祁姚鑫瑞，郇鵬飛，范家翎，劉慶凱，滕苗苗，王之悅，李小茜，何建成

上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院（上海 201203）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是指由于心臟收縮和/或舒張功能障礙，心排血量不足以維持組織代謝需要的臨床綜合征，多發(fā)于各種器質(zhì)性心血管疾病的終末階段，發(fā)病率與病死率持續(xù)上升，為臨床重大疾病之一［1］。CHF 發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一是心肌重構(gòu)［2］。近年來較多的研究［3-4］表明，可溶性基質(zhì)裂解素2（sST2）和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CaN）參與本病的發(fā)生發(fā)展過程，與心肌重構(gòu)機(jī)制密切相關(guān)。目前CHF 的西醫(yī)治療主要以“金三角”（血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑/血管緊張素受體拮抗劑、β 受體阻滯劑、醛固酮受體拮抗劑）方案為基本策略［5］，但是存在遠(yuǎn)期療效不理想等問題。中醫(yī)藥對CHF 中后期癥狀的改善可發(fā)揮重要作用。目前較多研究［6-7］結(jié)果顯示，陽虛水泛證是CHF 中后期常見的中醫(yī)證候。課題組根據(jù)名老中醫(yī)長期的臨床實踐經(jīng)驗和中醫(yī)理論挖掘，應(yīng)用附仙強(qiáng)心方治療CHF陽虛水泛證，取得了較好的臨床療效。

本研究基于“方證相應(yīng)”理論，在病證結(jié)合原則的指導(dǎo)下，初步探究附仙強(qiáng)心方治療阿霉素誘導(dǎo)的CHF陽虛水泛證大鼠的作用機(jī)制，以及心肌重構(gòu)相關(guān)指標(biāo)血清sST2 和心肌組織CaN 蛋白的表達(dá)變化，為闡釋CHF 陽虛水泛證的生物學(xué)基礎(chǔ)、促進(jìn)CHF 治療中藥新藥的研發(fā)拓寬思路。

1 材料與方法

1.1.1 動物 雄性Wistar 大鼠，60 只，SPF 級，體質(zhì)量（250±20）g，購自浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司桐鄉(xiāng)分公司。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2020-0002。動物使用合格證號：SYXK（滬）2020-0009。實驗動物飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)室溫度20～25 ℃，濕度40%～70%，自然光照。本實驗方案經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批準(zhǔn)號：PZSHUTCM201023011）。

1.1.2 藥物與試劑 附仙強(qiáng)心方（制附片10 g、淫羊藿15 g、葶藶子20 g、川芎10 g、熟地黃15 g、五味子15 g、益母草15 g、豬苓15 g），由上海雷允上北區(qū)藥品零售有限公司提供。每劑藥物（115 g）加入蒸餾水1 000 mL，浸泡30 min；制附片先煎煮30 min，再將其余藥物加入，大火將水煮沸后，小火再煎煮30 min，將藥汁倒至容器中，殘余藥渣再次加入1 000 mL 蒸餾水，煎煮第2遍，將2 次藥汁合并，紗布過濾后濃縮藥汁。附仙強(qiáng)心方組低、中、高3個劑量組的藥液分別濃縮至160、80、40 mL，生藥含量分別為0.718 75、1.437 5、2.875 g/mL。

阿霉素鹽酸鹽（ADR），上海沃凱化學(xué)試劑有限公司（批號：XW253164091）；卡托普利片，上海衡山藥業(yè)有限公司（批號：200408）；血清總蛋白提取試劑量盒，上海信裕公司（批號：XY-E3138-1）；CaN 單克隆抗體，英國Abcam 公司（批號：A1063）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體，美國Proteintech 公司（批號：60004-1-1g）；大鼠sST2 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒，上海澤葉生物科技有限公司（批號：EDL202104246）。

1.1.3 主要儀器 多功能酶標(biāo)儀，美國BioTek 公司（型號：BioTek Synergy 2）；蛋白免疫印跡（Western blot）電泳儀及水平電泳槽，美國Bio-Rad 公司（型號：043BR41664）；低溫高速離心機(jī)，美國Beckman 公司（型號：B37913）；超聲細(xì)胞破碎儀，美國Sonics 公司（型號：VCX105）；分析天平，德國Sartorius 公司（型號：910324）。

1.2 分組 將60 只雄性Wistar 大鼠隨機(jī)分為6 組，分別為正常組、模型組、卡托普利組，以及附仙強(qiáng)心方低、中、高劑量組，每組10只。

1.3 造模與干預(yù)

1.3.1 CHF 模型的建立 除正常組外，其余50 只大鼠采用經(jīng)典腹腔注射ADR 致充血性心力衰竭的方法［8］，復(fù)制CHF 模型。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液將ADR 稀釋成2 mg·mL-1溶液后，按2.5 mL·kg-1進(jìn)行腹腔注射，根據(jù)大鼠的體質(zhì)量調(diào)整ADR 劑量，每周1 次，連續(xù)6周，累計總劑量為30 mg·kg-1。

1.3.2 干預(yù)方法 依據(jù)已有文獻(xiàn)［9］，卡托普利組予以卡托普利10 mg·kg·d-1灌胃；按人和動物間等效劑量換算方法，換算大鼠服用劑量作為中劑量，按1∶2∶4 設(shè)附仙強(qiáng)心方組低、中、高3 個劑量組，分別予附仙強(qiáng)心方5.75、11.5、23 g·kg·d-1灌胃。正常組與模型組均灌胃等量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液。每天1 次，連續(xù)灌胃6周。

利用綜合異常指數(shù)可以圈定出綜合異常的三級濃度分帶(圖3)，能夠明顯顯示出綜合異常濃集中心、面積大小等特征，極大的增強(qiáng)找礦工作部署的針對性，異常查證過程中避免工作部署的均勻性，減少工作量浪費等。

1.4 檢測指標(biāo)與方法

1.4.1 一般情況、體質(zhì)量及心臟指數(shù) 每次給藥后觀察并記錄大鼠的行為、活動、飲食、睡眠、毛色、糞便等變化情況，其間每周稱體質(zhì)量1 次并記錄。最后1 次給藥24 h 后取心臟，以預(yù)冷4 ℃的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液快速洗滌，濾紙吸干水分后，稱取全心質(zhì)量，計算心臟指數(shù)。心臟指數(shù)（%）=全心質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.4.2 心肌細(xì)胞病理 大鼠心臟稱質(zhì)量后用4%甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋，連續(xù)切片，蘇木精-伊紅（HE）染色法染色，鏡下觀察大鼠心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。

1.4.3 心臟彩超 最后1 次給藥24 h 后將大鼠麻醉后固定，將高頻探頭于左心室長軸最大直徑處標(biāo)記室間隔與左心室后壁收縮末、舒張末心內(nèi)膜位置，計算左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs），取3個心動周期求均值。

1.4.4 血清sST2 含量 最后1 次給藥24 h 后各組大鼠進(jìn)行腹主動脈采血，經(jīng)肝素鈉抗凝，全血靜置30 min后，離心（3 000 r/min、10 min），分離血清置于-80 ℃冰箱保存。采用ELISA 檢測血清sST2含量。操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。

1.4.5 心肌組織CaN 蛋白表達(dá) 大鼠心臟稱重后，取各組大鼠100 mg 心肌組織，采用Western blot 檢測CaN的表達(dá)水平。將大鼠心肌組織剪成小塊，加組織裂解液后于勻漿器中制成心臟勻漿，4 ℃條件下離心（3 000 r/min、15 min），獲得總蛋白提取液。加入上樣緩沖液后，100 ℃水浴10 min，獲得待檢測的上樣緩沖液。根據(jù)蛋白分子量選擇十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對蛋白進(jìn)行電泳分離，恒定電壓120 V，約70 min；轉(zhuǎn)膜，恒定電流200 mA，約90 min；5%脫脂牛奶封閉，室溫慢搖1 h，于4 ℃搖床中過夜孵育一抗（1∶1 000）；洗滌緩沖液（TBST）洗膜3次，每次10 min；二抗（1∶15 000）孵育1.5 h，TBST 洗膜3 次。洗膜后掃描成像，采用ImageJ軟件分析條帶光密度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，多重組間比較采用單因素方差分析及LSD 檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 與正常組比較，模型組和各治療組大鼠體質(zhì)量明顯減輕（P＜0.05）。模型組大鼠出現(xiàn)陽虛癥狀，表現(xiàn)為活動、進(jìn)食、飲水量減少，精神不振、多蜷縮、反應(yīng)遲鈍，被毛無光澤，口鼻暗淡，小便量多、大便稀薄等。與模型組比較，附仙強(qiáng)心方各劑量組和卡托普利組大鼠一般情況均有不同程度改善，其中附仙強(qiáng)心方高劑量組大鼠體質(zhì)量減輕較少，飲食量尚可，較為活潑，但未恢復(fù)至正常組情況。

與正常組比較，模型組大鼠心臟指數(shù)有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，各治療組大鼠心臟指數(shù)有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。實驗結(jié)束時，模型組、附仙強(qiáng)心方中劑量組和附仙強(qiáng)心方高劑量組各死亡1 只，卡托普利組死亡2 只，推測可能與麻醉藥物影響、ADR 副作用及藥物濃度較高等致胃腸脹氣有關(guān)。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量及心臟指數(shù)的比較（±s）

表1 各組大鼠體質(zhì)量及心臟指數(shù)的比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05。

組別正常組模型組附仙強(qiáng)心方低劑量組附仙強(qiáng)心方中劑量組附仙強(qiáng)心方高劑量組卡托普利組心臟指數(shù)/（mg·g-1）27.91±2.43 28.40±1.68 28.24±2.97 28.05±2.55 28.04±1.25 28.05±1.79 n 10 9 10 998體質(zhì)量/g 479.50±37.11 360.22±29.75*367.50±30.70*368.22±20.25*385.67±34.69*366.88±34.26*

2.2 心肌細(xì)胞病理情況 模型組較正常組心肌細(xì)胞核深染，可見局部空泡化，提示心肌細(xì)胞損傷；附仙強(qiáng)心方各劑量組與模型組比較，心肌細(xì)胞損傷有不同程度的減輕與改善。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌細(xì)胞病理情況（HE染色，×40）

2.3 對心功能的影響 與正常組比較，模型組LVEF顯著降低（P＜0.05），LVIDs、LVIDd均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，附仙強(qiáng)心方各劑量組LVEF均顯著升高（P＜0.05），LVIDs 均顯著降低（P＜0.05），附仙強(qiáng)心方低劑量組LVIDd 顯著降低（P＜0.05）。各治療組組間比較，附仙強(qiáng)心方各劑量組LVEF 均顯著高于卡托普利組（P＜0.05）；附仙強(qiáng)心方各劑量組LVIDd 與卡托普利組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；附仙強(qiáng)心方低劑量組LVIDs 顯著低于卡托普利組（P＜0.05），附仙強(qiáng)心方中、高劑量組LVIDs 與卡托普利組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；附仙強(qiáng)心方各劑量組之間LVEF、LVIDs、LVIDd差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠心功能的比較（±s）

表2 各組大鼠心功能的比較（±s）

注：LVEF 為左心室射血分?jǐn)?shù)，LVIDd 為左心室舒張末期內(nèi)徑，LVIDs為左心室收縮末期內(nèi)徑。與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與卡托普利組比較，△P＜0.05。

LVIDs/mm 3.56±0.91 5.56±0.09*2.94±0.04#△3.59±0.56#3.44±0.23#4.41±0.40組別正常組模型組附仙強(qiáng)心方低劑量組附仙強(qiáng)心方中劑量組附仙強(qiáng)心方高劑量組卡托普利組n LVIDd/mm 6.08±1.14 7.01±0.04*6.24±0.05#7.49±0.81 7.36±0.42 7.10±0.39 10 9 10 998 LVEF/%88.86±4.45 49.29±1.01*89.84±2.60#△89.35±2.37#△88.63±3.97#△76.02±2.33#

2.4 對血清sST2 含量的影響 與正常組比較，模型組血清sST2 含量顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，附仙強(qiáng)心方各劑量組sST2 含量均顯著降低（P＜0.05）。各治療組組間比較，附仙強(qiáng)心方低、中劑量組sST2含量均顯著高于卡托普利組（P＜0.05），附仙強(qiáng)心方高劑量組sST2 含量與卡托普利組接近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；附仙強(qiáng)心方高劑量組sST2 含量顯著低于附仙強(qiáng)心方低劑量組（P＜0.05），其余各劑量組之間sST2含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清sST2含量比較（±s，ng·L-1）

表3 各組大鼠血清sST2含量比較（±s，ng·L-1）

注：sST2 為可溶性基質(zhì)裂解素2。與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與卡托普利組比較，△P＜0.05；與附仙強(qiáng)心方低劑量組比較，▽P＜0.05。

sST2 2 704.01±498.39 4 216.11±435.39*3 706.44±294.52#△3 356.56±381.43#△2 872.81±347.58#▽2 783.42±420.75組別正常組模型組附仙強(qiáng)心方低劑量組附仙強(qiáng)心方中劑量組附仙強(qiáng)心方高劑量組卡托普利組10 9 10 n 998

2.5 對心肌組織CaN 表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組心肌組織CaN 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，附仙強(qiáng)心方各劑量組和卡托普利組CaN 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。各治療組組間比較，附仙強(qiáng)心方各劑量組CaN 表達(dá)與卡托普利組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；附仙強(qiáng)心方高劑量組CaN 表達(dá)顯著低于附仙強(qiáng)心方低劑量組（P＜0.05），其余各劑量組之間CaN含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織CaN表達(dá)比較

3 討論

CHF 是由多種病因作用引起器質(zhì)性心血管病變的一類綜合征，為各種心血管疾病的最終發(fā)展階段，發(fā)病率高，病情復(fù)雜且遷延難愈，是臨床上常見的危重癥［10］。CHF 為臨床重大疾病之一，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，心肌重構(gòu)在CHF的發(fā)展過程中起到了不可忽視的作用。

中醫(yī)藥在CHF 的防治方面可發(fā)揮重要作用。根據(jù)臨床表現(xiàn)，CHF 可歸屬于中醫(yī)學(xué)“心悸”“喘證”“水腫”等范疇。課題組前期通過現(xiàn)代文獻(xiàn)挖掘與較大樣本的臨床流行病學(xué)研究［6］發(fā)現(xiàn)，CHF 的中醫(yī)證候分布呈動態(tài)變化趨勢，早期以氣虛血瘀證、氣陰兩虛證為主，中后期以陽虛水泛證為多見。

在長期臨床實踐經(jīng)驗和中醫(yī)理論挖掘的基礎(chǔ)上，課題組臨床應(yīng)用附仙強(qiáng)心方治療CHF陽虛水泛證取得了較為滿意的效果［11］。附仙強(qiáng)心方化裁于真武湯，具有溫陽利水的作用。方中制附片強(qiáng)心溫陽，淫羊藿溫腎助陽，葶藶子瀉肺行水、利水消腫，川芎活血行氣，熟地黃滋補(bǔ)肝腎陰血兼制附子燥熱之性，五味子益氣生津、補(bǔ)腎寧心，益母草活血利水，豬苓利水滲濕且不傷陽氣。諸藥合用，共奏溫陽利水、益腎寧心之功。附子中的烏頭堿類化合物有明顯的強(qiáng)心作用，低劑量時能增強(qiáng)心肌收縮力、加快心率、增加心排血量，其機(jī)制與興奮α 和β 受體、激活鈣調(diào)磷酸酶有關(guān)，較大劑量時附子總生物堿和附子多糖可擴(kuò)張冠狀動脈，保護(hù)缺血心?。?2-13］；淫羊藿中的淫羊藿總苷能增加心排出量和心搏出量，減少心肌耗氧量，淫羊藿總黃酮能降低冠脈阻力和總外周阻力，逆轉(zhuǎn)CHF的心肌重構(gòu)表現(xiàn)［14］；葶藶子水提取物有顯著的強(qiáng)心和增加冠脈流量作用，且不增加心肌耗氧量［15］；川芎中的川芎嗪能抑制大鼠壓力超負(fù)荷導(dǎo)致的心肌肥厚，并同步提高LVEF，保護(hù)心肌［16］；益母草中的益母草堿可減少血清腦鈉肽（BNP）、血管緊張素Ⅱ含量，抑制CHF大鼠心肌重構(gòu)［17］；豬苓可通過抑制腎臟水通道蛋白2（AQP2）表達(dá)，增加排尿，從而減少心力衰竭大鼠的水鈉潴留［18］。

病證結(jié)合動物模型的建立是中藥復(fù)方研究的重要組成部分。在CHF 疾病模型的評價中，心功能的檢測尤為重要，其中LVEF反映血流動力學(xué)改變情況及心功能損傷程度，LVIDd、 LVIDs 反映心臟收縮舒張功能與左心室容量負(fù)荷等［19］。有研究［20］認(rèn)為，LVEF下降20%～30%為造模成功的標(biāo)志。本課題組前期研究［21-22］中發(fā)現(xiàn)，在“以方測證”“方證相應(yīng)”等理論指導(dǎo)下制備的病證結(jié)合動物模型更加貼近實際，目前多從宏觀體征、客觀指標(biāo)、藥物反證等方面，采用綜合判斷的方法進(jìn)行模型動物證候?qū)傩缘呐卸?。本研究采用腹腔注射ADR（累積總量30 mg·kg-1）復(fù)制的CHF 大鼠模型，大鼠出現(xiàn)蜷縮、口鼻暗淡，小便量多、大便稀薄等心腎陽虛癥狀；病理結(jié)果可見，模型組心肌細(xì)胞核深染，可見局部空泡化，提示心肌細(xì)胞損傷；心超結(jié)果顯示，模型組LVEF明顯降低，LVIDd、LVIDs 均升高，提示心功能改變；給予溫陽利水的附仙強(qiáng)心方干預(yù)后，大鼠的相關(guān)癥狀與上述指標(biāo)均有改善。綜合上述多種方法可判定，腹腔注射ADR制備的CHF大鼠模型為CHF陽虛水泛證模型。

心肌重構(gòu)是由于心肌容量或壓力負(fù)荷過重、心肌損傷等原因，導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)與功能改變，出現(xiàn)心肌收縮舒張功能減退、心肌纖維化及心肌細(xì)胞凋亡等一系列病理生理變化［23］。ADR 與心肌具有較強(qiáng)的親和性，可直接損傷心臟結(jié)構(gòu)和功能，多次、累積用藥可引起心肌細(xì)胞損傷、壞死、凋亡等，導(dǎo)致心肌重構(gòu)，誘發(fā)CHF。ADR制備CHF動物模型操作簡便、成功率較高，常用于藥物的療效評價［24-25］。應(yīng)用ADR 復(fù)制CHF動物模型所用的劑量與其造成心肌損傷的類型與程度密切相關(guān)，以心臟指數(shù)為例，不同的給藥劑量與時間會導(dǎo)致心臟指數(shù)升高或降低［26-27］，因此后續(xù)研究中對ADR 的劑量及注射時間需進(jìn)行更多的實驗對比與驗證。

近年來的研究結(jié)果表明，sST2、CaN 在CHF 的診斷與心肌重構(gòu)的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。sST2 參與心肌纖維化與心肌重構(gòu)過程，其表達(dá)水平和CHF 的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，且能更好地預(yù)測CHF 患者的預(yù)后［28］；CaN 與心肌肥大有關(guān)，CaN 之A 亞基β 亞型（CnAβ）為其主要調(diào)控心肌肥大的功能結(jié)構(gòu)，且能調(diào)控心肌細(xì)胞多種離子通道的重構(gòu)［29］。臨床研究［30］亦發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，CHF 陽虛水泛證患者不同樣本（血清、尿液等）中sST2與CaN存在差異表達(dá)。

sST2是白介素-1（IL-1）受體家族成員之一，當(dāng)心肌和心肌成纖維細(xì)胞遭受損失時，其水平明顯升高，標(biāo)志著發(fā)生心臟結(jié)構(gòu)性病變的風(fēng)險明顯提高。sST2 亦是預(yù)測急性失代償性心力衰竭、CHF、心肌梗死患者中短期病死率的獨立指標(biāo)，幾乎不受年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、種族及腎功能的影響［31］。在CHF 的發(fā)生發(fā)展過程中，心肌壓力負(fù)荷過重導(dǎo)致的心肌細(xì)胞肥大、心肌纖維化和心肌重構(gòu)是主要的病理生理學(xué)變化。當(dāng)心肌細(xì)胞受到機(jī)械牽拉時，會產(chǎn)生大量的sST2，其作為“誘騙受體”，會競爭性地結(jié)合白介素-33（IL-33），從而抑制IL-33/ST2L 信號通路，IL-33 無法發(fā)揮抗心肌肥大作用，其心肌保護(hù)作用降低，進(jìn)而發(fā)生心肌重構(gòu)和功能障礙［32］。

CaN 是以Ca2+為信號因子，經(jīng)過鈣調(diào)素活化的蛋白磷酸酶，廣泛分布于心肌、骨骼肌、T 淋巴細(xì)胞中，尤其在心臟中高表達(dá)［33］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CaN 在心肌重構(gòu)中具有重要作用。心肌細(xì)胞中鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ激活在CHF 和心肌重構(gòu)中發(fā)揮重要作用［34］，其激活引起的鈣超載是ADR 誘發(fā)心肌損傷的重要機(jī)制［35］。當(dāng)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加時可激活CaN，活化的CaN使T細(xì)胞核因子（NFAT）去磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核，NFAT與鋅指轉(zhuǎn)錄因子（GATA）結(jié)合，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中， 進(jìn)而活化多個肥厚性標(biāo)記基因，導(dǎo)致心臟基因表達(dá)重新編程為肥大性程序的一部分［36-37］，最終導(dǎo)致CHF的發(fā)生。在心肌重構(gòu)的進(jìn)展過程中，CaN 作為起始信號，其蛋白表達(dá)水平的改變遠(yuǎn)早于心肌重構(gòu)的發(fā)生，sST2 是心肌纖維化等心肌結(jié)構(gòu)改變的標(biāo)志物，而探究CHF及中醫(yī)證候與這兩個指標(biāo)關(guān)聯(lián)的研究較少。

對于附仙強(qiáng)心方的藥效發(fā)揮機(jī)制，本研究發(fā)現(xiàn)，給予不同劑量的附仙強(qiáng)心方干預(yù)后，與模型組比較，附仙強(qiáng)心方低、中、高劑量組大鼠整體情況改善，心肌細(xì)胞損傷有不同程度的減輕與改善，LVEF 顯著升高，LVIDd、LVIDs 均顯著降低，治療組LVEF 的變化趨勢與其他研究文獻(xiàn)［38］結(jié)果相近。我們進(jìn)一步對血清sST2與心肌組織CaN 進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)與正常組比較，模型組大鼠sST2、CaN 表達(dá)水平明顯升高，而附仙強(qiáng)心方各劑量組大鼠sST2、CaN 表達(dá)水平明顯下降，且以高劑量組更為明顯?？梢姼较蓮?qiáng)心方可以通過下調(diào)sST2 水平與CaN蛋白表達(dá)，發(fā)揮治療CHF陽虛水泛證的作用。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，附仙強(qiáng)心方可有效保護(hù)CHF大鼠心肌，改善心功能，延緩心肌重構(gòu)進(jìn)程，其機(jī)制可能與抑制血清sST2 和心肌組織CaN 的表達(dá)有關(guān)。CaN 和sST2與CHF陽虛水泛證的生物學(xué)變化密切相關(guān)。

在未來研究中，我們需要重復(fù)驗證、繼續(xù)優(yōu)化完善病證結(jié)合動物模型的制備方法，對于CHF 陽虛水泛證相關(guān)的細(xì)胞因子等內(nèi)涵研究亦需深入探索，比如檢測心肌細(xì)胞Ca2+濃度、細(xì)胞因子及信號通路可能的交叉網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)，以及中藥復(fù)方在改善心功能與心肌重構(gòu)方面存在的量效關(guān)系等，仍需進(jìn)一步規(guī)范客觀的體內(nèi)、體外實驗和臨床研究加以佐證與探究。