快速、安全恢復(fù)缺血心肌血供。缺血心肌組織重新獲得血液供應(yīng)后，也會導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞凋亡等現(xiàn)象，進(jìn)而加重心肌的損傷。遺憾的是MIRI的機(jī)制尚未清晰，其機(jī)制與鈣離子超載、氧化應(yīng)激、鐵死亡、線粒體功能障礙及炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)［6，13-15］。

氧化應(yīng)激損傷是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的主要途徑之一。氧化應(yīng)激水平失衡后，活性氧增多，線粒體有氧代謝能力受損，進(jìn)而損傷心肌，造成心肌細(xì)胞凋亡。線粒體的功能穩(wěn)態(tài)對于維持氧化應(yīng)激平衡有重要作用，氧化應(yīng)激在心臟保護(hù)中也發(fā)揮著重要作用［16］。因此，抑制氧化應(yīng)激損傷、優(yōu)化線粒體功能、增強(qiáng)心肌細(xì)胞抗損傷能力是缺血心肌保護(hù)的新選擇。SIRT1/PGC-1α信號通路以特異的方式調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡和代謝，激活SIRT1，減輕氧化應(yīng)激損傷和減少細(xì)胞凋亡，SIRT1可能成為治療缺血性心臟病的潛在靶點(diǎn)［17-18］。PGC-1α是重要的轉(zhuǎn)錄共激活因子，也是抗細(xì)胞氧化應(yīng)激的有效防御劑。研究［19］發(fā)現(xiàn)，上調(diào)SIRT1 可減少氧化應(yīng)激損傷，激活SIRT1 使PGC-lα 賴氨酸殘基去乙?；瑔覲GC-lα 轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)下游核受體等蛋白分子的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝和抗氧化應(yīng)激能力，調(diào)節(jié)機(jī)體的生理及病理狀態(tài)。Bcl-2 家族是影響細(xì)胞凋亡的新基因，Bax 是凋亡的啟動子，Bcl-2 和Bax 決定了凋亡信號表達(dá)后細(xì)胞的存活或死亡［20］。

中醫(yī)學(xué)中沒有“心肌缺血再灌注損傷”病名的記載，根據(jù)臨床表現(xiàn)及病因病機(jī)，可將其歸屬于“胸痹”“真心痛”等范疇，病機(jī)以本虛標(biāo)實(shí)、心脈痹阻為關(guān)鍵，治宜益氣溫陽、活血化瘀［21-22］。在心肌缺血時(shí)期，心肌失于滋養(yǎng)，生化無力，心陽虛衰；再灌注后雖然血管再通，但機(jī)體心氣虧虛，統(tǒng)帥血液無力，血液運(yùn)行仍舊受阻。益心方中黃芪、桂枝益氣溫陽止痛；川芎、丹參、紅景天活血祛瘀通血脈，當(dāng)歸養(yǎng)血活血；香附行氣止痛、為氣中血藥，川芎為血中氣藥，二者合用活血且可調(diào)暢氣機(jī)［23-25］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，益心方預(yù)處理可降低MDA、H2O2活性，升高SOD 活性，可在一定程度上改善心肌缺血再灌注導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷，從而減輕模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡及縮小心肌梗死面積。本研究結(jié)果與Tian 等［26］的研究結(jié)果有較好的一致性。課題組通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)［27］，選擇了認(rèn)可度較高的SIRT1 抑制劑sirtinol。本研究結(jié)果證實(shí)其能夠逆轉(zhuǎn)益心方減輕MIRI大鼠心肌細(xì)胞凋亡的作用，進(jìn)一步說明益心方調(diào)控PGC-1α等蛋白表達(dá)、減輕心肌細(xì)胞凋亡與SIRT1相關(guān)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)益心方預(yù)處理可減少大鼠心肌缺血再灌注引起的氧化應(yīng)激損傷，提高細(xì)胞抗氧化能力，抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)心??；益心方可能通過激活SIRT1/PGC-1α 信號通路發(fā)揮對MIRI 的保護(hù)作用。此外，在本實(shí)驗(yàn)中益心方以臨床等效劑量給藥，暫未進(jìn)行量效研究，有待今后進(jìn)一步探究。